Luận văn Xử lý vi khuẩn lao trong nƣớc sử dụng hạt nano gắn enzyme

ài tiểu bang ở Mỹ là sử dụng khí ôzôn. Khí ôzon được tạo ra bằng cách sử dụng nguồn điện cao thế tách ôxy phân tử (O2) thành ôxy nguyên tử (O), sau đó lại cho ôxy nguyên tử tiếp xúc với oxi phân tử tạo thành ôzôn (O3). Khí ôzon phải được tạo ra ngay tại các điểm xử lý nước thải do tính chất không bền và nhanh chóng phân giải về dạng oxy phân tử. Ôzôn là một chất oxy hóa mạnh, có khả năng khử trùng cao. Ôzôn tác động trực tiếp, oxi hóa thành tế bào vi khuẩn, đồng thời gây thiệt hại lên các thành phần của Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 13 axit nucleic (purin và pyrimidin). Cơ chế chủ yếu của quá trình này xảy ra do khi ôzôn phân giải trong nước sẽ sinh ra các nhóm hydrogen peroxy (HO2) và hydroxyl (OH). Hiệu quả của quá trình khử trùng phụ thuộc vào các yếu tố như sự nhạy cảm của vi khuẩn, thời gian tiếp xúc và nồng độ ôzôn. Phương pháp sử dụng ôzôn có một số ưu điểm như sử dụng ôzon khử trùng cho hiệu quả tốt hơn clo, thời gian khử trùng ngắn (10-30 phút) đồng thời không tạo thành dư lượng hóa chất độc hại sau khử trùng. Mặc dù vậy phương pháp sử dụng ôzon vẫn không được sử dụng rộng rãi do việc lắp đặt hệ thống phức tạp. Do đặc tính oxy hóa cao gây ăn mòn đường ống dẫn nên chi phí bảo trì hệ thống khử trùng ôzon thường cao [16]. 1.1.3.3. Phƣơng pháp sinh học Các quá trình sinh học được ứng dụng trong xử lý nước thải hiện nay chủ yếu là để xử lý các chất thải hữu cơ, các hợp chất của nitơ và phốt pho. Sự tồn tại của các chất thải hữu cơ làm giảm độ hòa tan của oxi trong nước gây hại tới đời sống của các sinh vật thủy sinh do vậy cần phải được xử lý trước khi thải ra ngoài môi trường. Phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng vi sinh vật hiếu khí để loại bỏ các tạp chất hữu cơ này trong nước thải. Các vi sinh vật hiếu khí được nuôi và tạo thành màng trên các giá thể có trong các bồn sinh học hay các bể chứa nước thải. Các vi sinh vật này sẽ phân hủy các tạp chất hữu cơ bằng cách tiết ra enzyme phân hủy giúp loại bỏ các tạp chất này ra khỏi nước thải. Một nghiên cứu gần đây nhất được thực hiện tại Việt Nam cho thấy sự hiệu quả của vi khuẩn khi tạo thành màng biofilm có khả năng phân hủy một phổ rộng các chất hữu cơ bao gồm L-arginine, gelatin, D-glucose, D- mannose v.v. Nghiên cứu này mở ra một triển vọng ứng dụng các loại vi sinh vật sẵn có trong tự nhiên trong quá trình xử lý nước thải [1]. Tuy được ứng dụng hết sức hiệu quả nhưng cho đến nay phương pháp sinh học vẫn chưa được sử dụng nhiều để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh có trong nước thải.Một phương pháp sinh học từng được nghiên cứu trước đây là sử dụng vi khuẩn hiếu khí gram âm Bdellovibrio bacteriovorus có khả năng tồn tại trong nước thải [17]. Vi Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 14 khuẩn này bám vào màng tế bào của các vi khuẩn gram âm tiết ra enzyme phân hủy màng tế bào, đi qua màng plasma rồi sửa chữa lại màng tế bào của vật chủ. Sau đó Bdellovibrio bacteriovorus sẽ tiết ra các enzyme thủy phân vào trong tế bào chất của vật chủ nhằm sản xuất các chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng. Khi đã hấp thu đầy dủ dinh dưỡng từ tế bào chất, vi khuẩn bắt đầu tiến hành phân chia rồi cuối cùng phá vỡ tế bào vật chủ và thoát ra ngoài [18] Chu trình này được thể hiện như Hình 1.2. Hình 1.2: Chu trình phát triển của Bdellovibrio bacteriovorus Phương pháp sinh học này có những ưu điểm như không phải xây dựng hệ thống xử lý phức tạp, không sử dụng hóa chất độc hại. Tuy vậy nhược điểm làm giảm tính ứng dụng của phương pháp là Bdellovibrio bacteriovorus chỉ có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram âm.[19,20] Nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển xa hơn tiến tới tiêu diệt các tác nhân gây bệnh trước tiên là vi khuẩn lao sau khi bắt giữ bằng cách bổ sung các phức hệ ly giải có gắn enzyme. Đáng chú ý là trong năm 2015, nhóm nghiên cứu Chử Lương Luân và các cộng sự đã tạo được phức hệ hạt từ kháng thể kháng lao. Như vậy theo nguyên lý này những phức hệ tương tự có thể được tổng hợp. Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 15 lao vì các lý do bệnh lý học và dịch tễ học của bệnh lao và bởi bản thân vi khuẩn lao là một vi khuẩn nguy hiểm có khả năng lây nhiễm và khả năng sống sót cao ngoài môi trường. 1.2. Bệnh lao Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm chết người phổ biến gây ra bởi các chủng khác nhau của mycobacteria, thường là Mycobacterium tuberculosis. Bệnh lao đã có mặt trong xã hội loài người từ thời cổ đại. Trong suốt lịch sử, bệnh lao đã được biết đến dưới nhiều tên gọi khác nhau như: bệnh ho lao, bệnh Pott, và bệnh dịch trắng. Bệnh lao đạt tỷ lệ dịch bệnh cao nhất ở châu Âu và Bắc Mỹ trong thế kỷ 18 và 19. 1.2.1. Bệnh lý học Bệnh lao phổ biến nhất là lao phổi, tuy nhiên trong 15-20% các trường hợp nhiễm lao, nhiễm trùng lây lan ra bên ngoài cơ quan hô hấp, gây ra bệnh lao trên các phần khác của cơ thể [21]. Những trường hợp mắc bệnh như vậy được gọi chung là "bệnh lao ngoài phổi". Lao ngoài phổi xảy ra phổ biến hơn ở những người suy giảm miễn dịch và trẻ em. Trong những người có HIV, điều này xảy ra trong hơn 50% các trường hợp. Bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS, với 90% bệnh nhân HIV/AIDS sẽ tử vong trong vòng vài tháng bị đồng nhiễm lao nếu không được chữa trị kịp thời [22]. Lao ngoài phổi bao gồm một số trường hợp như lao màng não, lao bạch huyết (trong bệnh tràng nhạc cổ ), lao niệu sinh dục, và lao xương và khớp (bệnh của cột sống của Pott). Khi đã vào tới phổi, vi khuẩn bị đại thực bào tấn công, và các nốt nhỏ được hình thành thông qua phản ứng quá mẫn gọi là nốt sần. Quá trình bệnh thường chỉ dừng lại ở giai đoạn này, nhưng vi khuẩn thường vẫn tồn tại trong các thể thực bào của đại thực bào (macrophage phagosome). Kháng lại quá trình oxy hóa, ức chế sự thực bào của lysosome, và ức chế sự khuếch tán của các enzyme trong lysosome là một số trong những cơ chế có thể giải thích sự tồn tại của vi khuẩn lao bên trong đại thực bào. Trong thời gian này các nốt sần có thể thay đổi thành dạng nhầy được gọi là một tổn thương caseous. Nếu tổn thương được phân loại, chúng được gọi là phức hợp Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 16 Ghon, phức hệ này có thể quan sát được dễ dàng khi chụp x-quang phổi. Thường thì các tổn thương chính được gọi là nốt sần Ghon hoặc điểm tập trung Ghon. Các tổn thương chính thường nằm ở phần trên của thùy dưới hoặc phần dưới của thùy trên [23]. Những người tiếp xúc thường xuyên với bệnh nhân lao trong thời gian dài có khả năng lây nhiễm cao hơn 22% so với những người khác [24]. Một người mắc lao đã phát triển thành bệnh nhưng không được điều trị có thể lây cho 10-15 người (có thể nhiều hơn) mỗi năm. Sự lây nhiễm chỉ xảy ra ở những người bị nhiễm lao hoạt động đã phát triển thành bệnh (không phải lao tiềm ẩn), phụ thuộc vào mức độ nhiễm lao, phơi nhiễm với môi trường, thời gian tiếp xúc, và độc lực của các chủng vi khuẩn. Thông thường phải mất 3-4 tuần trước khi những người mới nhiễm lao có thể lây truyền bệnh cho người khác [25]. Chuỗi lây truyền có thể được ngừng lại bằng cách cách ly các bệnh nhân trong giai đoạn hoạt động của bệnh và áp dụng điều trị hiệu quả. 1.2.2. Dịch tễ học Ngày nay, bệnh lao là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất, ảnh hưởng đến khoảng 2- 3 tỷ người (tức là 1/3 dân số thế giới trong năm 2015), với 10 triệu trường hợp mới được chẩn đoán mỗi năm. Số lượng tuyệt đối của các trường hợp bệnh lao đã được giảm từ năm 2006, và các trường hợp mắc mới đã giảm kể từ năm 2002. Tuy nhiên sự phân bố của bệnh lao không thống nhất trên toàn cầu; khoảng 80% dân số ở nhiều nước châu Á và châu Phi xét nghiệm dương tính trong các xét nghiệm tuberculin trong khi đó chỉ có 5-10% dân số Hoa Kỳ cho kết quả tương tự [2]. Lao là bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao thứ hai trên thế giới gây ra 2 triệu ca tử vong trong năm 2010, chủ yếu ở các nước đang phát triển. Theo báo cáo WHO năm 2015 Việt Nam xếp thứ 14 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao nhất trên thế giới, với khảng 104.000 ca mỗi năm và ước tính khoảng 56% dân số nước ta đã bị nhiễm vi khuẩn lao [4]. Vi khuẩn lao có thể nhập vào cơ thể nếu chúng ta ăn thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn. Vi khuẩn cũng lây truyền qua các vết cắt hoặc vết trầy xước trên da hoặc niêm mạc mắt và cổ họng và từ mẹ sang thai nhi thông qua các tĩnh mạch rốn gây bệnh lao bẩm Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 17 sinh. Tuy nhiên, thông thường, lao lây truyền qua đường hô hấp (hình 1.3). Khi những người mắc lao phổi hắt hơi, nói chuyện, hay khạc nhổ, họ phát tán ra các giọt đường kính 0,5-5,0 mm, và trong không khí bình thường chúng có thể được giữ trong khoảng thời gian kéo dài và lây lan cho những người khỏe mạnh trong cùng một phòng hoặc trong cùng tòa nhà. Một cái hắt hơi duy nhất có thể giải phóng tới 40.000 giọt, mỗi giọt đều có thể lây truyền bệnh. Người khỏe mạnh hít vào ít hơn 10 vi khuẩn cũng có khả năng bị nhiễm bệnh [26]. Hình 1.3: Con đường lây nhiễm chính bệnh lao Nguồn http: //www.slideshare.net/Hamdi0Alturkey/pulmonary-tuberculosis-34642377 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao Một yếu tố quan trọng góp phần trong sự lây lan của bệnh lao là khả năng tồn tại của vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn lao có thể chịu được các chất khử trùng yếu và có thể tồn tại trong trạng thái khô trong nhiều tuần. Một nghiên cứu mới đây được thực hiện ở Michigan Hoa Kỳ cho thấy vi khuẩn lao có khả năng sống sót cao trong môi trường. Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lên đến 88 ngày trong đất (74 ngày trong một nghiên cứu trước đó) , 58 ngày trong nước và cỏ khô, và 43 ngày trên ngô [27]. Tuy Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 18 vậy khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong môi trường ngắn hơn đáng kể trong mùa xuân / hè, bởi đây là thời gian có nhiệt độ trung bình hàng ngày cao nhất trong thời gian 12 tháng của năm. Các nghiên cứu chứng minh rằng vi khuẩn lao tồn tại đủ lâu trong môi trường để lây nhiễm và truyền bệnh sang người và động vật. 1.3. Vi khuẩn lao 1.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao Đã hơn 140 năm kể từ khi chủng Mycobacterium đầu tiên được phân lập bởi Hansen (1874). Đó là vi khuẩn bệnh phong, Mycobacterium leprae, cho đến tận ngày nay vi khuẩn này vẫn còn chống lại tất cả nỗ lực để nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB) được phát hiện tám năm sau đó vào năm 1882 bởi Robert Koch, người sau đó đã nhận được giải thưởng Nobel về sinh lý học hay y học cho khám phá này vào năm 1905; để tưởng nhớ, vi khuẩn lao còn được gọi là "vi khuẩn Koch". [28] Phát hiện Kock đã được khẳng định bởi phương pháp nhuộm hiệu quả hơn của Ehrlich (1887) và Ziehl-Neelsen (1883). Dưới kính hiển vi trường sáng, vi khuẩn lao thường xuất hiện có dạng que thẳng hoặc hơi cong. Dựa theo các điều kiện tăng trưởng và thời gian nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi kích thước và hình dạng từ bầu dục đến dạng gậy dài. Các kích thước của vi khuẩn đã được báo cáo là 1-10 µm chiều dài (thường là 3-5 µm), và 0,2- 0,6 µm chiều rộng. Khả năng biến đổi hình thái của vi khuẩn đã được đề xuất bởi một vài nghiên cứu như Malassez và Vignal (1883), Lubarsch (1899), Fischel (1893), và Vera và Rettger (1939) tuy nhiên vì những giới hạn về kỹ thuật khi đó vẫn diễn ra nhiều tranh cãi về hình dạng vi khuẩn. Ngày nay với những tiến bộ trong kỹ thuật hiển vi bao gồm kính hiển vi điện tử quét (SEM), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), phần lớn các nhà nghiên cứu đã đồng ý rằng vi khuẩn lao biểu hiện nhiều hình dạng trong điều kiện khác nhau [29]. Vi khuẩn trở nên ngắn hơn ở các môi trường nuối cấy cũ lâu ngày, dạng sợi bên trong đại thực bào và có hình trứng trong điều kiện thiếu dinh dưỡng. Tuy nhiên, hình dạng que vẫn là hình thái cổ điển cơ bản của vi khuẩn lao (Hình 1.4). Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 19 Hình 1.4: Hình ảnh SEM của vi khuẩn lao (MTB) (Nguồn: textbookofbacteriology.net) Vi khuẩn lao cần oxy để phát triển; phân chia mỗi 15-20 giờ, tốc độ này là rất chậm so với các vi khuẩn khác có thời gian phân chia tính bằng phút (Escherichia coli có thể chia khoảng mỗi 20 phút). Thành tế bào vi khuẩn lao có giàu chất béo (ví dụ, acid mycolic), nhờ có thành tế bào đặc biệt mà vi khuẩn lao có khả năng kháng lại một số loại kháng sinh thông thường đồng thời đây cũng là yếu tố độc lực chính của vi khuẩn [30]. Do hàm lượng lipid cao thành tế bào của vi khuẩn lao cũng không bắt màu với các thuốc nhuộm thông thường, vậy nên không phân biệt là Gram dương hay Gram âm; Do đó, để quan sát vi khuẩn phải tiến hành nhuộm Ziehl-Neelsen hoặc nhuộm kháng axit. Trong khi mycobacteria dường như không phù hợp với những loại vi khuẩn Gram dương từ một quan điểm thực nghiệm (tức là, chúng không giữ lại màu tím tinh thể), chúng vẫn được phân loại như các vi khuẩn kháng axit Gram dương (AFB) do chúng thiếu một lớp màng tế bào bên ngoài. Trong những năm gần đây các chủng lao kháng đa thuốc đang phát triển và lây lan. Một chủng lao đa kháng thuốc được định nghĩa là chủng kháng lại cả 2 lọai kháng sinh hàng một isoniazid và rifampin, có thể có hoặc không kháng lại các loại thuốc khác. Theo ước tính của WHO năm 2011 trên toàn thế giới có khoảng 310.000 ca mắc Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 20 lao đa kháng thuốc. Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng lao đa kháng thuốc càng làm phức tạp tình hình bệnh lao trên thế giới [31]. 1.3.2. Hệ gen vi khuẩn lao Có rất nhiều chủng vi khuẩn lao trong đó các bộ gen của chủng H37Rv được công bố vào năm 1998 [32]. Kích thước là 4 triệu cặp base, với 3.959 gen; các chức năng đặc trưng của các gen này (40%) đã được nghiên cứu, chức năng giả thuyết đã được mặc nhiên công nhận cho 44%. Bộ gen chứa 250 gen liên quan đến sự chuyển hóa acid béo, 39 trong số này tham gia vào quá trình chuyển hóa polyketide tạo lớp sáp. Số lượng lớn như vậy của các gen được bảo tồn cho thấy tầm quan trọng tiến hóa của áo sáp đối với khả năng tồn tại của vi khuẩn lao. Hình 1.5: Hệ gen vi khuẩn lao (Nguồn: Natural.com) Bản đồ dạng tròn của nhiễm sắc thể Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv. Vòng ngoài cùng chỉ ra tỉ lệ theo Mb, 0 là vị trí khởi đầu sao chép. Vòng đầu tiên sau vòng ngoài cùng chỉ ra vị trí của các gene mã cho ARN (tARN màu xanh dương, những loại khác màu hồng), vùng lặp trực tiếp (ô vuông hồng). Vòng tiếp theo chỉ ra các trình tự mã hóa (thuận chiều kim đồng hồ, xanh đậm; ngược chiều kim đồng hồ, xanh nhạt), vòng thứ ba chỉ ra các đoạn ADN lặp (trình tự lặp IS, màu cam; 13E12, họ REP, hồng đậm; prophage, xanh dương. Vòng thứ tư chỉ ra vị trí của các thành viên trong họ PPE (xanh lá cây). Vòng thứ năm là họ PE (tím, trừ PGRS). Vòng thứ sáu vị trí của PGRS (đỏ đậm) . Biểu đồ trong cùng chỉ ra hàm lượng G+C, 65% màu đỏ. Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 21 Nhờ có thành tế bào kỵ nước hoạt động như một rào cản chọn lọc thẩm thấu vi khuẩn lao có thể kháng lại nhiều loại thuốc. Tuy nhiên, có rất nhiều yếu tố quyết định khả năng kháng thuốc được mã hóa trong hệ gen của MTB, bao gồm các enzyme thủy phân, các enzyme ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc: β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase. Trong hệ gen của vi khuẩn lao còn có chứa các đoạn trình tự đặc trưng được sử dụng trong một số xét nghiệm chẩn đoán lao. Trong đó, được sử dụng rộng rãi nhất là đoạn trình tự chèn 6110 (IS6110) dài 249bp. Số bản sao của đoạn IS6110 có thể lên tới 25 trong genome của MTB, tuy nhiên cũng có một số chủng chỉ có 1 bản sao [33,34]. Bằng cách nhân lên đoạn trình tự này trong phản ứng PCR đặc hiệu, người ta có thể phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn lao trong mẫu. 1.4. Hạt nano và ứng dụng Công nghệ nano là ngành khoa học về các vật chất ở tỷ lệ 1 phần tỷ của một mét (10 -9 m = 1 nm), và cũng là nghiên cứu về thao tác các vật chất ở quy mô nguyên tử và phân tử. Nhìn chung, kích thước của một hạt nano nằm trong phạm vi từ 1 đến 100 nm. Hạt nano kim loại có tính chất vật lý và hóa học khác hơn rất nhiều so với kim loại ban đầu (ví dụ: điểm nóng chảy thấp hơn, diện tích bề mặt lớn, tính chất quang học khác, có độ bền cơ học, và có từ tính), các tính chất này có thể được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. 1.4.1. Các tính chất của hạt nano Tính chất quang học là một tính chất đặc biệt của hạt nano, xét về mặt khoa học sở dĩ hạt nano có tính chất này bới chúng có kích thước đủ nhỏ để có thể ảnh hưởng tới các electron của chúng và tạo ra các hiệu ứng lượng tử. Các điện tử tự do trong kim loại sẽ dao động dưới tác động của từ trường bên ngoài trong đó bao gồm cả tác động của các photon ánh sáng. Các dao động này thông thường sẽ bị dập tắt rất nhanh do hiệu ứng của các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng đường dao động tự do trung bình nhở hơn kích thước. Nhưng khi kim loại ở dạng rất nhỏ mà ở đây là dạng các hạt có kích thước nano, hiện tượng dập tắt sẽ mất đi và điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng kích thích. Dao động này sẽ dẫn đến sự phân bố lại các điện tử của hạt nano Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 22 và làm cho hạt bị phân cực tạo thành lưỡng cực điện. Do tính chất là dao động cộng hưởng nên tần số của dao động này phụ thuộc vào các yêu tố về hình dạng kích thước hạt và bước sóng của ánh sáng kích thích. Ngoài ra mật độ hạt cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới tính chất quang, nếu mật độ loãng có thể coi các hạt nano đang ở dạng tự do, nếu mật độ cao thì còn phải tính đến cả tương tác giữa các hạt trong quá trình dao động của điện tử. Tính chất điện cũng là một yếu tố quan trọng của hạt nano. Kim loại có mật độ điện tử tự do cao do đó điện trở của kim loại thường thấp nên chúng dẫn điện rất tốt. Tuy vậy điện trở của một dây dẫn kim loại còn phụ thuộc vào tiết diện của dây hay nói các khác điện trở của một khối kim loại còn phụ thuộc vào kích thước. Thông thường dưới tác dụng của một hiệu điện thế U các điện tử trong kim loại sẽ chuyển động tuân theo định luật Ohm: U = IR với I là cường độ dòng và R là điện trở. Với R không đổi U và I sẽ thay đổi tuyến tính với nhau. Tuy nhiên khi kích thước của vật liệu giảm dần tới cỡ nano mét, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng. Kết quả của quá trình lượng tử hóa này là với các hạt nano I và U không còn tuyến tính với nhau nữa mà thay đổi tuân theo hiệu ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade). Hiệu ứng này làm đường U-I thay đổi, nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện tử, C là điện dung, R là điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực. Một tính chất quan trọng khác giúp mở rộng các ứng dụng của hạt nano là tính từ. Các kim loại quý như vàng bạc ở trạng thái khối thông thường có tính nghịch từ do sự bù trừ cặp điện tử. Tuy nhiên khi thu nhỏ kích thước vật liệu thì sự bù trừ này sẽ không còn hoàn thiện nữa và khi đó vật liệu có từ tính. Các kim loại ở trạng thái khối có tính sắt từ như các kim loại chuyển tiếp sắt, cô ban, niken thì khi kích thước thu nhỏ lại cỡ nano mét cũng sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm cho chúng chuyển sang trạng thái siêu thuận từ. Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi có từ trường, và không có từ tính khi ngắt từ trường, tức là dư lực và lực kháng từ hoàn toàn bằng không. Tính chất cuối cùng là tính chất nhiệt. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 23 một nguyên tử có một số phối vị đó là các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh với nguyên tử đó. Ở trạng thái khối, các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn các nguyên tử ở bên trong nên chúng có thể tái sắp xếp để có thể chuyển sang trạng thái khác. Như vậy với các hạt nano khi kích thước của chúng càng nhỏ, các nguyên tử trong hạt sẽ có số phối vị thấp, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm xuống. Ví dụ, hạt vàng kích thước 6nm có Tm = 950oC, 2nm có Tm = 500oC 1.4.2. Hạt nano từ tính Ngày nay, các hạt nano được sử dụng trong một loạt các lĩnh vực như công nghệ, y học và công nghiệp. Bằng cách kết hợp các phối tử ái lực lên các hạt nano hay hạt micro đã được áp dụng trong xét nghiệm chẩn đoán và rất nhiều các quy trình nghiên cứu. Các hạt nano vàng có lẽ đã được sử dụng sớm nhất cho những mục đích này [35]. Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp hạt nano tuy nhiên có thể chia các phương pháp này vào hai phương pháp chính. Phương pháp đầu tiên gọi là phương pháp “phá vỡ” (Breakdown hay còn gọi là top down ) phương pháp này sử dụng ngoại lực tác động lên một khối chất rắn dẫn đến bị vỡ ra thành hạt nhỏ hơn. Thứ hai là xây dựng (Built-up hay bottom-up) phương pháp sản xuất hạt nano bắt đầu từ các nguyên tử dạng khí hoặc lỏng dựa trên biến đổi nguyên tử hoặc thay đổi mật độ phân tử. Với cuộc cách mạng khoa học vật liệu trong công nghệ nano, hình dạng và kích thước hạt là gần như là không giới hạn, từ đó ứng dụng của hạt nano mở rộng đáng kể. Trong nghiên cứu này, các hạt nano được sử dụng là oxit sắt từ một hỗn hợp bao gồm sắt III (Fe3) và sắt II (Fe2). Các hạt oxit sắt được phủ một lớp bảo vệ bằng silica. Lớp phủ silica này có 2 tác dụng, một là giúp bảo vệ hạt trong các loại dung môi khác nhau ở các pH khác nhau do tính trơ về mặt hóa học của silica, hai là lớp phủ silica bên ngoài mỗi hạt sẽ tích điện âm cùng dấu do đó các hạt sẽ đẩy nhau và không bị vón lại với nhau. Như chúng ta đã biết, kích thước hạt, thành phần bề mặt, và mật độ hạt trực tiếp ảnh hưởng đến hoạt động của hạt trong dung dịch. Với bề mặt được bao phủ bởi silica hạt nano khá ổn định trong các bộ đệm khác nhau. Mặt khác, các hạt lớn hơn kích thước micron thường sẽ bị lắng xuống theo thời gian trong do trọng lực, các hạt Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 24 nano sắt với kích thước nano sẽ không dễ bi lắng xuống như vậy. Về lý thuyết, các hạt có thể được tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm, nhưng phải mất thời gian lâu hơn và một số hạt có thể bị vón lại và không thể hòa tan trở lại như ban đầu bởi vậy với những hạt này không nên ly tâm trong bất kỳ trường hợp nào, vì vậy nghiên cứu này sử dụng sắt là một nguyên tố kim loại có từ tính có thể được tập hợp nhanh chóng và dễ dàng chỉ bằng cách sử dụng nam châm. Các hạt nano từ tính được chức năng hóa với các nhóm amin để tạo thuận lợi cho các khớp nối với các kháng thể đặc hiệu cho vi khuẩn lao có chứa nhóm carboxyl do đó được đặt tên là các hạt nano amino [36]. Hình 1.6: Hạt nano từ bọc silica Các hạt nano từ được phủ một lớp silica tích điện âm giúp chúng ổn định huyền phù trong dung dịch do lực đẩy giữa các điện tích cùng dấu, tránh tập hợp lại với nhau và tủa xuống. 1.4.3. Phức hệ và phƣơng pháp tạo phức hệ với hạt nano. Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra phức hệ hạt từ-protein, bao gồm: Sử dụng liên kết chéo carbondiimide để tạo ra liên kết amide giữa nhóm carboxyl của protein và nhóm amine trên bề mặt hạt; Ứng dụng liên kết giữa hạt được hoạt hóa bằng streptavidine tương tác với protein bị biotin hóa; Sử dụng succinimidyl 4-(N- maleimidomethyl) cyclohexan – 1 – carboxylate (SMCC) để gắn gốc sulfhydryl Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 25 (NHS) với gốc amine.Trong đó SMCC được cho là hợp chất tạo liên kết giữa protein được sử dụng rộng rãi nhất. Hình 1.7: Cấu trúc phân tử SMCC Trong nghiên cứu này 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC hoặc EDAC) là một loại carbodiimide được sử dụng làm chất xúc tác tạo liên kết amide giữa nhóm carboxyl và nhóm amine. Ứng dụng của EDC trên hạt từ và trong các quy trình tạo liên kết bề mặt kết hợp với NHS ( N - hydroxysulfosuccinimide) hoặc sulfo-được sử dung rất rộng rãi [36]. Hình 1.8: Cấu trúc phân tử của EDC[35] EDC được hòa tan trong dung dich và trộn trực tiếp vào với phản ứng mà không cần sử dụng dung môi hòa tan hữu cơ. Hai thành phần tham gia phản ứng là phân tử protein chứa nhóm carboxyl và hạt nano từ tính chứa nhóm amine. Khi cần thiết các thành phần phản ứng cũng như các sản phẩm phụ tạo ra sau phản ứng gắn có thể được loại bỏ bằng màng lọc dialysis hoặc sắc ký lọc gel. Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Quang Đạo 26 EDC xúc tác tạo thành liên kết giữa hạt nano từ amino và phân tử protein được miêu tả trong Hình 1.9. EDC phản ứng với gốc carboxyl trên phân tử protein tạo ra hợp chất trung gian hoạt động o-acylisourea. Hợp chất này tương tác với nhóm amine trên bề mặt hạt nano từ tạo thành một liên kết amide. Hình 1.9: Phản ứng tạo liên kết amide xúc tác bởi EDC EDC phản ứng với carboxylic acids để tạo ra một liên kết ester trung gian sau đó tương tác với gốc amine để tạo thành một liên kết amid