Một số kết quả phân lập bệnh nấm hại trong vườn ươm cây cà phê tại Chiềng Mung Sơn La

Một số kết quả phân lập bệnh nấm hại trong vườn ươm cây cà phê tại Chiềng Mung Sơn La Some findings on fungus isolation in coffee nurseries in Chiengmung, Sonla Nguyễn Thế Quyết2, Nhữ Viết Cường2, Vũ Duy Thanh, Lê Thị ánh Hồng2, Kasem Soytong 2 Abstract 1. Viện Di truyền Nông nghiệp 2. Viện Đại học King MongKoot, Bangkok, Thai lan The largest losses in coffee production cause by diseases, particularly fungal diseases – among them the root diseases are caused many problems in coffee production. Fusarium spp., Pythium spp. and Rhizostonia spp. are the agents very dangerous not only for the coffee nursery, but also on the construct coffee. They caused the big problem in the wet season Sonla is one province where the coffee area enlarge more and more and so far total area increase more than 10 000 ha, but the farmers could not recognize exactly the agents of diseases and disease management is still based on chemical pesticides that have an impact on agricultural environment and public health. The isolation and good management of root coffee diseases will hinder unnecessary spread of root coffee diseases within or from this region and adopting practices compatible with sustainable, improve the health of coffee communities and sustainable environment. The study showed the results of coffee root diseases isolated in the coffe nursery in Chiengmung , Sonla. Key words: Isolation, Fusrium spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp., coffe nursery I. ĐặT VấN Đề Càphê là một loại cây công nghiệp lâu năm, chịu sự tác động rất lớn của nhiều yếu tố sinh học và không sinh học. Đặc biệt, các yếu tố sinh học gây ra cho cà phê những tổn thất không chỉ về năng suất mà còn về chất lượng và môi trường. Trong các yếu tố đó bệnh hại là một vấn đề cần phải quan tâm một cách thích đáng, đặc biệt là một số bệnh hại gây ra trong vườn ươm. Cần phải hiểu biết thật rõ ràng các bệnh hại chính trong vườn ươm thì mới có thể cung cấp được nguồn cây con sạch bệnh, ngăn chặn được sự lây nhiễm ban đầu , sự lây nhiễm này sẽ là một trong các nguyên nhân gây nên những nạn dịch bệnh nguy hiểm và hậu quả của chúng rất lâu dài. Hiện nay rất nhiều hộ trồng cà phê còn chưa biết phân biệt được các loại bệnh hại, vì vậy chưa áp dụng được những biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả. Trong báo cáo này chúng tôi đề cập đến kết quả phân lập một số bệnh nấm hại trong vườn ươm cây cà phê II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vật liệu Các mẫu bệnh được thu từ đất, từ lá, thân cây Cà phê trong vườn ươm ở một số hộ gia đình tại Hợp tác xã Cà phê Chiềng mung, Sơn La. - Các dụng cụ trong thí nghiệm bao gồm: bốc cấy, que cấy, dao cắt mẫu, đĩa petri (hộp lồng), đèn cồn, tuýp nhựa ependof loại 2ml, tủ định ôn, kính hiển vi sâu và kính hiển vi nổi, lam kính, lamen, buồng đếm bào tử, ống đong, bình tam giác, pipete, đầu côn, đèn tối (black light), túi nilon, cồn, bông … - Môi trưòng Nước Agar (WA) để phân lập khuẩn lạc thuần. - Môi trường sử dụng cho Rhizostonia solani: + MT phân lập: Alkalin Water Agar (Guttierrez et all., 1997); + MT nuôi cấy : PYDA (Flentji, 1956 Ogoshi, 1975 Oniki et al, 1985). - Môi trường sử dụng cho Fusarium spp: + MT phân lập: Komada’s (Komada 1975); + MT nuôi cấy: PDA (Nelson et al 1983). - Môi trường sử dụng cho Pythium spp.: + MT phân lập: V-8 Juice Cholesterol Broth (Ayers and Lumsden, 1975); + MT nuôi cấy : Galic Acid (Flower and Hendrix, 1969). - Các loại hóa chất phục vụ cho nghiên cứu vi sinh vật. 2. Phương pháp 1. Phương pháp thu thập mẫu (theo phương pháp của Viện Bảo vệ Thực vật; 1999) - Đối với bệnh gây thắt cổ rễ như Rhizostonia solani và Pythium spp. và bệnh nấm hại khác như Fusarium spp. Chọn vườn phù hợp với mục đích thu thập. - Thu thập mẫu tại các vườn có triệu chứng bệnh điển hình trên thân cây con (dựa vào những triệu chứng điển hình như vết màu nâu, hoặc nâu sẫm, hoặc mầu đen hoặc vết bệnh lan rộng vòng quanh thân cây con cà phê là những triệu chứng sẽ dẫn đến thắt cổ rễ trên thân cây non. Hoặc có thể thu thập mẫu trên các cây con đã bị đứt rễ cọc). Các mẫu thu thập được đánh số thứ tự và để riêng từng túi đựng mẫu tránh tạo độ ẩm, nhầm lẫn. Mẫu bệnh thu về được phân lập càng sớm càng tốt và trong trường hợp nếu không phân lập ngay, được bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14-200C. 2. Phương pháp khử trùng mẫu Rửa mẫu bệnh dưới vòi nước. Tách những phần mô thực vật có cả phần bị bệnh và phần không bị bệnh. Sau đó cho vào dung dịch khử trùng thích hợp (ô xy già, cồn 70, hoặc natri hypoclorid…) thời gian từ 1-2 phút. Cho những mảnh mẫu ra và rửa lại bằng nước cất vô trùng, tất cả phải tiến hành trong điều kiện vô trùng sau đó đặt các mẫu lên môi trường WA. và để ở nhiệt độ 25-300C sau 1-2 ngày tiến hành quan sát sự phát triển của tác nhân gây bệnh. 3. Phân lập khuẩn lạc thuần và bảo quản Kỹ thuật tách nấm bệnh từ mẫu bệnh (lá, thân, rễ) (lá, thân, rễ) Tiến hành quan sát sự phát triển của tác nhân gây bệnh. Tách các sợi nấm giống nhau cho sang các môi trường PDA để thu các khuẩn lạc thuần (lưu ý dùng kháng sinh (như Rifamicin, Pimaricin hoặc giấy bạc để loại trừ sự phát triển của vi khuẩn). Khi thu được khuẩn lạc thuần, chúng tôi tiến hành cấy đồng thời vào hai ống nghiệm đã đổ môi trường PDA vô trùng. Một ống đem giữ ở nhiệt độ 0 - 4oC hoặc giữ ở nhiệt – 40oC (hoặc - 80oC) trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao như Glyxerol, Manitol. Một ống khác để ở nhiệt độ phòng để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp. Tách mẫu đất và hoà loãng theo phương pháp của Viện Bảo vệ Thực vật 1999. Nấm được định danh theo: - Illustrated genera of imferfect fungi (Bernett, 1960); - Soilborne Phytopathologenic Fungi; Methods for Research (L.L. Singleton et all, 1992); - Plant Pathology (Fourth Edition), George N. Agrios; - Microfungi on Land Plants; An Identification Handbook, Martin B. Ellis et all; 1997. III. KếT QUả Và THảO LUậN 1. Kết quả phân lập và định danh một số nấm có trong mẫu đất tại Chiềng Mung Sơn La Các mẫu thu thập về được phân tích và định danh dưới kính hiển vi , sau đó mẫu sẽ được đưa vào 2 ống nghiệm có môi trường 1/2 PDA vô trùng, 1 ống nghiệm đem giữ ở nhiệt độ 0 - 4oC hoặc giữ ở nhiệt – 40oC (hoặc - 80oC) trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao như Glyxerol. Một ống khác để ở nhiệt độ trong phòng để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo. Bảng 1. Các Isolates tách được từ các mẫu đất thu từ vùng rễ cây con cà phê trong vườn ươm của Hợp tác xã Chiềng mung, Sơn La Mẫu đất Cỏc Isolates CPU/g X 103 Định dạng SLH1 01 12.0 Aspergillus 02 0.4 Aspergillus 03 6.4 Penicillium 04 Pythium 05 Fusarium SLH2 01 8.0 Aspergillus 02 Pythium 03 6.4 Penicillium 04 Rhizoctonia 05 2.0 Fusarium SLH3 01 3.0 Fusaroum 02 Pythium 03 6.4 Penicillium 04 Rhizoctonia SLH5 01 Pythium 02 8.0 Aspergillus 03 Pythium 04 Pythium 05 Penicillium 2. Kết quả phân lập nấm Rhizoctonia solani Rhizoctonia solani là một loài lớn nhất của giống Rhizoctonia được mô tả bởi Julius Kuhn trên cây khoai tây vào năm 1858. Bệnh phát sinh trên cổ rễ và rễ. Vết bệnh đầu tiên là những vết màu nâu sáng, sau phát triển và làm thắt cổ rễ. Đối với Rhizoctonia solani cũng như các loài khác của Rhizoctonia chúng không tạo bào tử phân sinh và rất hiếm tạo bào tử đảm, vì vậy có những khó khăn khi phân loại chúng. Trong nghiên cứu thường phải quan sát hình thái học của chúng trên môi trường dinh dưỡng. Theo J.R. Parmeter et al, 1969, dựa vào quan điểm về sự phân nhánh của sợi nấm để nhận dạng và phân loại chúng. Các mẫu bệnh thu được từ vườn ươm sau khi đã khử trùng được cắt nhỏ và cấy vào môi trường phân lập Alkalin Water Agar, sau 24 giờ thu được các sợi nấm phát triển. Các sợi nấm sinh dưỡng dễ dàng quan sát trên môi trường nhân tạo khi còn non không có mầu, nhưng khi khuẩn lạc phát triển và trưởng thành có mầu nâu. Hệ sợi nấm bao gồm các sợi nấm phân nhánh với góc 900 với sự thắt lại ở phần nhánh và phân thành các tế bào riêng biệt có vách ngăn (hình bìa 3-1) chứa đựng các lỗ. Những lỗ vách ngăn này cho phép tế bào chất, ti thể và nhân di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác. Sợi nấm trưởng thành có thànhdầy mầu nâu, các tế bào sợi nấm có dạng hình ống kết hợp lại thành những cấu trúc rắn chắc khô, cứng, gọi là hạch nấm, nhìn dược bằng mắt thường (hình bìa 3-2). hạch nấm và sợi nấm tồn tại trong đất và trong các tàn dư trong vườn là nguồn lan truyền bệnh. Các mẫu thu được trong thí nghiệm này chỉ gây ra hiện tượng chết rạp cây con, không gây hiện tượng tàn lụi trên lá. 3. Kết quả phân lập bệnh thối rễ, héo mạch do nấm Fusarium oxysporum Đối với nấm Fusarium oxysporum thường dựa vào đặc điển hình thái. Nấm gây bệnh là loại nấm sống trong đất, phân bố rộng trong các loại đất trồng trọt, nấm có phổ ký chủ rộng bao gồm hơn 100 dạng chuyên hoá và chủng gây héo vàng lá và thối rễ đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, rau màu, cây ăn quả, cây hoa và nhiều loại cây cảnh khác. (Nelsson và cộng sự, 1981 Magnenat và cộng sự, 1991...). Fusarium oxysporum có sẵn trong đất và rễ ở các vườn ươm cây cà phê kể cả các vườn cà phê kiến thiết. Trong môi trường nuôi cấy cứng (PDA), nấm F. oxysporum phát triển nhiều dạng khuẩn lạc đặc biệt. Nhìn chung sợi nấm khí sinh ban đầu có mầu trắng, sau đó thay đổi trạng thái mầu sắc khác nhau từ mầu tím đến mầu tía (hình bìa 3-3), hoặc có mầu cá hồi và xanh nhạt có sắc đỏ, hay mầu cá hồi đến mầu da cam, tuỳ thuộc vào chủng hay dạng đặc biệt của F. oxysporum. Đường kính khuẩn lạc sau cấy 3 ngày ở nhiệt độ 25oC -30oC có thể đạt từ 2,5 đến 4,0 cm. F. oxysporum, sản sinh ra 3 loại bào tử vô tính: đó là: Tiểu bào tử, đại bào tử và bào tử hậu. 1. Các bào tử hậu thường có dạng hình tròn, có thành bào tử dầy do các sợi nấm tạo thành loại bào tử này thường có 1 đến 2 ngăn, chúng được sinh ra trong các đại bào tử hoặc xen giữa các sợi nấm già (hình bìa 3-4). 2. Tiểu bào tử là các bào tử có 1 hay 2 ngăn, có hình trứng, hình bầu dục (hình bìa 3-4, TBT là các hình nhỏ trong ảnh), đây là dạng bào tử có nhiều nhất và được sản sinh trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong các mạch dẫn của cây bị bệnh. 3. Đại bào tử là các bào tử có từ 3 đến 5 ngăn . Đại bào tử có hình bán nguyệt, hình lưỡi liềm (hình bìa 3-4, ĐBT có hình dáng lớn nhất). Đại bào tử có thể tồn lưu trong đất lâu đến 30 năm và nó chính là nguồn lan truyền bệnh cho các năm sau và các cây chủ khác. 4. Kết quả phân lập bệnh chết rạp do nấm Pythium rotratum gây ra Bệnh do nấm Pythium spp. thường biểu hiện vào mùa xuân, bệnh gây hại trong vườn ươm cây con gây hiện tượng chết rạp (damping off). Đây là loại nấm gây hại cổ rễ và một vài triệu chứng khác trên cây con, bệnh thuộc nhóm nấm trứng Oomycetes. Những nơi có độ ẩm cao thường xuất hiện loài nấm này. Nấm gây ra triệu chứng thối cổ rễ có đặc điểm sản sinh ra các bào tử động, chúng có thể di chuyển qua các màng lọc khi hoà tan đất, vì vậy bệnh dễ lây lan. Đặc điểm của loài này là khuẩn lạc phát triển chậm, bọc bào tử có dạng hình cầu hoặc hình oval, đường kính 23-24 mm. Bào tử động được sinh ra khi có nước (từ 50C). Túi noãn có hình cầu hoặc gần như hình cầu, đường kính 13-29 mm. Bào tử noãn căng lên với thành dầy vừa phải; túi tinh đôi khi nằm phía dưới cơ quan sinh dục cái, phần lớn chúng lưỡng tính. Trong túi noãn chứa 1-2 bào tử noãn. Hình bìa 3-5 và bìa 3-6 là các đặc điểm túi noãn và sợi nấm của Pythium rotratum. Trong các mẫu đất, chúng tôi còn phân lập được các loài khác của Pythium, Hình dáng đặc điểm túi noãn của Pythium spp. được trình bầy ở hình bìa 3-7. IV. KếT LUậN Và Đề NGHị Qua các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: Trong các vườn ươm cây cà phê có nhiều loại nấm gây hại, đặc biệt là các loại nấm gây hại trên rễ, làm cho cây chết rạp, thối rễ , cây chậm sinh trưởng và phát triển dẫn đến chất lượng cây con khi đưa ra vườn sản xuất không đảm bảo và đồng thời đó chính là nguồn lây nhiễm vô cùng nguy hại cho các vườn cà phê kiến thiết sau này. Tài liệu tham khảo 1. Đoàn Triệu Nhạn, Hoàng Thanh tiệm, Phan Quốc Sủng, 1999, Cây Cà Phê ở Việt Nam. 2. Đỗ Tấn Dũng, 200; Bệnh héo rũ hại cây trồng và biện pháp phòng chống, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2001. 3 Vũ Khắc Nhượng, Đoàn Triệu Nhạn, 1989. Sâu bệnh và cỏ dại trên vườn cà phê Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Hà Nội, 1989. 4. Agrios, G.N. 1997;. Plant Pathology, 4rd. ed. Academic Press, Inc.: New York. 635pp. 5. Arabica coffee manual for Lao PDR… Originated by: Regional Office for Asia and the Pacific 6. Rhizoctonia solani, 1999., Pathogen profile created by Paulo Ceresini; NC state University., 1999.