Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn)

hân tử ATP lần 2 tạo ra fructoza 1,6 đi photphoglyxeric * Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch. Fructo 1,6 đi ố dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt và đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza. ở giai đoạn này dưới tác dụng của trioza – photphatizomericeza có thể chuyển hoá lẫn nhau. Đioxyaxeton photphat alđehyt – 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 3: Oxy hoá Dưới tác dụng của enzim alđehyt photphoglyxeriđehyđrogenaz mà alđehyt – 3 – photphoglyxeric bị oxy hoá thành axit 1,3 đi phophoglixeric. Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP. Phản ứng này có ý nghĩa hơn vì năng lượng giải phóng cho quá trình oxy hoá được tích luỹ trong các phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho quá trình hoạt động của tế bào trong điều kiện không có oxy. Phản ứng do enzim photpho – glyxeratkitonaza xúc tác tạo axit 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic Dưới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3 – photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 – photphoglyxeric. Do tác dụng của enzim enolaza mà axit 2 – photphoglyxeric chuyển thành axit enol piruvic Dước sự tác dụng của enzim piruvat kinaza mà axit 2 photpho enol piruvic chuyển thành axit piruvic. * Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rượu. Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetalđehyt nhờ enzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza. Sau đó axetalđehyt bị khử thành etanol nhờ enzim alcođehiđrogenaz. Phương trình tổng quát quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy các quá trình oxy hoá khử có enzim trong tế bào nấm men tham gia. 2.4. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang 2.4.1. Nấm men 2.4.2. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus. 2.4.3. Vi khuẩn Trong nước hoa quả và nước rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ. Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm đục cho vang, đó thường là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti. Pasteur đã khám phá cơ chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus. Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng pasteur nhưng nó làm giảm chất lượng rượu vang, phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO2 ( 75 – 120 mg/l ). 2.4.4. Bệnh vang Bệnh vang đã được Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang là hiện tượng rượu bị chua đi và phẩm chất giảm rất nhanh. [1,18]. Nguyên nhân: Do rượu vang tiếp xúc với không khí và do đó dưới tác dụng của vi khuẩn axit axetic phát triển đã biến cồn thành axit. Ngoài ra bệnh vang còn có thể do vi sinh vật lên men kỵ khí. 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 2.5.1. Nguồn cacbon Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy các hợp chất cacbon có vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sinh trưởng nấm men. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là: - Sản sinh năng lượng - Tạo thành những tiền chất - Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường. 2.5.2. Nguồn nitơ và muối khoáng - Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng như tất cả những cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Do đó môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá. - Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, hạt nhiễm sắc thể, enzim. Các ion: Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men. Các ion: Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh học cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men [16]. 2.5.3. Nguồn Oxi Đối với nấm men dùng để lên men, oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối. Quá trình lên men rượu diễn ra ở điều kiện yếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn. Sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men, rút ngắn thời gian lên men có lợi về mặt kinh tế nhưng không có lợi về công nghệ do tạo sản phẩm bậc hai quá lớn. 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 2.6.1. pH môi trường Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường bị biến đổi khiến cho sự sinh sản của nấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môi trường lúc này bắt đầu khan hiếm chất dinh dưỡng và hoạt lực enzim trong tế bào lớn. Vì vậy nấm men tự phân huỷ và giải phóng NH3. Khi pH dưới 2 – 3 thì quá trình lên men bị yếu đi. Nếu pH trên 6,5 – 7,5 khả năng lên men vang phát triển tốt: 4,0 – 5,0. 2.6.2. ảnh hưởng của nhiệt độ Quá trình lên men thường sinh ra nhiệt và lượng nhiệt này có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu. Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ. Nhiệt độ giới hạn của men rượu vang là không quá 300 c. ở 35 0c được coi là nhiệt độ nguy hiểm, tuy nhiên đây không được coi là quy luật chung tuyệt đối về nhiệt độ. Nhiệt độ 35 0c nấm men mất tác dụng , quá trình lên men bị dừng lại nhưng không bị chết nấm men. Trong quá trình lên men rượu vang, việc khống chế nhiệt độ dưới 30 0c là điều rất quan trọng. Nếu vượt quá đến nhiệt độ tới hạn (350 c ), quá trình lên men rượu bị ngừng lại ảnh hưởng đến việc chuyển hoá đường thành cồn và CO2. Đồng thời lượng đường sót lại chưa được lên men là môi trường cho các vi khuẩn sinh khí hoạt động, đặc biệt vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit lắc tíc hoặc axit axetic, đó là hiện tượng hoá chua axit, làm giảm chất lượng rượu vang. Ngược lại ở nhiệt độ thấp (<20 0c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp, các cấu tử có lợi cho rượu vang được hình thành quá ít. Quá trình lên men bắt đầu tốt ở nhiệt độ 200 c, ở 25 0c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn 17 - 18 0c xảy ra sau 24 h. Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp 100c. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28 0c. 2.6.3. ảnh hưởng của nồng độ cồn Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt: 9 – 140. Hàm lượng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm, thậm chí làm dừng lại quá trình lên men. ảnh hưởng của cùng một hàm lượng cồn ở 300 c và 200c là hoàn toàn khác nhau. ở 300 c cồn gây ảnh hưởng xấu hơn ở 20 0c. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lượng rượu vang. Nhiều thí nghiệm chỉ ra rằng, chính hàm lượng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đã cản trở sự lên men chứ không phải sự thiếu vắng các chất sinh trưởng hoặc sự tạo thành các chất kháng khuẩn. Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rượu vang, cải thiện chất lượng vang, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồng độ cao. Việc sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. 2.6.4. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đường cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nồng độ đường cao, ức chế quá trình lên men. Nồng độ đường thích hợp khoảng 200 – 280 g/l. Nếu cao hơn nữa tốc độ lên men giảm đi. Đường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất, áp suất thẩm thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy. Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trường. áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tượng khô sinh lý teo chất nguyên sinh. Nồng độ quá cao tế bào nấm men không sinh trưởng được. Nồng độ đường quá thấp tế bào sẽ ngừng phát triển. Phần 3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) được thu nhận từ hai trung tâm trồng và thu hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hưng Yên ). Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch cùi quả vải thiều có vị trí phân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây: Lớp : Ascomycetes Bộ : Saccharomyateae Họ phụ : Saccharomyateaetdieae Giống : Saccharomyces Loài : Cervisiae 3.2. Hoá chất - Đường: glucoza, sacaorza. - Một số chất vô cơ: KH2SO4 ( Kalihiđrophotphat ). MgSO4. 7H2O ( Magie sun phat ). - Một số chất hữu cơ: Thạch agar, peptôn, phenolphtalein. - Nước cất, nước máy. - Cồn. 3.3. Dụng cụ thiết bị - Nồi hấp áp lực. - Cồn kế. - Kính hiển vi quang học. - Buồng đếm Goriaev. - Cân kỹ thuật và cân phân tích. - Tủ sấy. - Buồng vô trùng. - ống nghiệm. - Máy đo pH và giấy đo pH. - Hộp pêtri. - Bình cầu, bình tam giác. - Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh. - Que cấy, đèn cồn. 3.4. Môi trường Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi chọn môi trường vô cơ theo tỷ lệ sau: 3.4.1. Môi trường Hansen (MT1 ) g/l: Môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Thạch agar : 20 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.2. Môi trường nhân giống (MT2 ): g/l. - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.3. Môi trường lên men (MT3 ) : g/l. - Dịch siro hoa quả :200 - MgSO4. 7 H2O : 1,0 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.5. Phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu sau: Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men. Xác định hoạt lực lên men bằng: + Cân bình trọng lượng. +Xác định số lượng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống. Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Các phương pháp phân tích: + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1 N. + Xác định độ cồn bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150c, bằng phương pháp hoá học. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học. 3.5.1. Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa: Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước hình thái và khả năng lên men như nhau, chúng tôi chọn phương pháp phân lập trên hộp pêtri. Môi trường để tuyển chọn khuẩn lạc nấm men là Hansen. Các tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp pêtri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur. Dịch hoa quả đã được pha loãng 10-1- 10-10 bằng nước cất. Nhờ một hai giọt huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 – 280c trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trưng cho nấm men (mép răng cưa và nhẵn bóng ). 3.5.2. Phương pháp hoạt hoá giống Trước khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thì tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trường thạch nghiêng 24 – 280c trong vòng 24 h trên máy lắc. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống được pha ở nồng độ đường 10% trong vòng 24 h được giống cấp hai. 3.5.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Để biết được hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiến hành dùng các phương pháp sau: * Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. * Phương pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev: Cấy giống vào môi trường nhân giống ở 280c, lắc đều canh trường dùng pipet chia độ pha loãng canh trường. Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãng theo tỷ lệ khác nhau. Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa hai tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 – 5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau. Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A. 50. B. Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông. B : Hệ số pha loãng. 3.5.4. Phương pháp phân tích + Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. + Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng cách: Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit trong dịch lên men. Phản ứng trung hoà: OH- + H+ H2O 3.5.5. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 3.5.6. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học Xử lý các kết quả nghiên cứu và đánh giá theo phương pháp thống kê toán học thông qua các thông số sau: - Giá trị trung bình số học: = - Độ lệch chuẩn: = nếu n < 30 = nếu n 30 - Sai số trung bình số học: m = - Hệ số biến động: Cv % = . 100 (%). n : Số lần lặp lại. Xi : Giá trị đo lần thứ i. Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 4.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men 4.1.1. Tiêu chuẩn chọn chủng Quá trình sản xuất etanol phụ thuộc vào chủng dùng trong lên men. Nấm men sử dụng để lên men rượu vang từ dịch vải thiều phải đạt các yêu cầu sau: [10, 12]. - Lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao. - Chịu độ cồn và độ axit cao. - Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn. - Hương thơm có tạo các este đặc biệt. - Dễ lắng trong. - ổn định lâu dài trong sản xuất. 4.1.2. Phân lập và tuyển chọn Môi trường phân lập là môi trường Hansen được thanh trùng theo phương pháp Pasteur sau đó được phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch vải được pha loãng từ 10-1 – 10-10, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù 10-9 mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trường. Nuôi trong tủ ấm 280 c trong thời gian 48 giờ. Sau 12 lần phân lập chúng tôi đã chọn được 35 mẫu nấm men. Khi có mẫu tiến hành lựa chọn 2 mẫu có đường kính khuẩn lạc lớn nhất và khả năng lên men cao nhất đưa sang nghiên cứu tiếp. Hai mẫu nấm men này tạm thời được gọi là H7 và C13. 4.1.3. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men H7 và C13 Dựa vào khoá phân loại của Loder năm 1971 (Khoá phân loại mới được nhiều người sử dụng ), theo khóa phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu đều có đặc tính [10]: - Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía. - Không đồng hoá nitrat. - Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu. - Lên men Glucôza mạnh. - Lên men được saccaroza, galactoza, mantoza. - Điều kiện không thuận lợi hình thành 1 4 bào tử. - Mỗi nang chứa 2 4 bào tử. Từ đó tạm thời đặt tên cho 2 mẫu nấm men là Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. 4.2. Xác định hoạt lực lên men Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men được đánh giá bằng hàm lượng CO2 sinh ra. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trường thì trọng lượng bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai chủng H7 và C13 với số lần nhắc lại là 8 lần, thu được kết quả lượng CO2 thoát ra trong 72 h từ khi lên men ở bảng số 2. Bảng 2.Hàm lượng khí CO2 giải phóng sau 72 h lên men của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Tên chủng Hàm lượng CO2 (g/100 ml ) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 H7 2,32 2,36 2,30 2,58 2,60 2,35 2,47 2,40 C13 2,60 2,48 2,45 2,32 2,30 2,58 2,28 2,35 Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng H7và C13 đều lên men mạch, lượng CO2 thoát ra nhiều, phủ kín bề mặt lên men làm môi trường lên men ít bị ô nhiễm. Sự phát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập, với lượng CO2 thoát ra đạt trên 4g/100 ml là đạt yêu cầu dùng cho lên men rượu vang các loại hoa quả. Vì vậy, hai chủng này được nghiên cứu tiếp động thái phát triển [10]. 4.2.2. Động thái phát triển của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 Trong qúa trình sản xuất rượu vang giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 28 h, nhưng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng của tế bào nấm men. Việc nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển 2 chủng H7 và C13 là một phần trong quá trình sản xuất rượu. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường số 2 (môi trường nhân giống ) ở điều kiện môi trường 280c, số tế bào ban đầu 3,5 . 106 tế bào, cứ sau 12 h kiểm tra 1 lần. Mục đích là xác định động thái phát triển của 2 chủng nấm men H7 và C13. Kết quả thí nghiệm được diễn ra ở bảng 3 và đồ thị 2. Bảng 3. Động thái phát triển của 2 chủng nấm men S . cerevisiae H7 và C13 Thời gian(h) H7 C13 M.106±m d (%) Cv (%) M.106±m d (%) Cv (%) 0 3,5 ± 0,2 0,00 0,00 3,5 ± 0,2 0,00 0,00 4 6,2 ± 2 0,14 0,24 8,0 ± 3 0,15 0,24 8 11,8 ± 2,5 0,12 0,20 12,6 ± 34 0,14 0,22 12 14 ± 2 0,12 0,20 16± 0,41 0,13 0,20 16 28,2 ± 0,36 0,08 0,14 28 ± 0,26 0,10 0,16 20 37 ± 0,23 0,06 0,10 39 ± 0,25 0,07 0,11 24 46 ± 0,25 0,03 0,05 48 ± 0,28 0,02 0,03 28 52 ± 0,36 0,02 0,03 56 ± 0,32 0,02 0,03 32 68 ± 0,42 0,03 0,05 78 ± 0,38 0,04 0,06 36 82 ± 0,38 0,07 0,12 90 ± 0,42 0,07 0,11 40 108 ± 0,46 0,14 0,24 112 ± 0,48 0,14 0,22 44 116 ± 0,42 0,16 0,25 126 ± 0,38 0,17 0,27 48 124 ± 0,49 0,18 0,31 138 ± 0,51 0,21 0,33 52 120 ± 0,43 0,15 0,22 134 ± 0,37 0,17 0,27 Số lượng tế bào ( M.106) Thời gian(h) Đồ thị 2. Động thái phát triển của 2 chủng H7 và C13. Như vậy cả 2 chủng H7 và C13 đều có khả năng phát triển tốt và theo đúng động thái phát triển . Từ kết quả trên ta xác định được động thái phát triển của 2 chủng như sau: - Pha tiền phát: từ 0h – 12h, vì giai đoạn này tế bào mới thích nghi với môi trường, kích thước tế bào tăng dần lên. - Pha logarit (pha cấp số mũ ): từ 12h – 48h, tế bào nấm men phát triển nhanh do lượng vật chất tích luỹ ở pha tiền phát. - Pha cân bằng: từ 48h – 60h, số lượng tế bào không tăng. - Pha suy vong: Tốc độ sinh trưởng của nấm men giảm nhanh do vậy nấm men chết nhiều. Một số nghiên cứu trước đây cho thấy kết quả là pha logarit từ 12h – 96h. Tuy nhiên pha logarit của 2 chủng H7 và C13 mà chúng ta đã nghiên cứu chỉ tồn tại từ 12h – 48h. Nguyên nhân do môi trường có độ cồn cao, độ pH thấp mà các tế bào nấm men sinh ra đã lên men, làm ức chế sự sinh trưởng của nấm men. 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 trong môi trường lên men Như chúng ta đã biết hàm lượng rượu etylic tạo thành, lượng axit hữu cơ sinh ra sẽ quyết định đến chất lượng rượu vang. Do đó việc nghiên cứu yếu tố của môi trường đến quá trình lên men rượu vang là vấn đề cần thiết. Sự biến đổi các yếu tố môi trường trong một phạm vi nhất định sẽ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men. Môi trường chúng tôi dùng để lên men là môi trường số 3 (MT3 ) môi trường được bổ sung đường cho đủ 210 g/l, hàm lượng men sót, hàm lượng rượu tạo thành, lượng CO2 giải phóng, các chỉ tiêu được xác định sau 15 ngày. Kết quả được dẫn ra ở bảng 4 và đồ thị số 2, 3. Bảng 4. Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của 2 chủng H7 và C13 Thời gian (ngày) Đường (g/l) CO2 (g/l) Rượu (% V) pH H7 C13 H7 C13 H7 C13 H7 C13 1 210 210 0 0 0 0 4,5 4,5 2 180,6 1 182 1 17,8 0,5 18 0,5 1,8 0,05 2,0 0,05 4,39 4,40 3 160,5 1 162,3 1 19,2 0,5 19,3 0,5 2,1 0,05 2,2 0,05 4,32 4,38 4 143,1 1 140,4 1 20,5 0,5 21,4 0,5 2,8 0,05 3,1 0,05 4,28 4,27 5 110,4 1 108,5 1 25,3 0,5 26,1 0,5 3,5 0,05 3,7 0,05 4,15 4,13 6 87,9 0,8 86,3 0,8 28,9 0,5 29,4 0,5 4,1 0,05 4,2 0,05 4,11 4,09 7 63,5 0,6 60,2 0,6 32,4 0,5 35,2 0,5 4,9 0,05 4,8 0,05 4,07 4,05 8 58,6 0,6 59,3 0,6 40,1 0,5 40,4 0,5 5,5 0,05 5,6 0,05 4,0 4,0 9 46,2 0,4 45,7 0,4 46,2 0,5 48,6 0,5 6,3 0,05 6,5 0,05 3,92 3,93 10 37,1 0,4 39,2 0,4 53,5 0,5 59,2 0,5 7,7 0,05 7,4 0,05 3,86 3,82 11 31,2 0,3 30,7 0,3 60,2 0,5 63,8 0,5 8,4 0,05 8,6 0,05 3,73 3,76 12 22,8 0,3 23 0,3 78,1 0,5 80,2 0,5 9,3 0,05 9,4 0,05 3,62 3,64 13 15,3 0,2 15,9 0,2 83,6 0,5 87,9 0,5 10,4 0,05 10,6 0,05 3,51 3,56 14 10,2 0,2 11,4 0,2 91,3 0,5 93,8 0,5 11,5 0,05 11,5 0,05 3,33 3,29 15 5,3 0,2 5,2 0,2 103,8 0,5 100,4 0,5 12,8 0,05 12,9 0,05 3,20 3,21 Đồ thị 2. Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae H7 Đồ thị 3. Biểu diễn Nồng độ cồn, hàm lượng đường sót,hàm lượng CO2, độ pH trong dịch lên men sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae C13 Qua bảng 4 và đồ thị 2, 3 cho thấy chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 phát triển mạnh bắt đầu từ ngày thứ 2 trở đi vì nó được đánh dấu bằng sự giảm đi hàm lượng đường trong dung dịch lên men. Sự giảm hàm lượng đường tăng mạnh ở các ngày tiếp theo. Đồng thời với sự giảm hàm lượng đường là sự tăng lên của khí CO2 thoát ra. Độ rượu cũng tăng và đạt cực đại vào ngày 15 là 12,8% V (H7 ) và 12,9% V (C13 ). Qúa trình lên men hàm lượng axit tăng lên làm pH của môi trường giảm mạnh từ 4,5 xuống 3,20 (H7 ), 3,21 (C13 ) tạo nên vị chua của rượu vang. 4.3.1. ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men Quá trình lên men quyết định chất lượng rượu vang. Môi trường lên men có nhiều đặc điểm khác so với môi trường nhân giống: hàm lượng đường trong môi trường lên men cao hơn, thời gian kết thúc qúa trình lên men dài hơn. Quá trình lên men kỵ khí hoàn toàn còn quá trình nhân giống thông khí. Nếu như tốc độ sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men là nhân tố chính của quá trình nhân giống thì trong qúa trình lên men lại dựa vào các tiêu chuẩn khả năng sinh rượu, tạo hương, khả năng chuyển hoá đường, màu sắc sản phẩm. Trng qúa trình lên men, hàm lượng rượu sinh ra chủ yếu từ quá trình chuyển hoá đường của nấm men. Do đó, yếu tố môi trường phải nghiên cứu đầu tiên là ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men. Theo tính toán, hàm lượng đường thích hợp cho nấm men là 200 – 240 g/l. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng 200, 210,220, 230, 240 g/l với hai chủng Sacharomyces cerevisiae H7 và C13. Các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên pH = 4,5, giống 12%. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chủ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml ), số lượng tế bào sau 72h, phân tích nồng độ cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 360h kết quả được dẫn ra ở bảng 5.1,5.2,6 và biểu đồ 1,2. Bảng 5.1. Kết qủa về ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men H7 Chỉ tiêu Đơn vị Hàm lượng đường trong dịch lên men chủng H7 200 210 220 230 240 CO2 g/l 2,75 2,88 2,72 2,55 2,13 Đường sót g/l 5,80,2 5,30,2 6,0±0,2 6,1±0,2 6,50,2 `Cồn %V 10,10,2 12,80,2 11,0±0,2 11,5±0,2 12,40,2 Bảng 5.2. Kết qủa về ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men C13 Chỉ tiêu Đơn vị Hàm lượng đường trong dịch lên men chủng C13 200 210 220 230 240 CO2 g/l 3,16 3,32 3,0 2,9 2,45 Đường sót g/l 6,10,2 5,20,2 5,7±0,2 6,40,2 7,00,2 Cồn %V 12,20,2 12,90,2 11,2±0,2 11,60,2 12,40,2 Biểu đồ 1. Biểu diễn hàm lượng đường sót trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men H7 và C13 Biểu đồ 2. . Biểu diễn hàm lượng cồn sinh ra trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men H7 và C13 Bảng 6. ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 ( x 106 tế bào/ml ) Hàm lượng đường Tên chủng Thời gian(h) 12 24 36 48 60 72 84 200 H7 13±1 26±1 53±2 78±3 120±4 128±5 123±5 C13 12±1 23±1 55±2 74±3 115±4 125±5 120±4 210 H7 14±1 32±1 62±2 90±3 130±5 135±5 129±5 C13 14±1 30±1 57±2 85±3 127±5 135±5 128±5 220 H7 12±1 25±1 46±2 73±3 110±4 125±5 120±4 C13 14±1 22±1 48±2 70±3 148±4 120±4 115±4 230 H7 12±1 21±1 41±2 65±3 96±4 110±4 120±4 C13 11±1 23±1 42±2 64±3 95±4 107±4 118±4 Số lượng tế bào H7 (x106TB/ml) 240 H7 10±1 18±1 37±2 60±2 72±3 85±3 110±4 C13 8±0,8 20±1 38±2 59±2 75±3 88±3 107±4 Thời gian 12 24 36 48 60 72 84 Đồ thị 4 . Biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng saccharomyces cerevisiae H7(106TB/ml) Số lượng tế bào chủng H7 (x106 TB/ml) Đồ thị 5 . Biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự sinh sản và phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae C13(106TB/ml) Thời gian 12 24 36 48 60