Nghiên cứu định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

(Diod Array Detector) Bộ phận ghi tín hiệu: Recorder Bộ điều khiển: Computer Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện pic). Nếu tR là thời gian lưu giữ của một chất thì Trong đó: tR’ là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực) t0 là thời gian chết (thời gian chất không bị lưu giữ nghĩa là tốc độ di chuyển của chất bằng tốc độ di chuyển của dung môi). Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ. Trong đó: VR phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, tốc Fc là thể tích pha động trong một đơn vị thời gian; tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ… Hệ số phân bố K Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố tính theo công thức: Trong đó, Cs và Cm là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ. Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn) Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm) Thừa số dung lượng K’ K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng Trong đó tR là thời gian lưu, to là thời gian chết. K’ phụ thuộc bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤K’≤8 Nếu K’ <1 thời gian phân tích ngắn pic ra sớm dễ lẫn với tạp Nếu K’ >8 thì thì gian phân tích sẽ quá dài, tốn dung môi Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor) Để tách riêng hai chất thường chọn α = 1, 05 - 2,0. Nếu α càng lớn thì hai chất tách nhau càng tốt, α nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng α qua lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài. Độ phân giải Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) Như vậy Rs phụ thuộc vào: Hiệu lực cột Thừa số chọn lọc α Thừa số dung lượng K’B Rs tối ưu ≥ 1, 5 Có thể làm tăng Rs bằng cách: Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng. Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn Tăng α: Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rs thay đổi lớn f. Hệ số bất đối AF Trong đó: W là độ rộng đáy píc đo ở 1/20 chiều cao của pic d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic. Yêu cầu AF = 0,9 - 2,0. Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính theo diện tích pic sẽ càng chính xác hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: pH quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó ảnh hưởng đến AF Cột tốt thì AF sẽ tốt Thể tích tiêm Cải thiện AF Chọn cột phù hợp Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở dạng thích hợp. Thể tích tiêm thích hợp. Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng pic) Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài. W (độ rộng pic ở đáy) hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ thì N càng lớn nhưng W và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ. Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định trong đó cột đóng vai trò quan trọng. Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ dài cột : Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột đó sẽ có hiệu lực cao hơn. Xác định tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu Trong đó H là chiều cao pic thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ từ dung dịch đối chiếu quy định (pic C). hn là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường nền trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng. Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở chiều cao của pic C và ở điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic C (vị trí của pic thành phần cần quan tâm). Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký Lựa chọn cột (pha tĩnh) Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Đó là các chất rắn, xốp kích thước hạt rất nhỏ đường kính hạt từ 3-10µm, diện tích bề mặt thường từ 50-500m2/g. Trong phương pháp định lượng cetirizin sử dụng sắc ký phân bố nên dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký phân bố. Theo tài liệu mới sắc ký phân bố được chia làm ba loại sau [16, 21]: Sắc ký phân bố pha thuận (Normal phase –HPLC) Sắc lý phân bố pha đảo (Reserse phase –HPLC) Sắc ký pha thuận có sử dụng nước (Aqueous Normal phase) Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ lên bề mặt của pha tĩnh . Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực hơn (ví dụ silicagel) còn pha động không phân cực hexan, heptan, tetrafuran có thể trộn lẫn một lượng nhỏ các dung môi hữu cơ phân cực như isopropanol, ethylacetat, hoặc chloroform. Thời gian lưu của chất phân tích tăng khi độ không phân cực của pha động tăng, chất phân tích là các chất phân cực. Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực (hydrophobic) còn pha động phân cực như H2O hoặc là sự pha trộn của H2O, methanol hoặc acetonitrile Trong sắc ký pha thuận có sử dụng nước đó có thể nói đó là phương pháp có sự kết hợp của cả pha thuận và pha đảo. Cột sử dụng trong loại sắc ký này là cột pha thuận trên bề mặt Si –H, pha động thường sử dụng là acetonitrol hoặc methanol và một lượng nhỏ H2O, pha động này có sự hiện diện cả H2O và yếu tố “normal” ít phân cực hơn pha tĩnh. Thời gian lưu sẽ giảm khi hàm lượng H2O trong pha động tăng. Loại sắc ký này thường áp dụng cho các chất có nhóm cacboxylic, dạng racemic, các chất khá phân cực mà sắc ký pha đảo không đảm nhận được [16, 21]. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC: Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó) Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất. Lựa chọn pha động Pha động là dung môi dung để rửa giải chất tan (chất cần phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là các dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức. Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải tách tốt nhất. Pha động có thể ảnh hưởng tới: Độ chọn lọc của pha động Thời gian lưu giữ của chất tan Hiệu lực tách của cột Độ phân giải của chất tan Độ rộng của pic sắc ký Hình dáng píc sắc ký Vì những lý do trên nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc lựa chọn pha động phù hợp là điều rất quan trọng. Những yếu tố chính cần chú ý trong khi lựa chọn pha động: Bản chất dung môi được lựa chọn Thành phần các chất trong pha động Tốc độ dòng của pha động pH của pha động (đặc biệt với sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion) Những yêu cầu của một pha động: Phải hoàn toàn trơ với pha tĩnh Phải hòa tan được chất mẫu Phải bền vững theo thời gian Các thành phần phải hoàn toàn tinh khiết Nhanh đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký Phù hợp với detector được sử dụng Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường Trong sắc ký pha thuận pha động thường là các dung môi ít phân cực như n- hexan hoặc n-heptan và thường trộn lẫn một lượng nhỏ các chất phân cực như isopropanol, ethylacetat,cloroform,… Trong sắc ký pha đảo thường hệ dung môi là sự pha trộn của nước và các chất phân cực như methanol, acetonitrile, THF…Các hệ dung môi nay có thể hòa tan một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. Trong sắc ký pha thuận có sử dụng H2O pha động thường dùng là acetonitril, methanol và một lượng nhỏ H2O, có thể sử thêm một lượng nhỏ acid để tạo pH thấp. Chọn pH Cơ sở của việc chọn pH phù hợp được trình bày như dưới đây. Trong dung dịch ta có cân bằng sau: [AB] = [A+] + [B-] Theo cân bằng trên khoảng 50% phân tử sẽ bị ion hóa. Quá trình sắc ký có sự phân tách không giống nhau giữa ion và các phân tử trung tính. Các ion sẽ phân tách nhanh hơn khi đó trong dung dịch cân bằng mất đi và các phân tử trung tính sẽ tiếp tục phân chia kết quả pic thu được sẽ bị doãng. Chính vì vậy trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion,sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base. Do pH ảnh hưởng đến quá trình phân ly như vậy nên pH sẽ góp phần làm hiệu quả tách được tốt hơn. Thông thường các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid, tuy nhiên cũng có trường hợp ngoại lệ. Và pH trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp. Tốc độ dòng Sau khi chọn được pha tĩnh, pha động, pH, ta tiến hành chạy và lựa chọn tốc độ dòng. Tốc độ dòng ảnh hưởng tới thời gian lưu, thừa số dung lượng, số đĩa lý thuyết của cột. Ứng dụng của HPLC Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: Định tính Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn trên đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn. Sắc ký điều chế Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và hứng lấy dung dịch rửa giải cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. Định lượng và xác định giới hạn tạp chất Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kĩ thuật HPLC: Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và mẫu chuẩn đều được tiến hành trong cùng một điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn hóa từ một điểm trên dường tuyến tính. Phương pháp chuẩn nội : Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả hai mẫu chuẩn và thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội.Yêu cầu của pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của chất cần phân tích. Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic đáp ứng của chất phân tích và chất chuẩn nội. Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic: Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần. Yêu cầu: Tất cả các thành phần phải được phát hiện và rửa giải hoàn toàn Tất cả các chất có đáp ứng như nhau với detector. Khi đó hàm lượng các chất thành phần được tính theo công thức sau: Tuy vậy sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này của sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp ứng người ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các hệ số đáp ứng của các chất tính theo công thức sau: Trong đó : Sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chất chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. Cc và Cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. fc là hệ số hiệu chỉnh. Khi đó hàm lượng thành phần X tính theo công thức: Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng và thử giới hạn tạp chất trong thuốc. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Chế phẩm thứ nhất (M1): Tên biệt dược: HICET –viên nén bao film 10mg Công ty sản xuất Micro labs limited Số đăng ký: VN -5908-01 Số kiểm soát: 37L49 Số lô : HICH 0007 Hạn dùng: 7/2009 Chế phẩm thứ 2 (M2) Tên biệt dược: CEZIL –viên nén bao phim 10mg Công ty sản xuất Alkem labs Số đăng ký VN-7451-03 Số kiểm soát 37L51 Số lô 6004 EN Hạn dùng 3/2009 PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Hóa chất Sử dụng chất chuẩn của phòng kiểm nghiệm các dạng bào chế –viện kiểm nghiệm Chuẩn cetirizin Hàm lượng trên chế phẩm khô: 99, 22% nguyên trạng Acid H2SO4 1M Acid phosphoric 12,5% Acetonitrile dùng cho HPLC Nước cất dùng cho HPLC Thiết bị, dụng cụ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: MERCH –HITACHI D7000 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT PACKARD 1100 Detector UV: Diod array Detector Máy lắc siêu âm Bransom 5210 Bộ lọc chân không Milipore, màng 0,45µm Whatman Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 độ chính xác 0,1mg Cân phân tích Mettler Toledo AB 245 độ chính xác 0,01mg Bình định mức dung tích 10ml, 20ml, 25ml, 50ml, 100ml Cốc đong 50ml, 100ml, 500ml Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh, phễu lọc Bơm tiêm, lọ đựng mẫu bình pha động, bình cầu các loại, giấy lọc… NỘI DUNG Khảo sát các điều kiện sắc ký Xây dựng chương trình sắc ký cho cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều, bao gồm: Chọn cột sắc ký Chọn pha động Chọn dung môi pha mẫu Detector UV, bước sóng đo Tốc độ dòng Thể tích tiêm Cách xử lý mẫu Đánh giá phương pháp Tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký Xác định độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic Xác định độ lặp lại của phương pháp Xác định độ đúng của phương pháp Ứng dụng định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thực nghiệm để tìm điều kiện sắc ký cho phép phát hiện được cetirizin trong chế phẩm và tách tốt cetirizin với các pic của dung môi và tá dược, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả. Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu Giá trị trung bình : Độ lệch chuẩn : Sai số chuẩn : Sai số tương đối : Sai số tương đối : Cách đánh giá kết quả Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau, hàm lượng của cetirizin trong chế phẩm được tính theo công thức: Trong đó: St và Sc : Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn mc : Lượng chất chuẩn đã cân (mg) C : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%) mv : Khối lượng trung bình viên (g) mt : Khối lượng bột viên đem thử (g) THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng cetirizin trong chế phẩm Nghiên cứu lựa chọn sắc ký Qua tham khảo tài liệu, và các điều kiện cơ sở vật chất sẵn có của phòng hóa lý II - viện kiểm nghiệm, đặc biệt dựa trên những đặc tính của cetirizin. Ta tiến hành lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau: Lựa chọn cột (pha tĩnh) Do Cetirizin có các đặc điểm cấu tạo như sau: Trong phân tử cetirizin có nhóm carboxylic. Dạng dược dụng ngậm 2HCl và tan tốt trong nước. Phân tử cetirizin khá phân cực. Chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp sắc ký mới đó là phương pháp sắc ký pha thuận có nước (Aqueous Normal Phase). Cột sắc ký sử dụng là Silica 5µm có dạng bề mặt hydrid Si-H, đường kính trong 4,6 mm; độ dài cột 25 cm. Lựa chọn pha động: Dựa theo các tài liệu pha động dùng trong sắc ký phân bố pha thuận có nước thường sử dụng ACN hoặc MeOH và một lượng nhỏ nước. Đồng thời trong phương pháp sắc ký pha thuận có dùng H2O này thường sử dụng thêm một số acid. Trên cơ sở đó chúng tôi sơ bộ lựa chọn pha động bao gồm acetonitril và một lượng nhỏ acid. Sau đó khảo sát các điều kiện để tiến hành lựa chọn pha động sao cho phù hợp nhất : Khảo sát 2 acid được sử dụng phổ biến trong kiểm nghiệm là H2SO4 và H3PO4. Hai pha động được sử dụng là: ACN : H2SO4 tỉ lệ (93: 7) trong đó (H2SO4 0,5%) ACN : H3PO4 tỉ lệ (93: 7) trong đó (H3PO4 0,5%) Tiến hành pha mẫu khảo sát: Cân chính xác khoảng 50mg cetirizin chuẩn cho vào bình dung tích 100,0 ml; thêm khoảng 70 ml pha động khuấy siêu âm trong 10 phút, thêm pha động vừa đủ 100,0 ml. Hút chính xác 10ml dung dịch trên pha loãng vừa đủ trong 50 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45µm ta thu được dung dịch dùng để khảo sát. Làm tương tự với hai pha động trên. Kết quả khảo sát pha động chứa acid phosphoric không cho đáp ứng pic hay cetirizin không được rửa giải. Pha động chứa acid sulfuric cho pic đáp ứng cân đối, gọn, đẹp. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ H2O trong pha động. Để xác định ảnh hưởng của tỉ lệ ACN và tỉ lệ H2O trong pha động ta tiến hành khảo sát pha động với hai thành phần ở các tỉ lệ: ACN : dung dịch H2SO4 0,5%( 90 : 10) ACN : dung dịch H2SO4 0,5%(93 : 7) ACN : dung dịch H2SO4 0,5%(95 : 5) ACN : dung dịch H2SO4 0,5% (97 : 3) Kết quả khảo sát đáp ứng pic xảy ra ở các thời gian lưu khác nhau tăng dần tỉ lệ nghịch với lượng H2O có trong pha động. Chúng tôi lựa chọn tỉ lệ 93 :7 là tỉ lệ cho thời gian lưu vừa phải đảm bảo thời gian tiến hành, đồng thời pic cân xứng, gọn đẹp nhất. Kết luận về pha động sử dụng trong chương trình sắc ký Acetonitril dùng cho HPLC Dung dịch H2SO4 0,5% được lọc qua màng 0,45µm Tỉ lệ ACN: H2SO4 (93: 7) Lựa chọn dung môi pha mẫu: Chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi pha mẫu trên 3 loại dung môi khác nhau như sau: Dung môi pha mẫu là H2O, do cetirizin dạng dược dụng ngậm 2HCl tan tốt trong H2O Dung môi là pha động Dung môi là hệ ACN: H2O tỉ lệ 93 : 7 tương ứng như tỉ lệ dung dịch H2SO4 trong pha động Cân chính xác vào mỗi bình dung tích 50,0 ml một lượng bột viên tương ứng khoảng 5mg cetirizin.Cho vào lần lượt các bình khoảng 35 ml dung dịch trên. Sau đó cho đồng thời cả 3 bình vào lắc siêu âm trong 10 phút. Thêm lần lượt vào các bình các dung môi tương ứng đến vạch, lắc kỹ. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu, lọc qua màng 0,45µm thu được các dung dịch để tiêm mẫu Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu, với ba dung môi pha mẫu trên ta đều thu được các sắc đồ có đáp ứng pic tương đương nhau. Chúng tôi quyết định lựa chọn dung môi là H2O vì H2O không cho đáp ứng pic tá dược, sử dụng đơn giản và tiện lợi lại tránh được một phần độc hại do tiếp xúc với acetonitril trong quá trình pha mẫu. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử để tiến hành khảo sát các điều kiện tốc độ dòng, bước sóng. Dung dịch thử: Cân xác định khối lượng trung bình viên của 10 viên chế phẩm, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền tương đương với khoảng 5mg cetirizin, cho vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 35ml H2O lắc siêu âm 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ khoảng 10ml dịch đầu, lọc qua màng 0,45µm thu được dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 70ml H2O, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ (dung dịch 1). Hút chính xác 10ml dung dịch 1 pha loãng bằng H2O vừa đủ 50,0ml thu đựợc dung dịch chuẩn để tiến hành khảo sát. Dung dịch chuẩn này có nồng độ khoảng 0, 1mg/ ml. Lựa chọn tốc độ dòng Tiến hành khảo sát tốc độ dòng với các điều kiện sắc ký như trên, tốc độ dòng thích hợp sao cho thời gian lưu vừa phải, pic của cetirizin tách hoàn toàn khỏi các pic dung môi và tá dược. Kết quả tốc độ dòng là 1,5 ml/phút cho thời gian lưu khoảng 5,4 phút và pic tách rõ ràng, gọn, đẹp. Lựa chọn bước sóng thích hợp. Tiến hành quét phổ UV của chất chuẩn cetirizin ta thu được kết quả cetirizin có độ hấp phụ lớn nhất tại bước sóng 230nm. Đây là bước sóng thích hợp để phát hiện cetirizin trong phương pháp sắc ký trên. Hình 3.1 : Phổ hấp thụ tử ngoại của chất chuẩn cetirizin. Như vậy qua các khảo sát trên chúng tôi lựa chọn phương pháp định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều như sau: Máy sắc ký lỏng Merch- Hitachi D 7000 –VKN/HL II Máy sắc ký lỏng Hewlett Packard 1100 Detector Diod array L – 7455 Bơm L-7100 Cột sắc ký: Adsorbosil silica 5u, độ dài 25 cm, đường kính 4,6 mm. Pha động: Acetonitril: H2SO4 (0,5%) ( 93: 7). Dung môi pha mẫu H2O Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Bước sóng 230nm Thể tích tiêm 20µl Điều kiện nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Với các điều kiện sắc ký trên ta thu được sắc đồ của dung dịch cetirizin chuẩn có nồng độ khoảng 0,1mg/ml như sau: Hình 3.2: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn cetirizin Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ cetirizin khoảng 0,1mg/ml. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết cột, độ lặp lại về thời gian lưu (đại lượng có giá trị định tính ), độ lặp lại của diện tích pic (đại lượng có giá trị về định lượng). Chuẩn bị dung dịch khảo sát Cân chính xác khoảng 50 mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dungtích 100,0ml, thêm khoảng 70ml nước, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10ml dung dịch này pha loãng vừa đủ trong 50ml nước và lọc qua màng 0,45µm. Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (tR) (phút) Diện tích pic(S) (mAU.min) 1 5,433 3426,4 2 5,436 3454,7 3 5,431 3404,6 4 5,428 3403,3 5 5,432 3412,5 6 5,418 3455,2 Trung bình 5,430 3426,1 RSD 0,12% 0,69% Số đĩa lý thuyết N =9056 Hệ số bất đối : AF =1,04 Nhận xét: RSD về thời gian lưu là 0,12%, RSD về diện tích pic là 0,76%, có số đĩa lý thuyết N= 9056, AF = 1,04. Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký trên đảm bảo được tính thích hợp của hệ thống với việc phân tích định tính và định lượng thành phần cetirizin trong các chế phẩm rắn phân liều. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng trên chất chuẩn cetirizin bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn cetirizin có nồng độ biến thiên từ 0,01mg/ml đến 0,5g/ml. Khoảng tuyến tính này lựa chọn trên cơ sở sau: Nồng độ khi pha dung dịch trực tiếp từ lượng chất cân trên cân phân tích mà đảm bảo sai số có thể chấp nhận được. Chế phẩm cetirizin với lượng hoạt chất 10mg/viên, khi thử độ hòa tan 10mg /1000ml đảm bảo pic phát hiện được. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ bằng phương pháp hồi quy tuyến tính. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của chất cần định lượng được trình bày ở bảng 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất cần định lượng được thể hiện hình 3.3. Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 1 2 3 4 5 6 Nồng độ (mg/ml) 0,01 0,03 0,05 0,10 0,25 0,50 Diện tích pic(mAU.min) 336,9 1007,2 1660,1 3359,2 8533,3 16605,1 Phương trình hồi quy: y = 33307,18x+32,1754 Hệ số tương quan: R= 0,9999 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ của cetirizin. Nhận xét: Từ kết quả thu được cho thấy trong một khoảng nồng độ khảo sát khá rộng, nồng độ cetirizin từ 0,01 mg/ml đến 0,5 mg/ml, gấp 50 lần. Ta thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng với hệ số tương quan rất gần 1, chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic. Trên cơ sở đó chúng tôi đã lựa chọn nồng độ để định lượng chế phẩm có chứa cetirizin là: cetirizin có nồng độ khoảng 0,1mg/ml Khảo sát độ lặp lại của phương pháp Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên 2 mẫu M1 và M2. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 thí nghiệm trên mỗi mẫu. Tiến hành pha các mẫu chuẩn và thử như sau: Dung dịch thử Cân 1 lượng bột viên tương ứng khoảng 5mg cetirizin cho vào bình định mức dung tích 50,0ml thêm khoảng 35ml nước lắc siêu âm trong 10 phút, thêm nước vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lọc qua màng lọc 0,45µm .Với mỗi mẫu thử ta làm như vậy với 6 lần cân khác nhau .Khi đó ta được các dung dịch thử của chế phẩm các mẫu có nồng độ 0,1mg/ml Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0mg chất c