Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp

C là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần tinh bột cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp. Tiến hành thí nghiệm với α-amylase để dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp với nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau, số liệu được thể hiện ở bảng 4.3 Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh bột nếp đến lượng đường khử tạo thành, (g/100ml) Nồng độ enzyme (%) Thời gian (phút) Trung bình (Nồng độ) 10 20 30 40 0,1 4,65 5,16 5,12 5,31 5,06c 0,2 5,06 5,42 5,65 5,84 5,49b 0,3 5,22 5,60 6,11 6,18 5,78a 0,4 5,06 5,48 6,32 6,32 5,80a Trung bình (Thời gian) 5,00C 5,42B 5,80A 5,91A Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C (a, b, c) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (a) (b) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 50 Để quá trình dịch hóa, đường hóa xảy ra nhanh và hiệu quả, các thông số pH tối ưu pH 6,5 và nhiệt độ tối thích 870C được kế thừa từ thí nghiệm 4.2.1. Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme khi phân cắt tinh bột nếp 0.1 0.2 0.3 0.4 10 20 30 40 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Đ ư ờ n g k h ử ( w /v ) Nồng độ alphamylase (v/v) Thời gian (phút) Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp đến lượng đường khử tạo thành Tiến hành dịch hóa, đường hóa tinh bột là công đoạn không thể thiếu đối với công nghệ sản xuất rượu, trong giai đoạn này enzyme sẽ phân cắt tinh bột thành những phân tử dextrin mạch ngắn và đường khử, vì vậy chỉ tiêu được quan tâm nhiều nhất trong thí nghiệm là lượng đường khử sinh ra, loại đường chủ yếu được nấm men sử dụng để phát triển sinh khối và lên men rượu. Qua kết quả thống kê bảng 4.3 và hình 4.3 nhận thấy với cùng nồng độ tinh bột nếp, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân, chỉ có thay đổi nồng độ enzyme α-amylase thì lượng đường khử tạo thành cũng khác nhau, hàm lượng đường khử sẽ tăng nếu tăng nồng độ enzyme sử dụng nhưng không đều. Hàm lượng đường khử tăng nhiều khi nồng độ enzyme α-amylase tăng từ 0,1%, 0,2%, 0,3% có sự khác biệt ý nghĩa thống kê và tăng chậm khi nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,4% không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Bên cạnh ảnh hưởng nhân tố nồng độ enzyme, theo số liệu thể hiện ở bảng 4.3 và hình 4.3 còn cho thấy lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo thời gian thủy phân, lượng đường khử tăng nhanh trong khoảng thời gian 10 phút đến 30 phút và tăng chậm trong khoảng thời gian 30 phút đến 40 phút. Kết quả thống kê cho thấy, ở các mức thời gian thủy phân 10, 20, 30 phút thì lượng đường khử sinh ra có sự khác biệt ý nghĩa nhưng Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 51 ở khoảng 30 và 40 phút thì lượng đường khử sinh ra không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Z= 0,209885*Y + 21,6977*X – 0,0864364*X*Y – 32,3212*X2- 0,00296129*Y2; R 2 = 99,41% Ghi chú X: Nồng độ enzyme α-amylase (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%) Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành. Theo đồ thị 3D hình 4.4.a thể hiện sự phụ thuộc của hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme và thời gian dịch hóa, đường hóa một phần. Đường khử sinh ra tăng theo nồng độ enzyme và thời gian thủy phân. Đồng thời đồ thị Contour hình 4.4.b còn cho phép chọn điểm tối ưu về nồng độ enzyme và thời gian cho quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng. Từ các số liệu ở bảng 4.3 và hình 4.3 cùng hình 4.4.a, 4.4.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, có thể nhận thấy rằng nồng độ enzyme α-amylase 0,3 % và thời gian thủy phân 31 phút với lượng đường khử thu được 6,46% là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng với mục tiêu là xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân với enzyme α-amylase Cơ chất bột nếp (%) 5 10 15 20 25 30 35 40 Đường khử (%) 1,80f 3,05e 4,61c 6,11d 7,06c 8,13b 9,42a 9,59a Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (a) (b) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 52 Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ enzyme sử dụng là 0,3%, thời gian thủy phân là 31 phút, ở pH 6,5 và nhiệt độ 87oC với tỉ lệ bột nếp thay đổi từ 5 đến 40% 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 0 10 20 30 40 50 Nồng độ bột nếp (w/v) Đ ư ờ n g k h ử ( w /v ) Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.4 và hình 4.5 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột nếp thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến 30%. Khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tinh bột thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất và đạt đến điểm cực đại nghĩa là toàn bộ enzyme kết hợp được với cơ chất. Khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lớn hơn nữa thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ không tăng đáng kể do nồng độ tinh bột quá cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gây khó khăn cho hoạt động xúc tác của enzyme nên hàm lượng đường khử sinh ra không tăng nhiều. 4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng. Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các loại đường và dextrin để tạo thành C2H5OH và CO2, để thực hiện được điều đó thì phải trải qua từng công đoạn: hồ hóa, dịch hóa và đường hóa để tạo thành đường khử. Tuy nhiên nếu chỉ đơn thuần sử dụng α-amylase thì lượng đường khử tạo thành không cao thể hiện ở kết quả thí nghiệm 4.2.2 (Đường khử: 6,11% ở pH: 6,5, nhiệt độ: 85oC, nồng độ enzyme: 0,3%, Thời gian: 30 phút, tỉ lệ 1 nếp: 4 nước). Bên cạnh đó lượng tinh bột còn sót lại 1,95% trong dịch nếp sau khi thủy phân (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010). Nguyên nhân là do khi chỉ sử dụng enzyme α-amylase phân cắt các phân tử amylose và amylopectin trong tinh bột sẽ tạo thành nhiều sản phẩm: Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 53 oligosaccharides, disaccharides và monosaccharide (Đường khử). Trong đó đường khử do α-amylase đã cắt gần hết các liên kết 1,4 glycoside, phần còn lại là các phân tử dextrin mạch nhánh có liên kết 1,6 glycoside mà enzyme α-amylase thì không cắt được liên kết 1,6 glycoside. Với hàm lượng đường khử như thế, quá trình lên men diễn ra không tốt do không đủ lượng đường khử cho nấm men sử dụng, thể hiện ở độ rượu thu được khi lên men chỉ khoảng 3% (Trần Thị Hồng Chúc, 2008), chính vì thế để tăng thêm hàm lượng đường khử cho nấm men hoạt động tốt hơn, năng suất rượu cao hơn, vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao hiệu suất lên men? Khi đó một trong những giải pháp hiệu quả được đặt ra là sử dụng kết hợp tiếp theo sau glucoamylase để thủy phân các polysaccharides, oligosaccharides, disaccharides còn lại vì enzyme này có khả năng phân cắt được liên kết 1,4 glycoside và cả liên kết 1,6 glycoside. 4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp trắng. Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 những thông số: pH, nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme α-amylase được cố định sử dụng tiếp theo để tiến hành khảo sát ảnh hưởng các mức pH và nhiệt độ của dịch nếp để thủy phân tiếp bằng enzyme glucoamylase đến lượng đường khử sinh ra, số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme glucoamylase, (g/100ml) pH dịch nếp Nhiệt độ thuỷ phân (oC) Trung bình (pH) 55 60 65 70 3,5 14,36 14,56 14,36 13,28 14,14b 4,0 14,56 15,88 14,97 14,56 14,93a 4,5 14,16 14,75 14,36 14,16 14,36b 5,0 13,43 13,79 13,60 13,62 13,61c Trung bình (Nhiệt độ) 14,13BC 14,68A 14,32B 13,91C Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C (a, b, c) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.5 cho thấy hai nhân tố pH và nhiệt độ đều có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân tinh bột nếp đã được dịch hóa và đường hóa một phần trước bằng enzyme α-amylase Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 54 55 60 65 70 3,5 4 4.5 5.0 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 Đ ư ờ n g k h ử ( w /v ) Nhiệt độ (oC) pH Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase Theo kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5 và hình 4.6 cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 55oC đến 60oC lượng đường khử sinh ra tăng nhưng từ 65oC đến 70oC thì lượng đường khử tạo thành không tăng nữa mà lại còn giảm. Trong 4 mức nhiệt độ trên thì lượng đường khử sinh ra khi thủy phân tinh bột nếp với nhiệt độ 60oC là cao nhất và thấp nhất ở 70oC và 55oC, về mặt thống kê cho thấy lượng đường khử sinh ra 4 mức nhiệt độ có khác biệt ý nghĩa ở mức 5%. Theo số liệu thí nghiệm cho thấy bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme thì giá trị pH cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme glucoamylase, khi thủy phân dịch nếp với giá trị pH 4,0 thì hàm lượng đường khử sinh ra cao nhất và ở pH 5,0 lượng đường khử tạo thành là nhỏ nhất. Xét về mặt thống kê cho thấy hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở pH 3,5 và 4,5 là không có khác biệt ý nghĩa. Hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở các mức giá trị pH có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Số liệu thí nghiệm đạt được hoàn toàn phù hợp với thông tin cung cấp từ nhà sản xuất enzyme (Novo Nordisk, 2007) vì glucoamylase được sản xuất từ Aspergillus niger có khoảng pH hoạt động tối thích từ 3,5 ÷ 4,5 và với giá trị pH càng cao thì hoạt tính enzyme glucoamylase càng giảm. Điều này còn phù hợp với lý thuyết vì hầu hết các enzyme glucoamylase có tính acid và hoạt động thích hợp ở pH thấp (Nguyễn Đức Lượng, 2006). Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 55 Z = 0,135225*X + 5,73466*Y + 0,0725998*Y*X -1,26061*Y2 - 0.00372956*X2; R2 = 99,92 % Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (oC), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng đường khử (%) Hình 4.7 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase Với kết quả thí nghiệm ở bảng 4.5 và hình 4.6 cùng đồ thị 3D hình 4.7.a và đồ thị Contour hình 4.7.b nhận thấy có ảnh hưởng lớn của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp tiếp bằng enzyme glucoamylase có giá trị cao nhất ở pH 4 và nhiệt độ 61oC là 2 thông số tối ưu để tiến hành đường hóa cho các thí nghiệm tiếp theo sau. 4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng. Khi bổ sung enzyme glucoamylase vào dịch nếp trong quá trình đường hóa thì hàm lượng đường khử tăng lên đáng kể. Số liệu thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra, (g/100ml) Nồng độ enzyme (%) Thời gian (phút) Trung bình (Nồng độ) 10 20 30 40 0,4 13,11 13,79 14,16 14,36 13,85c 0,5 13,60 14,36 14,97 15,18 14,52b 0,6 14,36 14,75 15,88 16,13 15,28a 0,7 14,16 14,56 15,88 16,13 15,18a Trung bình (Thời gian) 13,81C 14,36B 15,22A 15,45A Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C (a, b, c) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (a) (b) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 56 Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.6 cho thấy: nồng độ enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của glucoamylase trong quá trình đường hóa. Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thuỷ phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra Từ kết quả thống kê ở bảng 4.6 và hình 4.8 thể hiện hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ở nồng độ 0,4% và 0,5% có khác biệt thống kê, nhưng giữa nồng độ 0,6% và 0,7% thì lượng đường khử sinh ra tăng không đáng kể, không có khác biệt thống kê ở ý nghĩa 5%. Điều này có thể giải thích ứng với nồng độ glucoamylase thấp thì chưa đủ lượng enzyme để phân cắt hết các cơ chất như: polysaccharides, oligosaccharides, disaccharides sau khi được thủy phân bởi enzyme α-amylase. Nhưng khi tăng nồng độ enzyme glucoamylase sử dụng thì tốc độ phản ứng thủy phân sẽ tăng vì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn, nhưng tăng đến một giới hạn nhất định thì sự tăng này không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Ở nồng độ enzyme glucoamylase 0,6% cho thấy lượng tinh bột còn sót lại là 1,86% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM,2010) vì tinh bột vẫn tiếp tục được phân cắt nếu sử dụng tiếp glucoamylase nhằm tăng thêm lượng đường khử. Đối với yếu tố thời gian thủy phân, khi đường hóa dịch nếp thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo thời gian hoạt động của enzyme glucoamylase. Điều này có thể lý giải, khi thời gian thủy phân đủ dài thì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn và hiệu quả phân cắt các liên kết trong chuỗi polysaccharides, oligosaccharides và disaccharides triệt để hơn, nên lượng đường khử thu được sẽ cao hơn. Tuy nhiên, về mặt thống kê thì hàm lượng đường khử thu nhận được không có sự khác biệt ý nghĩa khi thủy phân ở 30 phút và 40 phút vì khi kéo dài thời gian nhưng 0.4 0.5 0.6 0.7 10 20 30 40 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Đ ư ờ n g k h ử ( w /v ) Nồng độ glucoamylase (v/v) Thời gian (phút) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 57 lượng cơ chất còn lại không nhiều nên lượng đường khử sinh ra tăng lên không đáng kể. Đường khử thu được khi thủy phân ở 10 phút, 20 phút so với 30 phút và 40 phút thì có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Z = 44,0201*X+ 0,0865722*Y + 0,052097*Y*X-0,00112331*Y2-36,6521*X2; R2 = 99,94 % Ghi chú X: Nồng độ enzyme glucoamylase (v/v), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%) Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành Số liệu thể hiện ở bảng 4.6 và hình 4.8 cùng đồ thị 3D hình 4.9.a với đồ thị Countour hình 4.9.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, cho thấy nồng độ enzyme glucoamylase 0,6% và thời gian 39 phút lượng đường khử thu được 16,10% là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình đường hóa cho các thí nghiệm sau. 4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng đã được thuỷ phân trước bằng enzyme α-amylase với mục tiêu là xác định ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme glucoamylase, thực hiện thí nghiệm với các nồng độ bột nếp thay đổi từ 5% đến 40% (w/v) cùng với các thông số tối ưu đạt được từ thí nghiệm 4.3.1, 4.3.2 như nồng độ enzyme được sử dụng là 0,6% và thời gian thủy phân là 39 phút, pH 4, nhiệt độ 61oC. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.7 Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase Tỉ lệ bột nếp (%) 5 10 15 20 25 30 35 40 Đường khử (%) 4,03g 7,94f 11,67e 15,88d 18,52c 22,45b 26,18a 26,59a Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại Số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.7 và hình 4.10 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Nhưng vận tốc phản ứng chỉ tăng nhanh khi tăng nồng độ tinh bột từ 5% đến 30%, (a) (b) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 58 cho đến khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng, song tốc độ tăng chậm hơn so với trước có thể do lượng enzyme đã liên kết với cơ chất gần hết nếu tiếp tục tăng tỉ lệ bột nếp thì tốc độ phản ứng vẫn không tăng nữa. 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 Nồng độ nếp (w/v) Đ ư ờ n g k h ử ( w /v ) Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân với enzyme glucoamylase Sau khi khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột trong nguyên liệu nếp, tiến hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2% (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm rượu (ĐC) sẽ được so sánh với rượu lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng men thuốc bắc (TB) và rượu lên men từ dịch nếp có bổ sung thêm papain (PA) hoặc bromelain (BR), kết quả được thể hiện ở thí nghiệm 4.6. 4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase. Nấm men Saccharomyces cerevesiae chỉ có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin tự do, peptide), vitamin và các nguyên tố vi lượng qua màng tế bào trong quá trình phát triển sinh khối và lên men rượu. Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển sinh khối và chuyển hoá thành rượu của nấm men được tiến hành. Nhưng nấm men cần phải được cung cấp thêm từ môi trường nguồn nitơ ở dạng hòa tan có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn nitơ dạng hữu cơ thường dùng là acid amin tự do, pepton, amid, urê, đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Chính vì thế thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu thủy phân protein trong nguyên liệu nếp 7,93% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM) để tăng thêm lượng acid amin tự do và peptide mạch ngắn cho Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 59 nấm men phát triển tốt hơn và tạo ra sản phẩm rượu chất lượng cao hơn với màu vàng nhạt (phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin), độ trong và mùi, vị đặc trưng cho rượu vang nếp. 4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 và 4.3 các thông số được cố định sử dụng tiếp để tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ thủy phân của enzyme papain đến lượng nitơ amin tạo thành. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8 như sau: Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain, (g/100g). pH dịch nếp Nhiệt độ thuỷ phân (oC) Trung bình (pH) 40 45 50 55 5,0 0,0636 0,0702 0,0724 0,0714 0,0694c 5,5 0,0687 0,0747 0,0796 0,0743 0,0743b 6,0 0,0719 0,0780 0,0826 0,0781 0,0777a 6,5 0,0680 0,0736 0,0758 0,0747 0,0730b Trung bình (Nhiệt độ) 0,0681C 0,0741B 0,0776A 0,0746B Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C (a, b, c) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại 40 45 50 55 5 5.5 6 6.5 0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600 0.0700 0.0800 0.0900 N it ơ a m in ( w /w ) Nhiệt độ (oC) pH Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 60 Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và đồ thị hình 4.11 cho thấy nhiệt độ thủy phân và pH dịch nếp có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain. Đối với nhân tố nhiệt độ: Khi tiến hành thủy phân protein trong dịch nếp ở nhiệt độ 50oC thì lượng nitơ amin sinh ra là cao nhất và thấp nhất ở nhiệt độ 40oC, giữa các mức nhiệt độ 40oC, 45oC, 50oC và 55oC lượng nitơ amin sinh ra đều có khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Bên cạnh thông số nhiệt độ thì yếu tố pH dịch nếp cũng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme papain, ở pH 6,0 lượng nitơ amin tạo thành là cao nhất và pH 5,0 là thấp nhất, giữa các mức pH 5,0, 5,5, 6,0 và 6,5 cho thấy lượng nitơ amin tạo thành đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Z = -0,487917 + 0,00928307*X + 0,113975*Y -0,0000366*Y*X – 0,0095125*Y2 – 0,000090625*X2; R2 = 99,75 % Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng nitơ amin (%) Hình 4.12 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain. Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và hình 4.11 cùng đồ thị 3D hình 4.12.a, với đồ thị Contour hình 4.12.b cho thấy hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi phân cắt protein trong dịch nếp có giá trị cao nhất ở pH 5,9 và nhiệt độ 500C điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về điều kiện tối thích cho enzyme papain có nguồn gốc từ đu đủ. Do đó, chế độ nhiệt độ 500C và pH 5,9 là 2 thông số tối ưu để enzyme papain thủy phân protein trong dịch nếp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp. Kế thừa số liệu pH và nhiệt độ tối ưu đạt từ thí nghiệm 4.4.1 tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân đến khả năng phân cắt protein trong dịch nếp trắng thông qua hàm lượng nitơ amin sinh ra. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9: (a) (b) Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 61 Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng, (g/100g). Nồng độ enzyme (%) Thời gian thủy phân (phút) Trung bình (Nồng độ) 20 30 40 50 0,1 0,0568 0,0651 0,0690 0,0695 0,0651c 0,2 0,0641 0,0675 0,0718 0,0747 0,0695b 0,3 0,0668 0,0684 0,0812 0,0816 0,0745a 0,4 0,0671 0,0704 0,0819 0,0820 0,0754a Trung bình (Thời gian) 0,0637C 0,0678B 0,0760A 0,0769A Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C (a, b, c) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.9 cho thấy nồng độ enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến hàm lượng nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng Theo số liệu thống kê được thể hiện ở bảng 4.9 và hình 4.13 cho thấy khi cùng nồng độ cơ chất bột nếp, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân với các mức nồng độ papain khác nhau thì lượng nitơ amin tạo thành cũng sẽ khác nhau. Ở nồng độ enzyme papain 0.1 0.2 0.3 0.4 20 30 40 50 0.0000 0.0100 0.