Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dƣơng Văn Hợp Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền Viện Chăn nuôi I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi quan tâm. Nó giúp thức ăn cho động vật không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng trong thời gian dài. Bảo quản thức ăn cho gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra là một phương pháp bảo quản được nhiều quốc gia trên thế giới ứng dụng. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình lên men hiệu quả hơn. Phân loại bằng sinh học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit lactic góp phần quan trọng trong việc lựa chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an toàn về mặt sinh học. II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguồn vi sinh vật Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước bún. - Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi, Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội 2.1.2. Môi trường nghiên cứu - Môi trường MRS thạch (g/l): Glucoza- 20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0; CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28; Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121oC/15 phút. - Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO3. - Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0; Pepton- 5,0; NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1 lít; pH 7,0; khử trùng 121oC/15 phút. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng - Định lượng axit theo Therner (Emanuel và cộng sự, 2005) - Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989) 2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic - Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972) - Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men đồng hình; chịu nhiệt; kháng khuẩn; sinh bacterioxin; sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất (tinh bột, casein, pectin, xylan, CMC) và khả năng đối kháng theo các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1972). 2.2.3. Phương pháp phân loại - Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá (Kozaki et al., 1992) - Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 2 Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Sakiyama và cộng sự (2009). Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động (ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer- Mỹ). Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal X của Thompson và cộng sự, 1997. Các trình tự được so sánh với trình tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein, 1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình 3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà, nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2 ngày ở nhiệt độ 30oC. 3.1.2. Tuyển chọn các vi khuẩn lactic - Xác định khả năng sinh axit lên men đồng hình của các vi khuẩn phân lập Các chủng phân lập được nuôi trên môi trường MRS dịch thể có đặt ống Durham. Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng phân lập có 131 chủng không sinh khí trong ống Durham là lên men đồng hình. - Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi khuẩn sinh axit Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động phải có khả năng sinh trưởng được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động vật. Dựa vào tiêu chí này, 131 chủng lên men đồng hình được nuôi trên môi trường MRS ở 37oC và đã lựa chọn được 70 chủng có khả năng phát triển tốt tại nhiệt độ này dùng cho nghiên cứu tiếp theo. - Xác định khả năng sản sinh axit của các vi khuẩn sinh axit Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của dịch nuôi cấy được xác định. Kết quả cho thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ 20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19 mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit từ 8-14 mg/ml. - Xác định khả năng sản sinh axit lactic và kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn Để xác định khả năng sinh axit lactic của 18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi cấy của các chủng này được định lượng axit lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng thời cũng xác định khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh. Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M. luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20- 34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm. Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi các chủng nghiên cứu cũng được xác định. Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm định. Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn kiểm định. Kích thước vòng kháng (D-d) đối với E. coli từ 8-12 mm, M. luteus từ 2-6 mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella flexneri 10-12 mm. Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn (2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm tra một số đặc tính sinh học và tiến hành phân loại. - Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng lựa chọn Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi trường MRS trong 3 ngày ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có chứa các cơ chất. Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 3 Khả năng sinh enzyme được đánh giá qua vòng phân giải cơ chất. Bảng 1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải cơ chất của dịch nuôi vi khuẩn STT Ký hiệu chủng Hoạt tính enzym (D-d, mm) Amylase CMC-ase Pectinase Protease Xylanase 1. 1 2-9 9 12 8 8 13 2. 2 2-10 7 10 0 0 12 3. 3 3-5 8 10 11 5 11 4. 4 3-10 9 8 3 7 10 5. 5 4-14 9 10 9 6 10 6. 6 8-10 7 9 0 8 12 7. 7 9-17 13 11 6 12 13 8 L01 0 0 0 0 0 Chú thích: D-Đường kính vòng phân giải, d- Đường kính lỗ khoan (5 mm) Kết quả bảng trên cho thấy 7 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh các enzym ngoại bào phân giải các cơ chất (trừ chủng L01). Như vậy, ngoài khả năng sinh axit cao, các chủng nghiên cứu còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải các cơ chất có trong thành phần ủ thức ăn chăn nuôi. - Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng lựa chọn Tám chủng nghiên cứu được nuôi trên môi trường MRS bằng phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng với nhau. Sau 3 ngày, ở nhiệt độ 37oC, ở tất cả các mẫu đều sinh trưởng tốt. Kết quả này cho thấy 8 chủng không đối kháng nhau và hoàn toàn có thể được sử dụng kết hợp với nhau trong quá trình lên men chế biến thức ăn gia súc. 3.2. Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn 3.2.1. Xác định trình tự 16S ADNr và xây dựng cây phân loại ADN hệ gen của 8 chủng nghiên cứu được tách chiết. Đoạn gen mã cho ARNr 16S được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phổ biến 27F và 1525R, sau đó được tinh sạch và dùng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với các mồi xuôi và mồi ngược. Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank bằng công cụ Blast Search để xác định đến tên loài. Trình tự ADNr 16S của 8 chủng nghiên cứu được xác định. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400 bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với các loài đó biết thuộc các chi Enterococcus và Lactobacillus. Pediococcus acidilactici được sử dụng làm nhóm ngoài. Quan sát trên cây phả hệ, có 7 chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum (Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum); chủng L01 tạo nhánh khác cùng vị trí với Enterococcus lactis (hình 1). So sánh trình tự ADNr 16S của các chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài đã biết cho thấy: 7 chủng 2-9, 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17 có mức tương đồng 99,7-100 % với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum; chủng L01 có mức tương đồng 99,9 % với Enterococcus lactis. Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 4 Hình 1. Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần 3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn Qua nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 8 chủng vi khuẩn cho thấy tất cả 08 chủng này đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính, không có khả năng di động, lên men đồng hình, có khả năng đông tụ sữa, sinh trưởng ở pH 4-8,5; nhiệt độ 20- 40 oC và nồng độ muối 0-8%. Hình thái tế bào có 2 dạng: hình que (chủng 2-9, 2-10, 3- 5, 3-10, 4-14, 8-4 và 9-17) và hình cầu (chủng L01). Các chủng có khả năng lên men và tạo axit từ các nguồn cacbon: glucose, L-arabinose, D-fructose, galactose (trừ chủng 4-14), D-lactose (trừ chủng 8- 10), maltose, D-mannitol, D-raffinose (trừ chủng 4-14), D-ribose, sucrose, D-sorbitol, và trehalose (trừ chủng 4-14 và 8-10). Sáu trong số các chủng nghiên cứu không lên men từ các nguồn glycerol và D-xylose (trừ chủng 2-9 và L01). Chưa thể kết luận được 7 chủng nghiên cứu có tế bào hình que thuộc chính xác loài nào nếu chỉ dựa trên trình tự gen 16S rRNA vì chúng có độ tương đồng là 99.7% -100% so với các loài thuộc nhóm Lactobacillus plantarum. Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu trước đây, L. pentosus thường lên men glycerol và xylose trong khi L. plantarum và L. paraplantarum không lên men các nguồn này (Kandler & Weiss, 1986; Zanoni và cộng sự, 1987; Swezey và cộng sự, 2000; Bringel và cộng sự, 1996; Curk và cộng sự, 1996). Khác với L. plantarum, L. paraplantarum thường không đồng hóa arabinose và sorbitol (Curk và cộng sự, Pediococcus acidilactici_ EF059987 Lactobacillus brevis_M58810 Lactobacillus acidifarinae_AJ632158 Lactobacillus parabuchneri_AB205056 100 Lactobacillus malefermentans_AM113783 54 Lactobacillus versmoldensis_AJ496791 Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556 Lactobacillus paraplantarum_AJ306297 3-10 Lactobacillus plantarum_AJ965482 Lactobacillus pentosus_D79211 64 4-14 9-17 2-9 3-5 8-10 56 2-10 75 63 72 66 72 62 100 53 Enterococcus lactis_DQ255948 L01 Enterococcus faecium_AJ301830 86 Enterococcus durans_AJ276354 Enterococcus hirae_Y17302 94 64 Enterococcus mundtii_AF061013 82 Enterococcus pseudoavium_ AF061002 98 Enterococcus gallinarum_ AF039900 Enterococcus faecalis_AB012212 54 56 52 100 55 0.02 Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 5 1996). Kết hợp các đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm sinh lý, sinh hoá có thể xếp chủng 2-9 thuộc loài Lactobacillus pentosus. Các chủng 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17 thuộc loài Lactobacillus plantarum. Chủng L01 có tế bào hình cầu, có các đặc điểm thuộc loài Enterococcus lactis. Hình 2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng 2-9 nuôi 2 ngày trên môi trường MRS Các chủng được lựa chọn đều là những chủng vi sinh vật an toàn, không gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh vật được AAFCO (American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế biến thức ăn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội. Bevilacqua A.E., Califano A.N. (1989). Determination of organic acids in dairy products by high performance liquid chromatography. J. Food Sci. 54: 1076- 1079 (1989). Bringel, F., Curk, M. C. & Hubert, J. C. (1996). Characterization of lactobacilli by Southern-type hybridization with a Lactobacillus plantarum pyrDFE probe. Int J Syst Bacteriol 46: 588–594. Curk M.C., Hubert J.C. & Bringel F. (1996). Lactobacillus paraplantarum sp. nov., a new species related to Lactobacillus plantarum. Int J Syst Bacteriol 46: 595–598. Emanuel, V., Adrian, V., Ovidiu, P., Gheorghe, C. (2005). Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology 4(5): 403-408. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791 Kandler O. & Weiss N. (1986). Regular, nonsporing Gram-positive rods. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, pp. 1208–1234. Edited by P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe & J. G. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins. Kimura M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16: 111-120. Kozaki M., Uchimura T. & Okada S. (1992). Experimental manual of lactic acid bacteria. Asakurasyoten, Tokyo, Japan. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor- joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406-425. Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010 J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 6 Sakiyama, Y., Nguyen, K. N. T., Nguyen, M. G., Miyadoh, S., Duong, V. H. & Ando, K. (2009). Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam. Int J Syst Evol Microbiol 59: 550-554. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. & Higgins D.G. (1997). The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool. Nucleic Acids Res 25: 4876-4882. Swezey J.L., Nakamura L.K., Abbott T. P. & Peterson R. E. (2000). Lactobacillus arizonensis sp. nov., isolated from jojoba meal. Int J Syst Evol Microbiol 50: 1803-1809. Zanoni, P., Farrow, J. A. E., Phillips, B. A. & Collins, M. D. (1987). Lactobacillus pentosus (Fred, Petersen, and Anderson) sp. nov., nom. rev. Int J Syst Bacteriol 37: 339-341. SUMMARY ISOLATION AND SCREENING OF LACTIC BACTERIA USED IN FOOD PROCESSING AND PRESERVATION OF FORAGES AND AGRICULTURAL RESIDUES FOR RUMINANTS Dao Thi Luong, Nguyen Thi Anh Đao, Nguyen Thi Kim Quy, Tran Thi Le Quyen, Duong Van Hop Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi Tran Quoc Viet, Ninh Thi Len, Bui Thị Thu Huyen National Institute of Animal Husbandry 134 bacterial strains were isolated from natural fermentating resources. Based on the ability of the homofermentation, heat resistance, the lactic acid, bacteriocin and extracellular enzyme production, 8 strains (2-9, 2-10, 3-5; 3 -10; 4-4, 8-10, 9-17 and L10) were selected. Based on the morphological, physiological and biochemical characteristics and the sequence analysis of 16S rDNA, the strain 2-9 was identified as Lactobacillus pentosus; strains 2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4 and 9-17 belong to Lactobacillus plantarum and strain L01 is considered Enterococcus lactis. These strains are safe microorganisms, without causing disease and very popularly used in probiotic preparations. Lời cảm ơn Công trình được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài ”Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phụ phế phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Các tác giả xin cảm ơn GS. TS. Phạm Văn Ty đã đọc và góp ý cho bản thảo.