Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization)

Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization) 1 Khái niệm Thụ tinh là quá trình kết hợp tế bào tinh trùng với tế bào trứng để tạo ra một tế bào mới gọi là " hợp tử ", hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể mới. Quá trình kết hợp này thường xẩy ra trong cơ thể mẹ và tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng. Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization - IVF) là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí nghiệm (trong hộp lồng, hộp petri). Tuy xảy ra ngoài cơ thể, nhưng các điều kiện cho quá trình IVF như môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt .v.v... cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải giống như trong cơ thể mẹ. ý nghĩa của IVF: - Khai thác được tiềm năng sinh sản ở những gia súc cái cao sản, đặc biệt với những con cao sản nhưng vì lý do nào đó bị loại thải. - Cung cấp vật liệu và làm cơ sở cho những nghiên cứu, lai ghép phôi, chuyển cấy gen, cắt phôi nhân phôi .v.v . . . - Giúp cho việc đánh giá con vật sớm hơn (rút ngắn được khoảng cách thế hệ). - Tạo nhiều phôi, giá rẻ từ đó giảm giá thành công nghệ phôi, thành lập ngân hàng phôi, trứng và làm cơ sở cho việc bảo tồn, lưu giữ phục hồi lại các giống gia súc và các độngvật quý hiếm nhưng ít có giá trị về kinh tế. - Khắc phục tình trạng vô sinh ở các con cái tốt, có buồng trứng hoạt động bình thường nhưng bị tắc ống dẫn trứng hoặc do điều kiện nào đó mà trứng và tinh trùng không gặp nhau được ở trong cơ thể. IVF được tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier và cộng sự (1954), sau đó là Thibault và Dauzier (1960, 1961). Kỹ thuật này được Brackett áp dụng và phát triển vào chăn nuôi bò từ 1981. Từ đó, IVF được nghiên cứu và ứng dụng rộng trong những nước chăn nuôi phát triển (Mỹ, Pháp, Anh, Nhật, Đức...). Các bảng dưới đây phản ánh một phần lịch sử phát triển và mức độ thành công củaIVF. Bảng 1. Một số động vật đã được IVF Độ ng I VF Kết quả Độ ng I VF Kết quả vật T ạo phôi S au cấy phôi vật T ạo phôi S au cấy phôi Th ỏ + + + Bò + + + Ch uột + + + Lợ n + + + Ng ười * + + + Cừ u + + + Mè + + - Ng + + + o /- ựa Ch ó + - - * Đến nay đã có trên 10.000 em bé được ra đời bằng kỹ thuật IVF. Ca đầu tiên thành công năm 1978 ở Anh (do Steptoe và Edward tiến hành). ở Việt Nam , ngày 30/4/1998, 3 em bé đã ra đời nhờ IVF (đến nay đã lên đến vài chục em). Bảng 2. Những kết quả đầu tiên về IVF ở động vật Độn g vật Nă m Tác giả Độ ng vật Nă m Tác giả Thỏ 195 4-1959 Dauzier, Thibault Chang Bò 19 82 Brak et và cs. Chu ột túi má 196 3 Yanagim athi và Chang Dê 19 81 Kim và Irtani Chu ột nhắt 196 9 Ywamats u và Chang Cừ u 19 83 Wri ght và Bondioli Ngư ời 197 8 Steptoe và Edward Lợ n 19 86 Che ng và cs. 2.Các bước của IVF ?Gồm 4 khâu chủ yếu: - Thu thập trứng chưa thụ tinh; - Nuôi trứng chín; - Cho trứng thụ tinh với tinh trùng; - Nuôi trứng đã thụ tinh cho đến giai đoạn phôi. 2.1. Thu thập tế bào trứng (0ocyte collection) Thu thập tế bào trứng từ buồng trứng của con vật: có thể từ con vật còn sống (qua nội soi hoặc giải phẫu), hoặc từ lò mổ (những con vật cao sản? được giết thịt). Các kỹ thuật để lấy trứng: mổ nang trứng (Follicle dissection), chọc nang trứng (Follicle puncturing); hút nang trứng (Follicle aspiration) hoặc cắt buồng trứng thành từng lát mỏng (Ovary slicing). Cắt buồng trứng thành lát mỏng sẽ cho số lượng trứng chưa thụ tinh nhiều hơn các phương pháp khác (Pawshe, 1994). Tuy vậy, các trứng chưa thụ tinh này thường không đồng nhất và rất khó phát triển thành trứng chín, tỷ lệ thụ tinh của chúng cũng thấp (quãng 18,18%), trong khi đó, tỷ lệ này ở phương pháp mổ nang trứng là 29,07%. Số lượng trứng thu được có khác nhau là do khác nhau về cá thể, phương pháp và mùa vụ thu hoạch. Nếu dùng phẫu thuật, một năm 1 bò có thể cho 100 trứng/buồng trứng (Kruip, 1991). Nếu dùng cách hút, chỉ thu được 2,4-3,0 trứng/lần, (Lenergan, 1991). Bằng phương pháp cắt lát buồng trứng thu được từ lò mổ, chúng tôi thu được 10-30 trứng/2 buồng trứng của gia súc. Cách đánh giá phân loại trứng chưa thụ tinh (lấy từ buồng trứng): theo sự hiện diện hoặc độ dầy, mỏng của tế bào cumullus (Cumullus cell). Loại A: trứng có tế bào Cumullus bao vây hoàn toàn. Loại B: trứng có tế bào Cumullus bao vây một phần (loại B? : chỉ có 1 đám rất mỏng: tế bào Cumullus hoặc chỉ còn lại dấu vết của lớp tế bào này). Loại C: trứng không có tế bào Cumullus bao quanh mà bao bọc chúng là các sợi tơ huyết (fibrin). Thường chỉ dùng trứng loại A và B để nuôi cấy và IVF. Tất nhiên việc thu nhận buồng trứng từ lò mổ hoặc lấy trứng từ buồng trứng (bằng kỹ thuật phẫu thuật hoặc nội soi) phải theo quy trình tương ứng với các môi trường nuôi cấy nhất định. 2.2. Nuôi trứng chín (In vitro Maturation) Sau khi thu thập, trứng được đánh giá phân loại theo mức độ tốt xấu. Trứng đạt tiêu chuẩn sẽ được đưa vào môi trường nuôi cấy trứng chín. Sự chín của trứng chưa thụ tinh có nghĩa là sự thay đổi hình thái học, sinh hoá học ở tế bào chất, ở nhân tế bào và các bộ phận khác của tế bào để các trứng này có khả năng thụ tinh và sau đó, sẽ phát triển thành phôi, thành cơ thể. Thời gian thành thục và chín của trứng chưa thụ tinh thường từ 18-28h. 2.3. Cho trứng thụ tinh với tinh trùng? (In vitro Fertilisation) Để tiến hành quá trình thụ tinh (cho trứng gặp tinh trùng), người ta đưa tinh trùng đã được hoạt hoá vào môi trường thụ tinh đã có trứng nuôi cấy chín. Giọt môi trường thụ tinh đã để sãn trong hộp lồng. Sau khi đưa tinh trùng vào môi trường nuôi trứng nói trên, chuyển hộp lồng vào tủ ấm nuôi cấy có 5% C02, nhiệt độ 38-38,50C và độ ẩm 80%. Thời gian đảm bảo cho quá trình thụ tinh 4-6h (thường là 5h). Tỷ lệ thụ tinh của trứng phụ thuộc vào khả năng hoạt hoá (capitation) của tinh trùng và độ chín của trứng. ở chuột nhắt, tỷ lệ thụ tinh có thể đạt 80% với sự có mặt của 2 tiền nhân (Maudlin và Faraser, 1987). Tỷ lệ thụ tinh của các vật nuôi khác thì thấp hơn. Có thể nâng cao tỷ lệ thụ tinh bằng cách sử dụng hoạt chất cafein và heparin trong quá trình hoạt hoá tinh trùng. Tinh trùng dùng cho IVF: tinh trùng tươi dạng lỏng hoặc tinh trùng đông lạnh. Đối với trứng: thường là trứng mới lấy từ lò mổ hoặc từ phẫu thuật nội soi sẽ cho kết quả cao hơn trứng đã được đông lạnh. Michaelis Rubin và Halin (1984) đã thí nghiệm trên trứng đông lạnh của chuột nhắt đạt được 60%,? còn trứng không đông lạnh đạt 72%. Kielm, 1987 đã thí nghiệm trên trứng đông lạnh của chuột cống, tỷ lệ thụ tinh đạt 70%. Theo Daniel và Tuneja 1987, có thể lấy trứng chưa thụ tinh từ buồng trứng được đông lạnh để IVF. Số lượng tinh trùng cần thiết khi IVF: thường từ 5 đến 100 x 105/ml. Trên thực tế, số lượng này ? 50 x 105/ml sẽ cho kết quả tốt hơn về tỷ lệ thụ tinh và phát triển thành phôi (Shioya, 1993). Ngày nay, bằng kỹ thuật vi tiêm, người ta tiêm thẳng tinh trùng vào buồng trứng. Bằng cách này chỉ cần tiêm 1 tinh trùng cho 1 trứng. 2.4. Nuôi trứng đã thụ tinh phát triển thành phôi (In vitro culture) Trứng đã thụ tinh được chuyển sang các môi trường nuôi cấy (thường dùng môi trường TCM199 có bổ sung huyết thanh bò). Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào Cumulus và các tế bào ống dẫn trứng có ảnh hưởng tích cực đến quá trình phát triển của phôi. (Seidel và cs, 190; Shioya và cs., 1993). 3 Kỹ thuật IVF: 3.1. Thu nhận trứng và nuôi trứng chín - Buồng trứng được thu nhận từ các lò mổ, đặt trong nước sinh lý ấm (25-300C) có bổ sung 100 UI penicillin và 100 mg streptomycin/ml. Sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3h. - Dùng xơranh với kim 18G hút các tế bào trứng từ các nang trứng nhỏ kích thước ? 2mm. - Dung dịch hút được đưa vào môi trường PBS có bổ sung huyết thanh bò đực giống .v.v. . . và kháng sinh. - Soi trứng, đánh giá phân loại trứng thu được qua kính hiển vi soi nổi. Căn cứ vào vùng tế bào Cumulus để đánh giá chất lượng trứng. - Chuyển các tế bào trứng đảm bảo chất lượng sang môi trường nuôi trứng chín. Trứng được đưa vào tủ ấm ở 38-390C, với? hỗn hợp không khí: 5% C02,? 95% không khí thường, thời gian để trứng phát triển thành thục và chín kéo dài 20-30h. 3.2. Chuẩn bị tinh dịch để thụ tinh - Giải đông 1-2 cọng rạ tinh dịch ở nhiệt độ 35-370C, hoặc dùng tinh tươi. - Trộn với 6ml dung dịch rửa tinh dịch trong ống ly tâm sau đó ly tâm với vận tốc 1800 vòng/phút trong 5 phút. - Hút dịch ở trên đầu ống bằng pipet vô trùng. - Cho thêm 0,5-0,8 ml dung dịch rửa tinh dịch để trầm tích và đo lường thể tích. Thể tích ban đầu vào khoảng 0,6-0,8 ml. - Kiểm tra sức kháng của tinh trùng bằng nước muối sinh lý và xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu Newbauer. Điều chỉnh nồng độ tinh trùng đạt 25x106/ml bằng cách cho thêm vào dung dịch rửa tinh dịch (pha loãng lần 1) sau đó điều chỉnh nồng độ tinh trùng đạt 12x106/ml bằng cách tiếp tục cho thêm vào dung dịch rửa tinh dịch (pha loãng lần 2). - Xác định liều lượng thụ tinh, chuẩn bị 4 giọt (100 ml) trong đĩa hộp lồng đường kính 35 mm, phủ bằng dầu vi lượng (mineral oil) và giữ ở trong tủ ấm. 3.3. Thụ tinh - Chuẩn bị 2 đĩa hộp lồng (ặ 35 mm) với dung dịch rửa trứng chưa thụ tinh được phủ? dầu vi lượng. - Chuyển 20-25 trứng chưa thụ tinh đến các giọt tinh trùng đã chuẩn bị sãn. - Đưa vào tủ ấm trong khoảng 5-6h. 3.4. Thu hồi và nuôi cấy trứng đã thụ tinh - Thu trứng đã thụ tinh từ các giọt chứa tinh trùng (giọt môi trường thụ tinh). -Rửa trứng đã thụ tinh 3 lần trong môi trường nuôi trứng chín(TCM- 199) đã chuẩn bị sãn. Đặt đĩa đã có trứng thụ tinh vào tủ ấm có nhiệt độ 380C với 5% C02 trong 48h. 3.5. Nuôi cấy và kiểm tra trứng đã thụ tinh - Sau khi đã thụ tinh, trứng được tiếp tục nuôi trong môi trường TCM- 199 - 1 giọt 5% FCS? với nhiệt độ 3805 và 5% khí C02. - Trong ngày thứ nhất, động nhẹ tay (gõ) lên đĩa hộp lồng để tác động làm rời bỏ các tế bào cumulus bao quanh noãn. - Cứ 48h kiểm tra sự phát triển của phôi 1 lần. - Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10 quan sát sự phát triển của túi phôi. - Đánh giá sự phát triển của phôi qua các mức độ: 2-4 tế bào, >4 tế bào (phôi dâu, phôi nang) và phôi thoái hoá. -Từ sau ngày thứ 7, kiểm tra phôi ngày 1 lần, phôi ở độ tuổi này trở đi hoặc đem cấy chuyển ngay hoặc đem đông lạnh và cấy sau này. 4 Các môi trường dùng cho IVF: 4.1 Dung dịch đệm Dulbecco?s - PBS* Th ành phần Công thức g Thà nh phần Côn g thức g So dium chloride NaCl 8 ,00 Calc ium chloride CaC l2.2H20 0, 132 Po tasium chloride KCl 0 ,20 Mag nesium sulphate Mg S04.7H20 0, 121 So dium dihydrog en Orthopho sphate NaH2 P04.2H20 1 ,15 Lyo pholized - BSA 0, 400 Di Na2H 0 Peni * sodium hydrogen Orthopho sphate P04.2H20 ,20 0 cilin G. Sodium * Gl ucose C6H12 06 1 ,00 1 Stre ptomicin sulphate 0, 05 So dium pyruvate 0 ,036 2 Nướ c cất 2 lần vừa đủ * ** * Lọc thanh trùng bằng màng vi lọc 0,2 - 0,4 m; ** 100UI/ml; ***1000ml 4.2. Môi trường cơ sở BO (Bracket and Oliphant) Dung dịch A: Dung dịch B: NaCl : 4,3092 g NaHCO : 2,5873 g KCl : 0,1974 g Phenol đỏ (dung dịch 0,5%) : 0,04 ml CaCl2.2H20 : 0,2171 g Nước chất tinh khiết : Vừa đủ 200 ml NaH2P04.2H20 : 0,0840 g MgCl2.6H20 : 0,0697 g Phenol đỏ : Ghi chú: (dung dịch 0,5%) 0,1 ml Nước cất tinh khiết : Vừa đủ 500 ml Dung dịch A và dung dịch B là dung dịch gốc 4.3. Môi trường nuôi chín (TCM-199): 1 TCM- 199 : 3,8 ml 3 Penicillin : 4000 IU 2 Huyết thanh bê : 2,0 m; 4 Streptomycin : 4,0 mg Ghi chú: Môi trường TCM-199 bổ sung huyết thanh bê và lọc vô trùng bằng màng lọc kích thước 20-22 m. 4.4. Môi trường nuôi cấy tế bào trứng Thàn M g m Th M g/ m h phần W /L Osm ành phần W L Osm NaCl ? 58,4 5 ,540 1 89,19 N a Lactate 1 12,1 2, 416 43 ,10 KCl 1 80,2 3, 68 ml/L Ca- Lactate 5H20 3 08,3 0 ,527 5, 13 Gl ucose 1, 00 5, 56 KH2 P04 1 36,1 0 ,162 2, 38 B SA 1, 00 MgS 04.7H20 2 46,5 0 ,294 2, 38 K háng sinh * ? 10,00 ml NaH C03 ? 84,0 2 ,106 5 0,14 N ước cất vừa đủ 1 000 ml Na Pyruvate 1 10,0 0 ,028 0, 50 K hoảng 0smol* 308 MW: Khối lượng phân tử; mOsm: Milliosmole 4.5 Môi trường BO Dung dịch A: Sodium pyruvate : 76 ml Sodium pyruvate : 0,01375 g Penicillin : 10.000 IU Streptomicin : 10 mg Dung dịch B: : 24 ml Ghi chú: Khi dùng mới pha, Sodium pyruvate và kháng sinh hoà vào dung dịch A và sau đó pha loãng với dung dịch B. Vô trùng bằng màng lọc. 4.6 Dung dịch nuôi tế bào trứng Dung dịch BO: 40 ml; BSA (Bovine Serum Albumin): 400 ml 4.7. Dung dịch pha loãng tinh trùng Dung dịch BO: 10 ml ; BSA (tinh thể) : 200 mg 4.8. Men trypsin cho IVF (Filuent - Buffered) - ?(Dùng để loại bỏ vành phóng xạ xung quanh tế bào trứng): Sodium chloride: 6,0 g;? Tricine [N-Tris (hydroxymenthyl) methyl glycine]: 1,79 g Trisodium citrate: 2,9 g;??? Phenol red: 0,005 g;???? Nước cất: 1000 ml ?* Quấy đều cho hoà tan hết, điều chỉnh pH về 7,8 * Lọc qua giấy lọc Whatman No1 * Hấp khử trùng *áp suất thẩm thấu = 200 m0sm/kg./.