Thụ tinh trong ống nghiệm ở heo

uôi đã tạo sẵn trên đĩa petri, mỗi giọt thường chứa từ 1- 10 tế bào trứng. Các giọt môi trường này có đệm HEPES, huyết thanh và heparin ( đã ủ ở 370C) Môi trường cho IVM được chia làm 2 loại: đơn giản và phức tạp  Môi trường đơn giản là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối như pyruvate, lactase và glucose. Thường được cung cấp thêm một lượng huyết thanh hay albumin và các kháng sinh ( penicilin, streptomycin và gentamicin).  Môi trường phức tạp cũng chứa các thành phần như môi trường đơn giản và thường có thêm một số yếu tố như amino acid, vitamin, purine và những chất khác. Ngoài ra, môi trường IVM còn được bổ sung hormone (FSH, estradiol, prolactin…). Nhân tố tăng trưởng cũng được bổ sung gồm IGF, EGF, TGF-L. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến IVM, chẳng hạn nước sử dụng, độ thẩm thấu, nhiệt độ và khí, độ sáng của môi trường, dụng cụ nuôi cấy… II.LẤY TINH TRÙNG II.1 Huấn luyện heo đực giống nhảy giá. Heo đực giống đến tuổi thành thục và đạt mức độ hăng về tính dục có thể huấn luyện nhảy giá để lấy tinh. 1.Tuổi huấn luyện Đực giống khi đưa vào huấn luyện tuổi phải hơi non (tuổi dậy thì) bởi vì ở tuổi này dễ cảm hóa con vật nhưng đồng thời cũng là tuổi con vật có 9 tinh hăng về sinh dục, còn nếu tuổi trưởng thành thi khó huấn luyện hơn vì tính bảo thủ của nó cao. Lợn nội 5-6 tháng tuổi, lợn ngoại 7-8 tháng tuổi. 2.Chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Trước khi đưa heo đực giống vào huấn luyện khoảng 20 ngày cần cho ăn khẩu phần ăn phải đảm bảo và cân đối giữa các chất, đặc biệt là protein, canxi, phốt pho và các loại Vitamin A, D, E... Cùng thời gian ấy người huấn luyện phải tiếp xúc với con đực để làm quen bằng cách cho vận động, tắm chải, xoa bóp dịch hoàn. 3.Lịch huấn luyện Phải đảm bảo một tuần không quá hai lần và đúng giờ qui định (tốt nhất là khoảng từ 5-7 giờ sáng). 4.Người huấn luyện Người huấn luyện phải kiên trì tránh nôn nóng, tránh các hành vi thô bạo như : đánh đập và phải luôn cố định người huấn luyện bởi vì có cố định người huấn luyện thì mới theo dõi được cá tính của từng con để chiều theo ý thích của chúng. 5. Phòng và giá huấn luyện Phòng huấn luyện phải rộng đủ cho gia súc đi lại thực hiện các phản xạ. Để làm giá, có thể là “giá tự nhiên” như heo cái (động dục hoặc không động dục), con đực khác; hoặc giá nhân tạo (bằng gỗ, xi măng, sắt, có phủ vải bạt, cao su). 6. Phương pháp huấn luyện * Nguyên tắc huấn luyện Thành lập cho heo đực một phản xạ có điều kiện về nhảy giá và thường xuyên củng cố phản xạ này. Lúc đầu cho nó nhảy với cái động dục, tiếp đó cho nhảy với con mồi, cuối cùng cho nhảy với giá. * Chú ý: - Mỗi giai đoạn nhảy ta cho củng cố 5 đến 6 lần, khi gia súc thành thạo thì ta sẽ chuyển sang giai đoạn khác. - Một số con ta chỉ cần cho nó tham quan sau đó tự nó có thể tự nhảy giá được hoặc có những con khi cho nó vào giá nó nhảy giá ngay thì cho chúng nhảy trực tiếp giá không cần áp dụng một cách máy móc quy trình trên để rút ngắn thời gian huấn luyện. II.2 Một số kỹ thuật lấy tinh. => Các yêu cầu cơ bản trong kỹ thuật lấy tinh. a. Phải khai thác toàn bộ tinh dịch của con đực trong 1 lần khai thác. 10 Nếu việc đó không xảy ra thì nó sẽ gây ra 2 hiện tượng: + Lãng phí tinh dịch + Phản xạ tính dục của heo đực giống bị ảnh hưởng, làm mất khoái cảm sinh dục, dẫn đến làm mất phản xạ có điều kiện đã được tạo nên. b. Đảm bảo phẩm chất của tinh dịch. - Để đạt được về số lượng và chất lượng thì phải đảm bảo các điều kiện sống, sinh lý, chế độ khai thác con đực. Sau khi khai thác xong thì phải đảm bảo điều kiện sống cho tinh trùng khi ra ngoài cơ thể đặc biệt là không được có các tạp khuẩn, các chất sinh học gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Phải tránh lây lan các bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng thông qua khai thác tinh dịch. Có những chú ý sau về khâu vệ sinh trong quá trình khai thác tinh dịch: + Dụng cụ khai thác tuyệt đối vô trùng. + Không được khai thác tinh dịch của gia súc ốm, bị bệnh. + Phải tắm rửa con đực trước mỗi lần khai thác tinh dịch. + Vệ sinh sạch sẽ giá nhảy, phòng lấy tinh. + Nhân viên lấy tinh dịch phải cố định và không mắc các bệnh truyền nhiễm. c. Không được gây ảnh hưởng thô bạo đến cơ quan sinh đực. d. Dụng cụ an toàn cho cơ quan sinh dục gia súc, dễ thao tác, dễ kiếm và giá thành hạ. => Các kỹ thuật lấy tinh 1. Dùng âm đạo giả. Cấu tạo âm đạo giả gồm hai phần chính: ☺ Phần tiếp nhận dương vật: vỏ và ruột âm đạo giả, các vành đai, lỗ rót nước có van khóa. ☺ Phần hứng tinh dịch: đoạn phễu nối, ống hứng tinh(hoặc lọ, cốc) 11 Điều kiện cần thiết để heo đực giống xuất tinh thuận lợi. ☺ Ôn độ trong lòng âm đạo giả: 38-400C, nhưng cũng tùy cá thể mà bố trí nhiệt độ thích hợp. ☺ Áp lực trong lòng âm đạo giả: 35-70 mm Hg. ☺ Tùy cá thể mà giữ cho lòng âm đạo giả có độ căng thích hợp. Kinh nghiệm: thổi hoặc bơm hơi cho căng bằng miệng ngoài âm đạo giả và tạo thành hình sao 3 cạnh. ☺ Độ trơn trong lòng âm đạo giả: bôi trơn 2/3 mặt trong âm đạo giả bằng vazơlin hoặc tragacăng. Một số dụng cụ lấy tinh => Đây là phương pháp mang tính tối ưu nhất hiện nay, nó có một số ưu nhược điểm chính sau: + Đảm bảo an toàn được cơ quan sinh dục của con đực + Chất lượng tinh dịch được đảm bảo tốt + Dụng cụ phức tạp, chuẩn bị cầu kỳ. 2. Kích thích bằng điện. Ý tưởng băt đầu từ Battelli, năm 1922 trên đối tượng là con lợn, sau đó năm 1936 Gunn (Úc) đã hoàn thiện công trình và rất thành công trên bò. Biện pháp này áp dụng cho những trường hợp heo đực giống không thể nhảy giá được (què), hoặc không quen với âm đạo giả. * Nguyên tắc: Dùng dòng điện xoay chiều kích thích vào hệ thần kinh thực vật của con đực làm hưng phấn cao độ và có phản xạ tính dục. 12 Phương pháp này cho kết quả tốt, được chấp nhận và thực tế sử dụng nhưng không nhiều, lượng xuất tinh giảm. Sau một thời gian sử dụng có thể gây nên bệnh lý. Hiện nay có các máy sử dụng điện hoặc pin của Nga, Mỹ, Pháp. Không nên sử dụng những heo đực giống không có giá trị về di truyền. Nguồn điện sử dụng: 220V, 110V hoặc 12V. 3. Dùng tay để lấy tinh heo đực. Trước đây người ta lấy tinh lợn đực bằng âm đạo giả nhưng ngày nay người ta lấy tinh bằng tay. Sử dụng con đực ở tuổi: 7-9 tháng đối với lợn ngoại, 5-7 tháng đối với lợn nội. Khi heo đực đã nhảy lên giá và thò dương vật ra, dùng bàn tay (mang găng cao su mềm) nắm nhẹ và vân vê phần tự do của dương vật, kích thích cho heo giao cấu trong lòng bàn tay đến khi heo xuất tinh. Phương pháp này có nhiều lợi thế, nhưng cần phải chú ý bảo vệ dương vật heo và phòng ngừa sự lây lan bệnh giữa heo và người. * Chú ý: - Không bịt ngón tay vào lỗ phóng tinh, tinh không bắn ra được. - Cho tinh dịch chảy theo thành cốc hứng tinh. - Trong quá trình lợn phóng tinh tay giữ dương vật để nguyên vị trí và có thể dùng ngón tay cái kích thích vào đầu dương vật để gây kích thích cho lợn xuất tinh tốt hơn. - Khi lấy tinh xong cần phải vệ sinh phòng lấy tinh và dụng cụ. II.3 Tần số lấy tinh. Số lượng tinh trùng và lượng tinh dịch thu được có biến động tùy theo giống, tuổi, tần số lấy tinh. Trong mỗi lần xuất tinh, heo đực tiết ra một số lượng lớn tinh trùng và cũng chóng vơi cạn số tinh trùng dự trữ trong dịch hoàn phụ, vì vậy tần số lấy tinh có ảnh hưởng lớn đến lượng xuất tinh, nồng độ tinh trùng, tổng số tinh trùng tiến thẳng, số liều tinh dịch có thể sản xuất từ một lần lấy tinh. Nếu lấy tinh hằng ngày (mà 4-5 ngày trước đó heo đã được nghỉ xuất tinh), trừ lần xuất tinh đầu tiên, còn các lần sau đều bị giảm về tổng số lượng tinh trùng xuất ra. Do đó, số liều tinh dịch của mỗi lần lấy tinh để sử dụng cũng bị giảm sút. 13 Khoảng cách lấy tinh (giờ) Lượng xuất tinh (ml) Nồng độ tinh trùng (tỉ/ml) Tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỉ) Số liều tinh dịch từ một lần lấy tinh (mỗi liều có 1 tỉ tinh trùng) 24 48 72 96 120 144 168 116 166 181 221 256 251 239 0,125 0,145 0,150 0,220 0,220 0,200 0.210 9,7 16,1 27,2 37 45,1 38,7 38,1 9,7 16,1 27,2 37 45,1 38,7 38,1 Ảnh hưởng của tần số lấy tinh II.4 Đánh giá tinh dịch 1. Trạng thái tinh dịch. Tinh dịch phải có trạng thái tương đối đồng nhất, màu trắng sữa đặc, chứng tỏ có nồng độ tinh trùng cao. Tinh dịch trong mờ là tinh dịch chứa ít tinh trùng. Trong tinh dịch không lẫn lông và các vật bẩn khác. Không nên sử dụng tinh dịch đóng vón có chứa những mảnh vật chất hoặc tinh thể vì chứng tỏ đường sinh dục bị viêm nhiễm. Một số heo đực giống thường xuyên xuất ra tinh dịch màu vàng nhạt, chứng tỏ sự có mặt của riboflavin sắc tố vô hại. Tinh dịch có màu xanh là tinh dịch có lẫn mủ, tinh dịch có màu hồng là tinh dịch lẫn máu. Tuổi thọ của tinh trùng giảm dần từ sau khi lấy tinh ra khỏi cơ thể đực giống. Tinh dịch nguyên dạng lỏng phần lớn còn khả năng thụ tinh trong vòng 48 giờ tính từ sau lúc lấy tinh. Vì vậy sau khi lấy tinh cần tiến hành ngay các khâu đánh giá chất lượng tinh dịch để quyết định việc pha loãng bảo tồn tiếp theo. Thao tác đánh giá càng nhanh và càng chính xác càng tốt. 2. Các phương pháp đánh giá tinh dịch. a. Nồng độ tinh trùng Là số tinh trùng trong 1ml tinh dịch. Việc xác định chính xác nồng độ tinh trùng là rất quan trọng vì chỉ tiêu này thường biến động lớn. Khi phối hợp giữa lượng xuất tinh, sức hoạt 14 động tinh trùng và nồng độ tinh trùng, sẽ có được tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch, từ đó sẽ tính được số liều tinh dịch có thể sản xuất của mỗi lần xuất tinh. Cho đến nay phương pháp xác định nồng độ tinh trùng được tín nhiệm là dùng buồng đếm bạch cầu. Buồng đếm Niubaoơ Thứ tự đếm tinh trùng: Trên xuống, từ trái sang phải Ngoài buồng đếm còn có ống karras, máy so màu quang điện. 15 Ống Karas b. Sức kháng thẩm thấu của tinh trùng (Ro) Nguyên tắc: dựa trên sự đánh giá sức chịu đựng của tinh trùng đối với dung dịch NaCl nhược trương. Nếu tinh trùng chịu đựng được dung dịch NaCl nhược trương sau 3 giờ mà sức hoạt động vẫn còn tốt, chứng tỏ chất lượng tinh dịch tốt. Cách làm: dùng NaCl 0,8%, pha loãng 1:4, bảo tồn ở nhiệt độ phòng và kiểm tra hoạt lực tại các thời điểm: 0 giờ (lúc mới pha loãng), 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ ( sau khi pha loãng). Cộng 4 giá trị hoạt lực ấy, mẫu tinh dịch nào có giá trị tổng hoạt lực càng cao, chất lượng tinh dịch càng tốt. c. Tỉ lệ tinh trùng sống/chết. Có thể đánh giá tỉ lệ sống/chết của tinh trùng bằng cách nhuộm tinh trùng đang còn sống trong hỗn hợp nigrosin-eosin. Khi nhuộm, nếu tinh trùng còn sống thì đầu tinh trùng không bắt màu, còn nếu tinh trùng chết thì đầu tinh trùng bắt màu hồng trên nền thẫm của nigrosin. Phương pháp phết tiêu bản. Thông thường tỉ lệ tinh trùng của heo sống đạt ≥70% trở lên chứng tỏ tinh dịch tốt, sử dụng đạt hiệu quả cao. 16 d. Độ pH tinh dịch Độ pH của tinh dịch có liên quan đến khả năng sống và năng lực thụ tinh của tinh trùng. Để xác định độ pH , chính xác nhất là dùng máy đo pH. Ngoài ra trong thực tiễn vẫn có thể dùng giấy chỉ thị màu, phương pháp này nhanh, rẻ tiền nhưng độ chính xác không cao. Cách đo pH bằng giấy chỉ thị màu: nhúng ngập giấy chỉ thị vào tinh dịch và so kết quả chuyển màu của giấy đối với thang màu. Đọc kết quả trong vòng 5 giây. Độ pH tinh dịch heo khoảng 7,2-7,5. e. Tình trạng acrosome của tinh trùng. Acrosome có vai trò quan trọng đối với năng lực thụ tinh của tinh trùng. Các nhân tố lý hóa học, bệnh lý… dễ dàng làm cho acrosome bị tổn thương. Kỹ thuật đông lạnh không đúng đắn cũng có thể phá hủy acrosome và màng bọc tinh trùng, làm thất thoát các enzyme trong tế bào. Có nhiều phương pháp đánh giá tình trạng acrosome ☺ Đánh giá nhanh một cách khái quát: thường dùng các dung dịch có thể làm cho một số thành phần trong acrosome phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang, từ đó xác định tỷ lệ % số tinh trùng có đầu phát sáng (còn nguyên acrosome). ☺ Kiểm tra cấu trúc acrosome bằng dung dịch Formol- Saline. ☺ Kiểm tra acrosome bằng dung dịch Giemsa. STT Chỉ tiêu chất lượng tinh. KH Đơn vị tính Yêu cầu 1 Lượng tinh đã lọc V ml >= 100 2 Màu sắc Trắng sữa 3 Độ vẩn D >2+ 4 pH 6.8-8.1 5 Hoạt lực A >=0.7 6 Nồng độ C Triệu/ml >=80 7 Tỷ lệ tinh trùng sống % >=70 8 Tỷ lệ kỳ hình K % <=10 9 Tỷ lệ còn nguyên acrosome Acr % >=70 10 Sức kháng R >=3000 11 Mức độ nhiễm khuẩn Vk/ml <5000 17 II.5. Pha loãng tinh dịch. 1.Mục đích - Tăng thêm khối lượng tinh dịch từ đó nâng cao hiệu quả sinh sản của đực giống. - Kéo dài thời gian sống của tinh trùng ở ngoài cơ thể gia súc. - Tiện lợi cho quá trình vận chuyển. 2. Một số yêu cầu về đặc điểm lý- hóa học đối với môi trường pha loãng tinh dịch. a. Áp suất thẩm thấu. Muốn cho tinh trùng sống được thuận lợi trong môi trường pha loãng, áp suất thẩm thấu của môi trường phải tương đương với áp suất thẩm thấu nội tại của tinh trùng. Đó là những dung dịch đẳng áp. Các dung dịch ưu trương hoặc nhược trương đều có hại cho tinh trùng vì sẽ làm cho tinh trùng teo lại hoặc trương phồng lên và chết một cách nhanh chóng. b. pH và năng lực đệm của môi trường Ở tinh dịch heo, axit cacbonic được tạo thành sẽ phân ly và biến mất, vì vậy tạo nên tính kiềm yếu của tinh dịch, và tinh trùng được kích thích để hoạt động mạnh, vì vậy nhanh chết. Nếu môi trường pha loãng hơi kiềm, sức hoạt động của tinh trùng tăng cường. Còn trong môi trường acid, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế. Để tạo nên môi trường tổng hợp có khả năng duy trì một cách ổn định độ pH ở mức thích hợp, người ta thường đưa vào những chất có năng lực đệm. Hệ đệm thường được sắp xếp từng đôi. Cấu tạo một đôi đệm thường gồm một acid yếu và một muối kiềm mạnh của acid yếu đó. Ví dụ Hệ Bicacbonat: H2CO3/NaHCO3 Hệ Photphat: NaH2PO4/Na2HPO4 c.Chất điện giải và không điện giải trong môi trường. Chất không điện giải ( như các loại đường Glucose, Fructose…) có tác dụng làm giảm độ dẫn điện của môi trường, bảo vệ tinh trùng tránh được hiện tượng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng, ngăn ngừa được hiện tượng tụ dính của tinh trùng => giúp tinh trùng duy trì sức sống được thuận lợi hơn. Ngoài những đường đơn dễ bị phân hủy người ta còn đưa vào môi trường pha loãng những loại đường khác mà tinh trùng không phân hủy được (saccarose…) 18 d. Vai trò của các chất kháng sinh tố trong môi trường pha loãng. Để hạn chế tác hại của vi khuẩn, người ta bổ sung vào môi trường pha loãng những kháng sinh tố với nồng độ thích hợp. Victo Lorian đã nêu lên cơ chế tác dụng của một số kháng sinh tố: Nhóm Penicilin: ức chế sự tổng hợp các mucopeptid của vỏ tế bào. Ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn nhưng không nâng khả năng thụ thai. Nhóm Streptomycin, Tetraxyclin: cơ chế chủ yếu của nhóm này là tác động lên sự tổng hợp protein và trực tiếp hay gián tiếp làm chết tế bào. Streptomycin ức chế sự phát triện của vi khuẩn, nhưng nếu dùng liều cao thì có hại cho tinh trùng. e. Các chất sinh học trong môi trường. Trong những năm gần đây, để tăng cường tính bảo vệ sức sống của tinh trùng các tác giả đã nghiên cứu bổ sung một số chất có hoạt chất sinh học vào trong môi trường pha loãng tinh dịch và đã thu được kết quả tốt. o Men phân giải H2O2 để tránh sự đầu độc của nó với tinh trùng. o Men Muxinaza làm giảm chất Muxin có trong âm đạo của con cái, men hyaluronidaza để tạo nên hệ cân bằng động giữa men này ở trong acroxom của tinh trùng và môi trường. o Kích tố sinh học oxytoxin và prostaglading nhằm tăng cường co bóp của tử cung tạo điều kiện cho tinh dịch vận chuyển nhanh vào đường sinh dục của con cái. f. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đối với tinh trùng. Một trong những nhân tố đầu tiên của môi trường bên ngoài ảnh hưởng đến tinh dịch nguyên mới lấy là nhiệt độ. Nếu có sự chênh lệch lớn về nhiệt độ giữa tinh dịch lúc mới xuất ra và nhiệt độ môi trường bên ngoài, tinh trùng sẽ bị choáng nhiệt độ và dễ chết (nhất là vào mùa đông). Để giảm bớt hiện tượng trên,vào mùa đông khi lấy tinh hoặc khi pha loãng có bổ sung 3-5% lòng đỏ trứng gà, nhằm hạn chế sự choáng lạnh cho tinh trùng, đồng thời giúp cho việc ngăn ngừa sự tiêu hao lipid của sinh chất của tinh trùng. 19 => Một số môi trường pha loãng tinh dịch lợn. a. Môi trường đơn giản + Môi trường sữa bò tươi Lấy sữa của bò khỏe mạnh, mới vắt, hấp cách thủy 20-30 phút sau đó để nguội xuống 50 - 60 0 C. Dùng vải màn gấp 5-6 lần lọc cho hết phần bơ nổi lên trên sau đó để nguội xuống 35-40 0 C, cho tetracilin vào (0,05g/1 lít sữa đã lọc), khuấy cho đều lọc lại một lần nữa bảo quản để dùng. + Môi trường sữa bột 10% Dùng sữa bột tốt (không vón cục, hôi, mốc, hoặc có màu khác thường). Thành phần gồm: sữa bột 100g, nước cất 1000ml, tetracilin 0,05g. Cách pha : Dùng 250 ml nước cất có nhiệt độ 35-40 o C pha 100g sữa khuấy cho tan. Sau đó cho thêm 750 ml nước cất nữa để đủ 1000ml, dùng đũa thủy tinh khuấy cho đều. Hấp cách thủy trong vòng 20- 30 phút, sau đó để nguội xuống 35 0 C, cho 0,05g tetracilin vào khuấy đều, lọc qua nhiều lớp vải màn. Bảo quản ở nhiệt độ 4-5 o C để sử dụng. * Chú ý: Cả hai môi trường trên chỉ sử dụng trong ngày. b. Môi trường tổng hợp Cách pha chế môi trường: Pha glucoza vào nước cất, đun cách thủy sôi 15-20 phút, để nguội xuống nhiệt độ 60 o C. Cho thêm Nacitrat, natribicacbonat, kaliclorua, trilon B vào, dùng đũa thủy tinh khuấy cho đều. Để nguội xuống 35 o C, cho thêm amoniumsulfat, lòng đỏ trứng gà, kháng sinh vào khuấy cho tan đều, lọc qua vải màn (hoặc giấy lọc). Bảo quản ở nhiệt độ lạnh để sử dụng. * Chú ý: + Trứng gà pha vào môi trường phải đánh thật kỹ (giống đánh kem) và phải là trứng mới đẻ trong vòng một tuần. + Natricitrat sử dụng trong pha chế môi trường phải trung tính. Cách trung tính như sau: trộn 100g natricitrat và 3.5g acid citric, cho hỗm hợp đó vào cối xứ rồi nghiền nhỏ, trộn đều là được. + Môi trường sau khi pha phải có pH tương đương pH tinh dịch. 20 U Bảng thành phần các môi trường dùng pha loãng tinh dịch heo ( g/ml, chưa có các kháng sinh tố) Tên môi trường Kiev Zolesc o Môden a Butvil o BL-1 BTS IVT cải tiến Tác giả Higo và Macco n 1971 Gôttad i và cộng sự 1980 Môreti 1981 Xumo mato 1984 Pơxe n và cộng sự 1971 Pơxen và Gionxo n 1975 Đumetni n và Đôzie 1958 Glucose Naxitrat Nabicacbon at EDTA Tris Axit xitric Cystein KCl Xunfamilam id BSA Áp suất thẩm thấu 60 3,7 1,2 3,7 - - - - - - 380 11,5 11,65 1,75 2,35 6,5 4,1 0,07 - - 5 240 27,5 6,9 1 2,35 5,65 2,9 - - - - 240 35 6,9 1 2,25 5,65 3,15 0,054 - - 3 284 27 10 2 - - - - 0,3 - - Đẳng trươn g 37 6 1,25 125 - - - 0,75 - - Đẳng trương 3 24,28 2,4 - - - - 0,3 3 Bão hòa với CO2 Đẳng trương 2. Bảo quản môi trường pha loãng tinh dịch  Nguyên tắc chung để bảo quản các loại hóa chất hoặc môi trường đã cân sẵn là phải giữ nơi khô ráo (có độ ẩm dưới 70%), nhiệt độ mát (15-180C) và tránh ánh nắng trực tiếp  Nếu là từng đơn chất, nên đựng trong lọ thủy tinh có nút ráp.  Đối với môi trường đã hỗn hợp sẵn nên đựng trong túi plastic mà không khí bên ngoài không thấm qua được. II.6. Bảo tồn tinh dịch => Nguyên tắc bảo tồn Chúng ta dựa trên nguyên tắc sống tiềm sinh của động vật (động vật ngủ đông) để bảo tồn tinh dịch. Có thể sử dụng một số biện pháp sau : + Tạo pH toan tính phù hợp với điều kiện sống của tinh trùng. 21 + Cản trở cung cấp O 2 để hạn chế quá trình trao đổi chất của tinh trùng. + Dồn tinh trùng lại trạng thái dày đặc và hạ nhiệt độ xuống thấp. => Các phương pháp bảo tồn 1. Bảo tồn ở nhiệt độ không khí Dùng vải đen nhúng nước, vắt cho bớt nước bọc lọ tinh, để vào nơi kín và tối. Phương pháp này chỉ bảo quản và sử dụng trong ngày. 2. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh : Đối với tinh dịch lợn, tùy theo môi trường mà ta chọn nhiệt độ bảo quản phù hợp, thường là trong khoảng 10 - 20 0 C. Phương pháp này bảo quản tinh dịch được khá lâu và phụ thuộc vào tinh dịch từng giống, từng cá thể và từng loại môi trường. Thí dụ : tinh dịch lợn có thể bảo quản được từ 2 - 7 ngày. 3 Bảo tồn đông lạnh + Làm đậm đặc tinh dịch bằng cách ly tâm. + Chắt bỏ tinh thanh và pha loãng tinh trùng bằng một loại dung dịch có lực ion thấp để hạn chế bớt những tổn hại cho tinh trùng. + Khi sắp ướp lạnh thì bổ sung glycerin. + Tinh dịch được ướp lạnh dạng viên hoặc dạng cộng rạ lớn trong nitơ lỏng. + Cách ướp lạnh : - Ướp lạnh dạng tinh cộng rạ : tinh dịch được pha loãng với môi trường, sau đó được phân vào các ống (cọng rạ), dung tích tùy theo. Làm lạnh tinh dịch từ 2 - 4 0 C trong vòng 4 - 5 giây, xếp vào mạng lưới và nhận chìm trong nitơ lỏng để bảo quản. - Ưóp lạng tinh đông viên : pha môi trường với tinh dịch, để lạnh ở 2 - 4 0 C trong thời gian 5 - 6 giây. Tạo khuôn tuyết CO 2 trên khay, dùng bàn là có chổi úp xuống mặt mặt khay tạo lỗ nhỏ, Rót tinh dịch vào lỗ nhỏ, tinh dịch sẽ đông lại như viên thuốc sau đó lấy viên tinh cho vào gáo đựng tinh và nhấn chìm trong nitơ lỏng bảo quản. II.7. Hoạt hóa tinh trùng Tinh trùng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm có thể được khai thác từ tinh hoàn, phó tinh hoàn. Tinh trùng từ nguồn nào và khai thác bằng cách nào sẽ không có khả năng thụ tinh nếu không được hoạt hóa trong đường sinh dục cái hoặc trong phòng thí nghiệm bằng hàng loạt những biến đổi hóa sinh học, tế bào học …trước khi xâm nhập qua màng trong suốt để kết hợp với nhân của tế bào trứng. 22 Có nhiều giả thuyết về cơ chế hoạt hóa tinh trùng. Thuyết về màng sinh học cho rằng, màng tinh trùng khi chưa hoạt hóa rất vững chắc để bảo vệ tinh trùng, còn tinh trùng đã được hoạt hóa tính bền của màng thì ngược lại. Giả thuyết khác lại cho rằng hoạt hóa tinh trùng là quá trình xóa bỏ enzym ức chế của acrosome. Các môi trường hoạt hóa tinh trùng: z Phương pháp của Brackett và cs (1982): tinh trùng được nuôi trong dung dich có nồng độ ion cao (HIS, khoảng 380mOsm/kg) trong 5 phút, rửa và nuôi tiếp trong 45 phút cho tới 5h. z Phương pháp của Hanada và cs (1986): Tinh trùng được pha loãng vào môi trường nuôi cấy tổng hợp với caffeine, nhưng không có albumin huyết thanh bò, đồng thời xử lí với ionophore A trong thời gian ngắn (0,1μM, 60s). Sau đó gây sự hoạt hóa với môi trường nuôi bổ sung albumin huyết thanh bò z Phương pháp của Lu và cs (1987): Tinh trùng đông lạnh được xử lí với phương pháp swim up, sau đó gây hoạt hóa với việc xử lí heparin trong 15 phút. D. THỤ TINH IVF. Tế bào trứng chín và tinh trùng hoạt hóa được chuyển sang môi trường thụ tinh để thực hiện quá trình xâm nhập, hình thành tiền nhân, kết hợp hai tiền nhân tạo thành hợp tử. Để thực hiện quá trình này cần phải có số lượng tinh trùng, thời gian tiếp xúc và môi trường thích hợp để đạt được hiệu quả thụ tinh thành hợp tử. Sau thụ tinh, hợp tử phát triển thành phôi với tỷ lệ cao. I. Môi trường thụ tinh. Trong các môi trường thụ tinh invitro, các chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng thuộc ba nhóm: muối, cơ chất năng lượng (glucose, pyruvate,lactate) và nguồn protein ion Ca2+, bicarbonat, tỉ lệ Na+/K+ . pH của môi trường IVF khoảng 7,4. Môi trường pH 7.4 được chọn vì gần giống với pH máu, thích hợp cho sự thụ tinh và quá trình phát triển ban đầu của phôi. Khi thụ tinh hoặc nuôi phôi, cần thiết phải phủ lên bề mặt của môi trường nuôi một lớp dầu khoáng để làm giảm quá trình tạo hạt ngưng tụ trong môi trường, cũng như làm thay đổi nồng độ các chất II. Thời gian thụ tinh. Thời gian tiếp xúc giữa tinh trùng và trứng (thời gian ủ) phụ thuộc vào thời gian và phương pháp hoạt hóa tinh trùng, chất lượng trứng khi nuôi chín 23 … thông thường đạt tỉ lệ thụ tinh cao khi chất lượng trứng chín cao, phương pháp hoạt hóa tốt. Nhưng nếu cho tinh trùng vào thụ tinh quá muộn, khả năng phôi bất thường sẽ tăng. Thời gian thụ tinh của trứng heo nái chỉ được khoảng 24 - 72 tiếng. III. Nồng độ tinh trùng thụ tinh Nồng độ tinh trùng hoạt hóa để thụ tinh ở động vật có vú vào khoảng 105-106 tinh trùng/ml. Ở heo vào khoảng 4-5.108-109/ml. IV. Qúa trình thụ tinh. 24 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Phân loại Trứng loại A, B Môi trường PBS Môi trường nuôi chín Nuôi 370C, 5%CO2, 24 giờ Ủ 370C, 5%CO2, Pha môi trường nuôi chín ( MTM) Giải đông tinh Percoll – 1 ly tâm Swing – up, 370C, 5%CO2 Percoll – 2 ly tâm Nuôi 370C, 5%CO2, 24 MTM: môi trường nuôi chín ( TCM – 199 ) MTTT: môi trường thụ tinh (BO) MTN: môi trường nuôi THU BUỒNG TRỨNGGÂY TRỨNG CHÍN IN VITRO THU TRỨN