Thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò

Thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò 1 Nuôi chín tế bào nang trứng và nuôi cấy in vitro Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) bò sẽ thành công hơn nếu trứng được thu hoạch từ buồng trứng hoặc từ các nang trứng chín (tế bào trứng thứ cấp). Tuy nhiên, các trứng trong nang chưa chín vẫn được sử dụng nhờ áp dụng quá trình gây siêu bài noãn. Các tế bào trứng thu hoạch được từ các nang trứng có đường kính 2-5 mm cần được nuôi chín cho đến khi đạt tới giai đoạn II của quá trình phân chia (Metaphase II) (tương ứng với "tuổi" của trứng khi trứng rụng tự nhiên). Hiện tượng " nuôi chín in vitro " này đã được tiến hành rất nhiều kể từ khi Sreenan báo cáo lần đầu tiên (1970). Hiện nay, tế bào trứng bò được nuôi cấy trong huyết thanh thai bê (10-20%), ví dụ TCM199, trong 24-28 giờ với tỷ lệ chín của tế bào trứng là 60-80% và đã thành công trong IVF. Nhưng có một điều hết sức quan trọng là phải thu thập được tế bào trứng hoàn hảo, nghĩa là không chỉ có nhân chín mà còn phải có nguyên sinh chất hoàn hảo và vòng trong suốt tròn rõ. 2 Hiện trạng và những vấn đề của IVF Trong năm 1959, Chang đã tạo một động vật có vú đầu tiên từ quá trình IVF trên thỏ. ở người, hơn 1000 cháu bé ra đời bằng IVF kể từ sau ca IVF đầu tiên thành công của Steptoe và Edward (1978). ở Nhật, thành công đầu tiên đã đến với nhóm nghiên cứu thuộc Bệnh viện Tổng hợp Tohoku (1983), tiếp đến là rất nhiều thành công của các bệnh viện tổng hợp khác trong toàn quốc. Bảng 1. Thành tựu về IVF ở động vật có vú Tác gia Loài được nghiên cứu Kết quả đạt được Chang (1959) Thỏ Đẻ con Dauzler & Thibault (1959) Cừu Tiền nhân Yanagimachi & Chang (1964) Chuột đồng Trung Quốc Thâm nhập, tiền nhân và phân chia tế bào Whittingham (1968) Chuột Phân chia tế bào và thai Pickworth & Chang (1969) Chuột đồng Trung Quốc Thâm nhập và tiền nhân Edwards et al. (1969) Người Thâm nhập và tiền nhân Hamner et al. (1970) Mèo Phân chia tế bào Yanagimachi (1972) Chuột Lang Thâm nhập, tiền nhân và phân chia tế bào Gould et al. Khỉ Rhesus Tiền nhân và phân chia (1973) tế bào Miyamoto & Chang (1973) Chuột Thâm nhập và tiền nhân Iritani et al. (1975) Lợn Thâm nhập, tiền nhân và phân chia tế bào Mahi & Yanagimachi (1976) Chó Thâm nhập (mở rộng đầu) Iritani & Niwa (1977) Bò Thâm nhập và tiền nhân Hanada & Chang (1978) Hươu chuột Thâm nhập và tiền nhân Hanada & Tsutsumi Dê Thâm nhập Khi IVF ở người, tế bào nang trứng được lấy ra từ người mẹ bằng phương pháp nội soi ngay trước kỳ trứng rụng, sau đó tế bào trứng này được cho thụ tinh với tinh trùng của người chồng, nuôi cấy cho phát triển đến giai đoạn 4-8 tế bào và cấy trở lại vào tử cung người mẹ. Phương pháp này được gọi là IVF-ET (In vitro Fertilization and Embryo Transfer) vì nó gồm hai kỹ thuật: thụ tinh trong ống nghiệm và cấy truyền phôi. Đã có nhiều công trình về IVF ở động vật có vú được công bố. Phần lớn đề cập đến sự xâm nhập của tinh trùng vào trong tế bào trứng, việc tạo ra tiền nhân và sự bắt đầu phân chia (Bảng 1). Quá trình IVF-ET được áp dụng đầu tiên trên người, và thí nghiệm nhiều trên động vật (như chuột nhắt, chuột cống, thỏ) nhưng có rất nhiều báo cáo về sự thành công trên đối tượng gia súc ở thập kỷ 80 (bảng 2). Bảng 2.? Một số? động vật có vú? ra đời lần đầu tiên do IVF Tác gia Loài động vật Tác gia Loài động vật Chang (1959) Thỏ Brackett et Bò al. (1982) Whittingham (1968) Chuột Hanada (1985) Dê Shiba Toyoda & Chang (1974) Chuột cống Hanada (1985) Cừu Steptoe & Edwards (1978) Người Cheng et al. (1986) Lợn Brackett (1982) là người đầu tiên báo cáo về thành công IVF trên bò. Ngày nay kỹ thuật này đã được áp dụng trên toàn thế giới trong đó có Nhật Bản (bảng 3). Nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết, chứ không giống như làm IVF trên đối tượng chuột nhắt, chuột cống và người. Bảng 3. Số liệu về các ca chửa đẻ ở bò được IVF Tác gia Trứng Tinh trùng Phát triển của tế bào trứng Kết quả ?lúc được truyền cấy Brackett et al., 1982 IVM Tươi 4 tế bào 1 bê Brackett et al., 1982 IVM Tươi (?) 4 tế bào (?) 2 bê (sinh đôi) Hanada et al., 1986 IVM Đông lạnh Phôi dâu- nang 3 bê Sirard et al.,1986 IVM Tươi Phôi nang 8 tế bào 7 bò có chửa, đẻ 6 bê Shimohira et al, 1986 IVM Đông lạnh 1 tế bào 1 sẩy thai (210 ngày) Parrish et IVM Đông Phôi dâu, nang đông lạnh 3 bê (có al., 1986 lạnh và giải đông 2 sinh đôi) Lu et al., 1987 IVM Đông lạnh Phôi dâu- nang 11 bò có chửa Fukushima et al, 1987 IVM Đông lạnh Phôi nang 3 bê Aoyagi, 1987 IVM Đông lạnh Phôi dâu- nang 3 bê - IVM (in vitrro maturation): Nuôi chín trong ống nghiệm - Các trứng sau khi thụ tinh được nuôi cấy trong tử cung thỏ và tử cung cừu Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm bò được trình bày ở bảng 4. Bảng 4. Các nội dung hoạt động và kỹ thuật cần thiết cho IVF Nội dung Tiến hành Lấy tinh Giải đông tinh (đông lạnh). Epididymis tinh trùng Hoạt hoá tinh trùng Trong đường sinh dục của con cái động dục Nuôi cấy trong cơ quan sinh dục Nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy tổng hợp Thu hoạch trứng Trứng rụng tự nhiên. Trứng trong nang trứng Nuôi chín tế bào trứng Nuôi chín in vitro. Nuôi cấy trong môi trường tổng hợp Thụ tinh Môi trường nuôi cấy phù hợp Nồng độ tinh trùng. Đánh giá tinh trùng Nuôi cấy các trứng đã được thụ tinh Trong cơ quan sinh sản cùng loài hoặc khác loài Cấy truyền các trứng đã được thụ tinh Phương pháp phẫu thuật hoặc không phẫu thuật Sự thành công phụ thuộc chủ yếu vào sự chín của tinh trùng (sự hoạt hoá) và tế bào trứng. Hơn nữa, để có thể có được một con bê ra đời qua con đường phôi cấy vào tử cung tử cung bằng phương pháp không phẫu thuật thì phôi đó phải được nuôi cấy cho đến khi có 8 tế bào hoặc cho tới giai đoạn phôi nang thì càng tốt. Những ví dụ về IVF bò được ghi trong bảng 5. Bảng 5. Những thành tựu chủ yếu đối với kỹ thuật IVF trên bò ở Nhật Bản Tác gia, Cơ quan, năm Điều kiện nuôi trứng chín IVM Điều kiện xử lý tinh trùng Điều kiện nuôi cấy sau IVF Kết quả Hanada et al. (Viện Quốc gia, 1985) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Tử cung thỏ Đẻ (chết khi sinh) Hanada et al. (Viện Quốc gia, 1986) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Tử cung thỏ 2 bê Shimohira et al. (Viện Quốc gia, 1986) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Tử cung thỏ 3 bê, bao gồm 2 bê sinh đôi Fukushima et al. (Viện Nuôi chín in vitro không Caffein + Ca++ Tử cung thỏ 3 bê Quốc gia Hyogo, 1987) hormone Kajiwara et al. (Trường ĐH Kagoshima, 1987) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Nuôi cấy in vitro cùng T.bào Cumulus Phôinang trương nở? (13%) Fukuda et al. (Trường Kitazaro, 1987) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Nuôi cấy in vitro cùng T.bào Cumulus Phát triển thành phôi nang (11%) Aoyagi et al. (Trường ĐH Kitazato, 1987) Nuôi chín in vitro cùng với hormone Caffein + Ca++ Nuôi cấy in vitro cùng T.bào Cumulus 3 bê sinh ra Hiệp hội Nuôi Caffein ống 40-50 bò phát triển gia súc, 1987 chín in vitro cùng với hormone + Ca++ dẫn trứng thỏ chửa Trong năm 1985, Hanada et al. (Viện Chăn nuôi quốc gia - Bộ Nông Lâm Ngư nghiệp) thành công trong việc tạo ra một con bê IVF, tuy nó bị chết sau khi sinh. Trước đó vài năm, đã có nhiều kết quả được báo cáo ở nhiều viện nghiên cứu của Nhật, đáng chú ý nhất là báo cáo của Shimodaira et al. (1986), nhân viên Trường Kitazato và Trường Kagoshima. Shimodaira cấy truyền trứng đã thụ tinh đông lạnh (phôi dâu và phôi nang thu hoạch từ tử cung thỏ), trong khi tại hai trường đại học trên,? người ta nuôi cấy in vitro các tế bào trứng đã được IVF thay cho việc nuôi cấy trong tử cung thỏ đến khi chúng phát triển thành phôi nang, sau đó được cấy truyền và phát triển đến khi bò mẹ đẻ. Trong tương lai gần, các tế bào trứng sau khi IVF, được đông lạnh để bảo quản, xác định giới tính và nuôi cấy in vitro cho đến khi phát triển thành phôi nang. 3. Hoạt hoá tinh trùng Tinh trùng sau khi khai thác từ bò đực, nếu không được hoạt hoá, không thể tiến hành IVF. Cần đặt tinh trùng trong một ống khoảng 4-6 giờ để làm tăng khả năng thụ tinh của chúng. Mặc dù có nhiều điều không thể làm sáng tỏ được về vấn đề tại sao hoạt hoá lại là nguyên cớ, có thể có một số yếu tố cản trở chống lại sự thụ tinh đã được loại bỏ sau khi hoạt hoá. Có một số thay đổi ở đầu tinh trùng (sau khi được hoạt hoá) ngay trước lúc thâm nhập vào tế bào trứng và được gọi là phản ứng acrosome. Với chuột nhắt, chuột cống, thỏ và người: có thể dễ dàng tạo con non từ IVF, vì tinh trùng có thể được hoạt hoá bằng cách rửa vài lần để loại bỏ tinh thanh (seminal plasma) và nuôi cấy một thời gian trong môi trường nuôi cấy. Nhưng phương pháp này vẫn chưa có hiệu quả đối với bò. Hiện nay đã có một phương pháp thu hoạch tinh từ cơ quan sinh dục, sau đó nuôi cấy chúng trong đường sinh dục đã được lấy ra ngoài của bò cái hoặc từ một số động vật khác, hoặc nuôi cấy chúng trong môi trường bao gồm dịch nang trứng hoặc một số hoá chất khác (Ca++, heparin, chondroitin, v.v...). Brackett et al. (1982) là người đầu tiên tạo được bê từ IVF, và một số tác gia? khác đã tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau. 1.1. Phương pháp của Brackett? et al. (1982) Nuôi cấy tinh trùng trong dịch chứa nồng độ ion cao (HIS, khoảng 380 mOsm/kg) trong 5 phút, rửa chúng và nuôi cấy tiếp trong 3/4 đến 5 giờ. Phương pháp xử lý bằng HIS này được phát triển như là một cách để loại bỏ tinh thanh bám trên bề mặt tinh trùngđực giống. Một số tác gia cho rằng phương pháp này có hiệu quả đối với tinh trùng thỏ và bò, trong khi một số khác lại thất bại. Phương pháp này có thể có ích trong quá trình hoạt hoá. 1.2. Phương pháp của Hanada et al. (1986) Pha loãng tinh dịch bằng cách thêm môi trường nuôi cấy tổng hợp có chứa một ít caffein nhưng không có albumin huyết thanh bò (BSA). Xử lý chúng cùng với ion A trong một thời gian ngắn (0,1mM, 60 giây) và hoạt hoá trong môi trường nuôi cấy có bổ sung BSA. Ion A được cho là giúp tinh trùng lấy Ca++ và có hiệu lực đối với phản ứng acrosome tinh trùng, làm cho chúng dễ thâm nhập vào trứng. 1.3. Phương pháp của Lu et al. (1987) { kế thừa phương pháp của Parrish (1986)} Xử lý tinh trùng đông lạnh bằng cách nhúng ngập tinh trùng ở phần thấp của môi trường nuôi cấy, giữ chúng ở đấy và sử dụng những tinh trùng bơi lên phía trên (tinh trùng hoạt động- active sperms). Phương pháp này thường áp dụng cho người, sau đó xử lý chúng 15 phút trong heparin để hoạt hoá. Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,4 để hoạt hoá và 7,8 để thụ tinh vì pH có tác động tới cả hai quá trình này. 4. Nuôi chín tế bào trứng Tinh trùng đã hoạt hoá vẫn có thể không có khả năng thụ tinh tế bào trứng, sự thâm nhập của chúng tạo nên sự thụ tinh không bình thường. Khi sử dụng tế bào trứng gần rụng hoặc đã rụng trong tử cung (giai đoạn phân chia chín thứ cấp), có thể tạo được sự thụ tinh bình thường. ở người, dễ dàng nhận biết nang trứng chín trong buồng trứng nhờ đo hàm lượng hormone hoặc dùng phương pháp đo siêu âm. ở bò, đã có các nghiên cứu đo bằng siêu âm để xác định thời điểm trứng rụng. Có thể dùng nội soi để thu hoạch tế bào trứng ngay trước hoặc sau khi rụng. Có thể sử dụng tế bào trứng chưa chín cho IVF bằng cách nuôi chín chúng bên ngoài cơ thể. Hiện nay có thể dễ dàng nuôi cấy tế bào trứng đến giai đoạn phân chia chín thứ cấp. Tuy nhiên tỷ lệ thụ tinh in vitro thành công vẫn còn thấp (30-60%), có thể là do quá trình thụ tinh không chỉ phụ thuộc vào sự chín của nhân, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của nhân, tế bào chất và độ tròn rõ của vòng trong suốt. Đã có nhiều nghiên cứu về toàn bộ các vấn đề liên quan đến nang trứng, bao gồm cả ảnh hưởng của các loại hormone và các tế bào lớp màng hạt. 5. Sự phát triển sau khi thụ tinh Các nghiên cứu gần đây về IVF bò đã thành công 60-90% (tinh trùng thâm nhập được vào tế bào trứng và tạo tiền nhân). Vấn đề quan trọng hiện nay là cấy truyền các trứng đã thụ tinh và theo dõi cho tới lúc bê sinh ra. Các tế bào trứng cần đạt tới giai đoạn 8 tế bào trước khi cấy truyền vào tử cung bò mẹ (phương pháp không phẫu thuật). Hiện nay thường dùng các tế bào trứng thụ tinh phát triển tới 2-4 tế bào để? cấy truyền vào tử cung thỏ hoặc cừu; sau đó 4-6 ngày, cấy chuyển trở lại vào tử cung bò. Khi đó chúng đã phát triển thành phôi dâu hoặc phôi nang (bảng 3). Trong tương lai gần có thể phát triển trứng đã thụ tinh trong môi trường nuôi cấy tổng hợp. Các quá trình nuôi chín, thụ tinh và phát triển (tới phôi nang) sẽ được tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhằm tăng cường khả năng thực hành cấy truyền phôi và bảo quản lạnh phôi. 6. ứng dụng của kỹ thuật IVF ở người, IVF dùng chữa chứng vô sinh cho những phụ nữ có buồng trứng và tử cung bình thường nhưng ống dẫn trứng không bình thường hoặc cho những đàn ông không có đủ tinh trùng. ở bò, IVF đang có triển vọng ứng dụng rộng rãi, và nó bao gồm cả việc cấy truyền phôi (bảng 6). Bảng 6. ứng dụng IVF cho bò và cấy truyền phôi Khả năng ứng dụng 1 Lai tạo nhiều giống khác nhau trong cùng thời điểm 2 Sử dụng tế bào nang trứng chưa chín 3 Tạo bê sinh đôi. Bảo quản lạnh các tế bào trứng. Tạo trứng thụ tinh có 2-4 tế bào, áp dụng cho xác định giới tính, cấy chuyển nhân và gen. 4 Tạo bê từ các bò khó phối giống hoặc bị bệnh nặng 5 Đóng góp cho các nghiên cứu về sinh lý thụ tinh, v.v... Hiện nay mỗi bò chỉ có thể thu được 4-6 tế bào trứng phù hợp với việc cấy chuyển (kể cả khi gây siêu bài noãn) và số lượng này còn hạn chế hơn nữa nếu phối cho bò trong cùng một giống. Nếu các phương pháp được thiết lập để sử dụng số lượng lớn các tế bào trứng thu hoạch được sau khi gây rụng trứng nhiều và tế bào nang trứng chín in vitro để đem thụ tinh với tinh trùng thuộc giống bò khác, thì việc thụ tinh của nhiều giống khác nhau có thể tiến hành cùng một lúc. Tuy nhiên, nếu tìm ra các mối tương quan giữa tỷ lệ thành công của IVF và tỷ lệ thành công của thụ tinh nhân tạo thì sẽ giúp đánh giá được khả năng của bò đực lấy tinh. Một bê cái mới sinh ra có khoảng 500.000 nang trứng thứ cấp trên buồng trứng. Nếu thu thập các tế bào trứng non từ các nang trứng đó, nuôi chín in vitro và sử dụng cho IVF, sẽ tạo ra được số lượng lớn tế bào trứng thụ tinh. Các tế bào trứng thụ tinh này có thể dùng để tạo bê sinh đôi, bảo quản lạnh, tạo tế bào trứng thụ tinh có 2-4 tế bào, xác định giới tính, cấy chuyển nhân và gen, v.v... Hơn nữa, nếu các tế bào trứng được bảo quản lạnh trước khi thụ tinh sẽ giúp chữa vô sinh cho các con bò có ống dẫn trứng không bình thường. Có thể cấy chuyển gen của những con bò có chất lượng cao nhưng bị bệnh nặng do phối giống lặp lại nhiều lần. Quá trình cấy truyền phôi bò sẽ đóng một vai trò hết sức quan trọng trong các nghiên cứu cơ bản đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh, sự phát triển trong giai đoạn đầu? của tế bào trứng thụ tinh, v.v..../.