Thực hành phân tích thực phẩm - Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp hố học

Bài 3: Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp hố học Tinh bột là thành phần chủ yếu của nhiều loại củ và hạt, việc xác định đúng sẽ giúp ta dự kiến chính xác lượng sản phẩm thu được cũng như tổn thất trong quá trình sản xuất. Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột có nhiều nhưng có thể chia làm 3 nhóm: Phương pháp quang học: dựa vào khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của tinh bột. Phương pháp hố học: dựa trên cơ sở thuỷ phân tinh bột đến glucose bằng axid, sau đó xác định khả năng khử của dung dịch. Phương pháp sinh học: dựa trên cơ sở thuỷ phân tinh bột bằng amylaza, sau đó đem lên men dịch đường để biến thành rượu rồi xác định lượng rượu tạo thành. Nguyên tắc: Thuỷ phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 5% ở điều kiện đung sôi trong bình cách thuỷ trong thời gian 1 giờ. Dung dịch sau thuỷ phân được làm nguội và trung hồ bằng NaOH với chỉ thị methyl da cam. Hàm lượng đường trong dung dịch sau thuỷ phân có thể được xác định bằng nhiều phương pháp, tuy nhiên trong phạm vi bài thí nghiệm này hàm lượng đường được xác định bằng phương pháp lên màu với Ferrycyanure. Kết quả lượng đường khử trong dung dịch sau thuỷ phân trừ đi lượng đường khử trong dung dịch trước thuỷ phân chính là lượng đường hình thành từ quá trình thuỷ phân tinh bột. Hiệu số này nhân với hệ số chuyển đổi đường khử ( glucose) thành tinh bột là 0.9 ta sẽ có được hàm lượng tinh bột trong mẫu nguyên liệu ban đầu. II. Dụng cụ – Hố chất Dụng cụ: Bình định mức dung tích 100, 250ml Bình tam giác dung tích 250ml Cốc thuỷ tinh 100, 250ml Phễu thuỷ tinh Oáng đong dung tích 100ml Oáng sinh hàn khí Nồi cách thuỷ Bếp điện Cân phân tích có độ chính xác 0.001g Nhiệt kế đo được đến 100C 2. Hố chất: Axit chlohidric đặc Dung dịch Ferrycyanure 1% Dung dịch glucose 0.5% Dung dịch hydroxyl natri 20% (5N) Dung dịch hydroxyl natri 10% (2.5N) Methyl da cam (CH3COO)2Pb 10% Na2HPO4 bão hồ Methylene Blue III. Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử xác định hàm lượng đường khử ban đầu trong mẫu: Cân và cho vào cối sứ chính xác 5.01g bột, trộn với 30ml nước cất, chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình tam giác 100ml. Sau đó, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch acetate chì 10%(2 – 5 ml) hoặc CHCl3 5%, sau đó loại bỏ lượng acetate chì dư bằng dung dịch Na2HPO4 bão hồ (3 – 5 ml) thên với lượng vừa đủ để kết tủa hồn tồn acetate chì dư. Để yên hỗn hợp trong 10 phút, chuyển vào bình định mức 100ml, tráng kỹ, thêm nước cất tới vạch định mức và đem lọc. Nước lọc được mang đi chuẩn độ dung dịch Ferrycyanure 1% Cho dung dịch acetate chì 10%(2 – 5 ml) hoặc CHCl3 5% Cho dung dịch Na2HPO4 bão hoà (3 – 5 ml) 5.01 g bột trộn với 30ml nước cất rồi chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình tam giác 100ml ơi1 Đem đi chuẩn độ dung dịch Ferrycyanure 1% lọc Để yên 10 phút, tiến hành định mức trong bình định mức 100ml 2. Chuẩn bị mẫu thử xác định hàm lượng tinh bột: Cân 2.00g bột rồi chuyển tồn bộ vào bình tam giác 250ml. Tiếp theo cho thêm 100ml HCl 5%, nay nắp lại. Lắc nhẹ rồi đặt vào nồi đun cách thuỷ, đun tới sôi và cho sôi khoảng 1 giờ. Mức nước ở nồi cách thuỷ phải luôn cao hơn mức nước trong bình thuỷ phân, phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào. Sau 1 giờ thuỷ phân, tồn bộ lượng tinh bột đã chuyển hố thành glucose, làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi cho thêm 4 – 5 giọt methyl da cam, dùng NaOH 20% để trung hồ axit tới đổi màu (từ hồng chuyển sang vàng) Chú ý: Chỉ trung hồ khi đã làm nguội đến 300C vì ở nhiệt độ cao và kiềm cục bộ thì glucose sẽ bị phân huỷ làm kết quả kém chính xác. Trung hồ xong ta chuyển tồn bộ dung dịch vào bình định mức 250ml, tráng kỹ, thêm nước cất tới vạch định mức, lắc kỹ và đem lọc. Dịch đường thu được sau khi lọc mang đi chuẩn độ dung dịch Ferrycyanure 1%. Đun cách thuỷ (đun sôi – cho sôi 1 giờ) Cho 100ml dung dịch HCl 5% đậy nắp, lắc nhẹ 2.00 g bột trong bình tam giác 250nl định mức trong bình định mức 250ml Chuẩn độ với NaOH 20% (màu hồng chuyển sang màu vàng) Làm nguội, cho 4-5 giọt methyl da cam Đem đi chuẩn độ dung dịch Ferrycyanure 1% Lọc 3. Tiến hành chuẩn độ: Cho vào bình nón 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2.5 dung dịch NaOH 2.5N, thêm vào 1 giọt Methylene Blue. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử hoặc dịch đường sau thuỷ phân từ burette, cho từng giọt, lắc mạnh. Dung dịch sẽ chuyển từ đỏ sang vàng và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh Methylene Blue cho biết phản ứng kết thúc. Sau lần chuẩn độ đầu tiên mang tính định hướng ấy, tiến hành chuẩn độ lần thứ 2. Lần này sau khi đun sôi dung dịch Ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước ), chỉ để lại dưới 1ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối. Kết quả tính tốn chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ 2 trở đi. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. 4. Xác định lượng đường glucose chuẩn 0.5% tiêu tốn để phản ứng hết với 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% Chuẩn độ tương tự như đối với dung dịch đường khử nhưng thay dung dịch đường khử trên burette bằng dung dịch đường glucose chuẩn 0.5%. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Chú ý: Với những dung dịch đường không màu hoặc có màu nhạt, ta có thể không cho chỉ thị Methylene Blue, chỉ xác định điểm cuối khi màu của dung dịch chuyển từ màu vàng đậm (Ferrycyanure) sang màu vàng rất nhạt (Ferrocyanure). Đun sôi, chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử, dịch đường sau thuỷ phân hoặc dung dịch đường glucose chuẩn 0.5% Bình nón: - 10ml K3Fe(CN)6 1% - 2.5ml NaOH 2.5N - 1 giọt Methylene Blue IV. Tính kết quả: Thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng cho chuẩn độ (Vg) Vg1 = 2.60ml Vg2 = 2.60ml Vg3 = 2.70ml Vg4 = 2.50ml Vgtb = = 2.63ml Thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (VK) VK1 = 13.4ml VK2 = 13.5ml VK3 = 13.5ml VK4 = 13.4ml VKtb= = 13.47ml Thể tích dung dịch đường sau thuỷ phân dùng chuẩn độ (VTP) VTP1 = 2.00ml VTP2 = 1.90ml VTP3 = 1.60ml VTP4 = 1,90ml VTPtb= = 1.93ml Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu: XK = * Vg* = *2.63** = = 1.95 g/100g XK: Lượng đường khử ban đầu (g/100g) Vg: Thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng cho chuẩn độ (ml) VK: Thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (ml) V: Thể tích bình định mức đường khử (ml) m: Khối lượng mẫu thí nghiệm (g) Hàm lượng đường khử trong dịch thuỷ phân: XTP = * Vg* =*2.63** = = 85.17g/100g XTP: Lượng đường khử trong dịch thuỷ phân (g/100g) Vg: Thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng cho chuẩn độ (ml) VTP: Thể tích dung dịch đường sau thuỷ phân dùng chuẩn độ (ml) V: Thể tích bình định mức (ml) m: Khối lượng mẫu thí nghiệm (g) Hàm lượng tinh bột trong mẫu: X = (XTP – XK) * 0.9 = (85.17 – 1.95)* 0.9 = 74.9g/100g X: lượng tinh bột có trong mẫu ban đầu (g/100g) 0.9: hệ số chuyển hố glucose thành tinh bột V. Biện luận và giải thích: 1. Biện luận: Nhìn vào kết quả chuẩn độ bằng 2 loại dung dịch: Loại 1: dung dịch đường khử. Loại 2: dung dịch đường sau thủy phân. Ta thấy: thể tích dung dịch đường khử tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ cao hơn rất nhiều so với thể tích dung dịch đường sau thủy phân cũng tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ như trên. Kết quả chuẩn độ: Thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (VK) VK1 = 13.4ml VK2 = 13.5ml VK3 = 13.5ml VK4 = 13.4ml Thể tích dung dịch đường sau thuỷ phân dùng chuẩn độ (VTP) VTP1 = 2.00ml VTP2 = 1.90ml VTP3 = 1.60ml VTP4 = 1,90ml 2.Giải thích: Kết quả chuẩn độ bằng 2 loại dung dịch trên có sự chênh lệch cao như vậy là do trong dung dịch đường khử có hàm lượng đường thấp nên sự tiêu tốn thể tích sẽ nhiều, còn trong dung dịch đường sau thủy phân có hàm lượng đường cao nên sự tiêu tốn thể tích sẽ ít hơn. Như vậy: từ đây ta có thể kết luận nếu dung dịch chuẩn độ có hàm lượng đường cao thì thể tích tiêu tốn sẽ ít đi. Còn dung dịch chuẩn độ có hàm lượng đường thấp thì thể tích tiêu tốn sẽ nhiều hơn. VI. Các phương pháp khác: Phương pháp hóa học: xác định bằng cách đo cường độ màu của tinh bột với Iot hoặc bằng cách định lượng glucose tạo thành sau khi thủy phân tinh bột bằng axit hoặc bằng enzyme amylase. Cách tiến hành: Cân 200 – 250 mg tinh bột cho vào bình cầu dung tích 100 ml. Cho thêm vào bình 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 30 – 45 phút rồi đem lọc để loại bỏ đường tan. Rửa tinh bột bằng nước cất 2 – 3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vào bình cầu chứa 25 ml dung dịch HCl 5%. Đậy kín bình bằng nút cao su. Đun cách thủy hỗn hợp 3 – 5 giờ. Thử sự thủy phân lên tồn tinh bột bằng dung dịch Iot. Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH = 5.6 – 6. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, kết tủa protein bằng acetate chì 10%. Loại bỏ acetate chì dư bằng dung dịch Na2HPO4 bão hồ. Cho nước cất định mức tới vạch. Tiến hành lọc. Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5 ml hoặc 10 ml) bằng phương pháp Bectrand. Công thức tính hàm lượng tinh bột: X = X : Hàm lượng tinh bột (%) a: số mg glucose tra bản tính được (ứng với số ml KMnO4) dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm trừ đi số ml KMnO4 dùng chuẩn độ mẫu chung với chúng. V1: thể tích dung dịch đường (sau thủy phân) lấy để xác định đường glucose (ml) V: thể tích bình định mức 100: hệ số chuyển thành % Phương pháp cực phổ Phương pháp khúc xạ kế Phương pháp hóa sinh VII. Chứng minh công thức: Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu: 10ml K3Fe(CN)6 Vglucose 0.5% 10ml K3Fe(CN)6 Vkhử X% Vg* 0.5% = VK* X% = = (trong 100 ml dung dịch) Định mức 100 ml nên ta có công thức: XK = * Vg* Hàm lượng đường sau thủy phân: 10ml K3Fe(CN)6 Vglucose 0.5% 10ml K3Fe(CN)6 VTP X% Vg* 0.5% = VTP* X% = = (trong 250 ml dung dịch) Định mức 250 ml nên ta có công thức: XK = * Vg* Hàm lượng tinh bột trong mẫu: Tinh bột (C6H10O5)n n C6H12O6 + n H2O Lập tỉ số giữa tinh bột và đường ta có: è Hệ số là 0.9