Tiểu luận Hệ vi sinh vật trong sữa

sữa thủ công hoặc cơ giới hóa), ta thường phát hiện có rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Nguồn gốc của các vi sinh vật trên xuât phát từ: Bầu vú của động vật cho sữa; người vắt sữa; thiết bị vắt sữa; thiết bị chứa; môi trường chuồng trại nơi diễn ra quá trình vắt sữa… 1. Bầu vú động vật cho sữa Trên cơ thể động vật, đặc biệt là khu vực bầu vú và những khu vực lân cận có rất nhiều loài vi sinh vật khac nhau.Chúng tồn tại dưới dạng tế bào sinh dưỡng hoặc bào tử. Trong quá trình vắt sữa, một số vi sinh vật từ các khu vực trên “ bị rơi” vào bình chứa lam cho sữa bị nhiễm vi sinh vật. Như vậy , trước khi vắt sữa bò, ta cần phải vệ sinh bầu vú và các khu vực lân cận trên cơ thể đông vật cho sữa để hạn chế số lượng vi sinh vật nhiễm vào sữa. Một số vi sinh vật tại khu vực bầu vú có thể chui vào các tuyến trong của núm vú. Tuy nhiên, khi bò có tình trạng sức khỏe tôt thì số lượng vi sinh vật cư ngụ tại các tuyến trong của núm vú không nhiều và thông thường chúng thuộc nhóm vi sinh vật “vô hại”, không sinh độc tố. Mỗi lần vắt sữa, người ta tháo bỏ những dòng sữa đầu tiên. Khi đó, các vi sinh vật cư ngụ tại tuyến trong của núm vú dễ dàng bị cuốn trôi theo. Như vậy, ta sẽ hạn chế được sự nhiễm vi sinh vật trong quá trình thu hoạch sữa tuoi. Trong truongf hợp động vật bị bệnh viêm vú, số lượng vi sinh vật, đặc biệt là ca svi khuẩn cư ngụ tại tuyến trong núm vú sẽ tăng rất nhiều. Khi đó, sữa tươi dễ bị nhiễm nhiều vi sinh vật và có chất lượng kém. Con vật cần phải được chữa trị, nếu không sẽ gây ra những tổn thất kinh tế đáng kể cho việc khai thác và chế biến sữa. 2. Người và thiết bị vắt sữa Nếu trong quá trình vát sữa được thực hiên bằng phương pháp thủ công, để hạn chế nhiễm vi sinh vật vào sữa, người vắt sữa phải có sức khỏe tốt và bệnh truyền nhiễm. Ngoài ra, tình trạng vệ sinh cơ thể và các thao tác kĩ thuật của người vắt sữa cũng sẽ ảnh hưởng tới số lượng vi sinh vật có trong sữa. Nếu quá trình vắt sữa được thực hiện bằng má, cần chú ý vệ sinh cẩn thận và vô trùng hệ thống dẫn sữatừ bầu vú con vật đến dụng cụ chứa đựng. Đây là nguồn dễ lây nhiễm vi sinh vật cho sữa. 3. Thiết bị chứa sữa Các thiết bị hoặc dụng cụ chứa cân phải được vệ sinh sạch sẽ và vô trùng ( nếu có thể) trước khi đựng sữa tươi. Đối với các hộ chăn nuôi bò sữa quy mô nhỏ, ý thức và phương pháp cệ sinh dụng cụ đựng sữa chưa được quan tâm đúng mức nên đây là nguồn gây nhiễm vi sinh vật phổ biến cho sữa. 4. Môi trường chuồng trại nơi vắt sữa Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong thế giới chúng ta sống. Chúng tồn tại trong đất cát, trong nước, trên trong cơ thể động vật, trong không khí… Do đó, môi trường chuồng trại nơi vắt sữa bò cung là nguồn có thể lây nhiễm vi sinh vật cho sữa. Điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam rất thuận lợi cho các VSV ưa ấm (mesophile) tồn tại và phát triển. Để hạn chế việc nhiễm VSV vào sữa ta cần vệ sinh và tẩy trùng chuồng trại thường xuyên. II. Hệ vi sinh vật trong sữa Hệ VSV và số lượng của chúng trong sữa luôn thay đổi và phụ thuộc vào mức độ nhiễm VSV trong quá trình vắt sữa. Các VSV có thể được chia thành hai nhóm chính: procaryote và eucaryote. Dưới đây là những VSV thường thấy trong sữa bò tươi. A. Procaryote Nhóm VSV prokaryote có nhân chưa hoàn chỉnh. Vùng nhân chỉ là mạch AND xoắn kép nằm trong tế bào chất, lưu giữ các thông tin di truyền cho tế bào. Đại diện quan trọng cho nhóm prokaryote là vi khuẩn ( Bacteria). Số lượng vi khuẩn trong sữa bò tưới sau khi vắt có thể dao động từ vài nghìn tới vài triệu khuẩn lạc (colony forming units CFU) trong 1ml sữa. Sữa được đánh giá là có chat lượng vệ sinh khá tốt khi tổng số vi khuẩn trong 1ml sữa không lớn hơn 100.000 khuẩn lạc. Các hình thức sinh sản của vi khuẩn Chúng sinh sản theo phương pháp vô tính(asexual reproduction) phổ biến nhất là phương pháp nhân đôi. Theo phương pháp này,trong một tế bào vi khuẩn ,vùng nhân với các vật chất di truyền AND sẽ được nhân đôi. Tiếp theo là sự sinh tổng hợp thêm các cơ quan con trong tế bào. Sau cùng tế bào vi khuẩn sẽ dược chia thành hai tế bào mới với thành phần vật chất di truyền như nhau. Thời gian cho quá trình nhân đôi của một tế bào vi khuẩn thường kéo dài từ 20-30 phút và được gọi là thời gian thế hệ (generation time). Giả sử tại thời điểm ban đầu, số tế bào vi khuẩn trong sữa chỉ là một tế bào /ml. với thời gian thế hệ là 30 phút ,sau 10 giờ bảo quản ở nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng cùa VSV ,số tế bào vi khuẩn trong sữa sẽ tăng đến giá trị hơn một triệu tế bào /ml. tuy nhiên ,sự gia tăng số tế bào vi khuẩn sẽ bị giới hạn bởi hàm lượng các chất dinh dưỡng có trong sữa . ngoài ra, chính sự tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất do VSV tiết vào sữa có thể ức chế sự trao đổi chất và sự sinh trưởng của chúng. Trong thực tế,ta sử dụng nhiệt độ thấp để kìm hãm sự sinh sản của vi khuẩn nói riêng và hệ VSV nói chung trong quá trình bảo quản sữa. Các vi khuẩn thường gặp trong sữa là vi khuẩn lactic, Coliform, vi khuẩn sinh acid butyric, vi khuẩn sinh aicd propyonic và các vi khuẩn gây thối. 1. Vi khuẩn lactic: Nó rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng thường được tìm thấy trên các loại rau, trái cây và trong hệ thong đường ruột của động vật. Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi, Gram (+). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu dao động trong khoảng 25-47oC. Để tồn tại trong môi trường sữa, vi khuẩn lactic tổng hợp năng luongj ATP từ cơ chất lactose. Acid lactic là một trong những sản phẩm được sinh ra từ quá trình tổng hợp năng lượng trên. Dựa vào nhóm sản phẩm được tổng hợp từ quá trình trao đổi năng lượng, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm : Vi khuẩn lactic đồng hình: acid lactic là sản phẩm chính và hàm lượng của nó có tỷ lệ vượt trội hơn nhiều so với các sản phẩm phụ khác. Vi khuẩn lactic dị hình: các sản phẩm được tạo thành từ quá trình chuyển hóa đường gồm : acid lactic, acid acetic, etanol và khí CO2… hàm lượng acid lactic không cao hơn nhiều so với các sản phẩm còn lại. Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa như yoghurt, kafir, phô mai, và một số loại bơ, người ta sư dụng vi khuẩn lactic để thực hiên một số chuyển hóa cần thiết. Giống vi khuẩn lactic trong sản xuất công nghiệp là những canh trường VSV thuần thiết được nhân lên qua nhiều cách từ một tế bào vi khuẩn ban đầu đã qua tuyển chọn. Còn các vi khuẩn có mặt trong sữa tươi sau khi vắt được xem là những VSV tạp nhiễm. Chúng sẽ tạo ra những chuyển hóa ngoài ý muốn của nhà sản xuất trong qúa trình bảo quản sữa trước khi chế biến ( giảm pH, đông tụ casein, xuất hiện các hợp chất mới trong sữa như : etanol, acid acetic…làm thay đổi thành phần và giá trị cảm quan của sữa). Các vi khuẩn lactic nhiễm vào sữa thuộc nhiều nhóm khác nhau như: Streptococcus, Lactoccus, Lactobacillus, Leuconostoc, Bifidobacterium… chúng gồm các nhóm vi khuẩn lên men đồng hình lẫn dị hình. Khi thanh trùng ở 80oC, hầu hết các vi khuẩn lactic nhiễm trong sữa sẽ bị tiêu diệt. Hình 1. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic L24 chụp dưới kính hiển vi điển tử ở độ phóng đại x 20 000 lần 2. Vi khuẩn Coliform Nó được tìm thấy trong đường ruột hệ tiêu hóa động vật và trong phân . người ta cũng tím thấy trong đất,nước hoặc thực vật nhiễm phân có chứa coliform. Coliform thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-),kị khí tùy tiện. nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm trong khoảng 30-440C . Trong sữa, vi khuẩn colifrom sẽ chuyển hóa đường lactose tạo acid lactic và các acid hữu cơ khác ,khí CO2, H2…chúng cũng phân giải protein trong sữa tươi tạo ra các sản phẩm khí làm cho sữa có mùi khó chịu.Ở nhiệt độ 75oC trong khoảng thời gian 20 giây, vi khuẩn Coliform sẽ bị tiêu diệt. The major groups of bacteria are defined by shape. Coliform bacteria fall into the bacillus, or rod-shaped group. 3. Vi khuẩn acid butyric (giống Clostridium) : được tìm thấy trong đất, trên thực vật, trong phân… Do đó, chúng dễ bị nhiễm vào sữa. Là vi khuẩn Gram (+), thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc, Clostridium có khả năng sinh bào tử. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 37oC. Tế bào sinh dưỡng hình que, tuy nhiên do nội bào tử (endospore) có kích thước lơn hơn chiều ngang của tế bào sinh dưỡng nên tế bào chứa bào tử thườvng có dạng hình thoi hoặc dùi trống. Vi khuẩn Clostridium chuyển hóa đường trong sữa thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid butyric, butanol, ethanol, aceton, khí CO2, H2,…làm thay đổi thành phần hóa học và giá trị cảm quan của sữa trong quá trình bảo quản. Các bào tử Clostridium khá bền với nhiệt độ. Ví dụ như Clostridium sporogenes có giá trị D115oC=3,2 phút và D121oC=1,2 phút (D là thời gian tiệt trùng cần thiết ở nhiệt độ xác định để tổng số tế bào Clostridium trong sữa giảm đi 10 lần). Như vậy, quá trình thanh trùng sữa không thể tiêu diệt được hoàn toàn các bào tử Clostridium chịu nhiệt. Khi đó, ta phải dùng các giải pháp kỹ thuật như vi lọc, ly tâm hoặc sử dụng chất kháng khuẩn để loại bỏ hoặc ức chế Clostridium. Clostridium 4. Vi khuẩn propionic ( giống Propionicbacterium): được tim thấy trong dạ cỏ và đường ruột của nhóm động vật nhai lại, trong đất… Chúng có hình cầu, xếp thành đôi hoặc chuỗi, Gram(+), thuộc nhóm kỵ khí không bắt buộc. Nhiệt độ sinh trưởng tôi ưu của vi khuẩn là 30oC. Vi khuẩn propionic chuyển hóa đường thành acid propionic, acid acetic, khí CO2… làm hư hỏng chất lượng sữa. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất một số loại phô mai như Emmenthal, Gruyère…người ta sử dụng canh trường Propionicbacterium thuần khiết để tạo ra cấu trúc lỗ hỏng ( mắt phô mai) và hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Hầu hết các vi khuẩn propionic bị tiêu diệt khi thanh trùng sữa ở 75oC trong thời gian 20 giây. Vi khuẩn propionic 5. Vi khuẩn gây thối Đó là các vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease ngoiaj bào trong môi trường sữa. Protease sẽ xúc tác quá trình thủy phân protein tạo ra các sản phẩm polypeptyde, peptide và acid amin. Một số acid amin tiếp tục phân hủy tạo NH3, H2S… làm cho sữa có mùi khó chịu. Vài giống vi khuẩn gây thối có khả năng sinh tổng hợp lipase ngoại bào. Enzyme nay xúc tác quá trinh thủy phân các chất béo trong sữa và tạo nhiều sản phẩm có mùi ôi. Các giống vi khuẩn gây thối thường gặp trong sữa là: Pseudomonas, Brevibacterium, Achromobacter, alcaligenes, bacillus, Micrococcus,…Chúng có dạng hình cầu hoặc hình gậy thuộc nhóm kị khí lẫn hiếu khí. Trong tự nhiên, các vi khuẩn này thường tìm thấy trong phân, trong nước hoặc thức ăn gia súc…Đáng chú ý hơn cả là loài Pseudomonas fluorescens. Các enzyme protease và lipase được sinh bởi loài này rất bền nhiệt. Chúng là nguyên nhân chính gây nên quá trình phân giải protein ( proteolysis) và lipid (lipolysis), nhanh chống làm hư hỏng chất lượng sữa. Ngoài hai quá trình thủy phân nói trên mọt số vi khuẩn còn tạo khí ( CO2, H2,…) sinh tổng hợp cá acid hữu cơ làm giảm pH sữa và gây đông tụ protein. Một số vi khuẩn khác có thể sinh tổng hợp được protease có chức năng xúc tác tương tự như rennin làm xuất hiện sự đông tụ casein trong sữa. Bacillus cấu tạo Bacillus B. Eucaryote Nhóm VSV eukaryote có nhân hoàn chỉnh. Nằm trong tế bào chất, nhân được bao bọc bởi màng nhân, bên trong là các nhiễm sắc thể lưu giữ thông tin di truyền. Hai đại diên của nhóm thường được tìm thấy trong sữa là nấm men và nấm sợi. 1. Nấm men (yeasts): là những cơ thể đơn bào, thường có hình cầu ,oval hoặc có hình trứng…Nấm men được tìm thấy trong tự nhiên: trên thực vật, trong nước, đất,… Một số loài nấm maen thường gặp trong sữa như: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Debaromyces hansenii, Torulosis lactic condensi …Nhiều loài nấm men thuộc nhóm kỵ khí tùy tiện. Một số nấm men có thể sử dụng đường lactose cho quá trình trao đổi chất. Chúng phát triể trong sữa và gây ra những biến đổi về thành phần hóa học trong quá trình bảo quản sữa. Ở một số địa phương nấm men được sử dụng trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống từ sữa. Như ở Cộng Hòa Liên Bang Nga, kefir là sản phẩm lên từ sữa bởi hệ VSV gồm vi khuẩn lactic và nấm men. Các sản phẩm chính từ quá trình lên men như: etanol, acid lactic, CO2,…tạo vị chua và nồng đặc trưng cho kefir. Sự sinh sản của nấm men: Nấm men có thể sinh sản bằng phương pháp hữu tính (sexual reproduction) hoặc vô tính . Trong nhóm phương pháp sinh sản vô tính,nấm men tạo ra các tế bào mới theo kiểu nảy chồi hoặc phân đôi.trong phương pháp nảy chồi,đầu tiên trê tế bào nấm men sẽ xuất hiện một chồi nhỏ. Tiếp theo là quá trình nhân đôi của nhân và tổng hợp thêm các cơ quan con trong tế bào. Chồi sẽ từ từ lớn lên và khi đã chứa đủ các cơ cần thiết, chồi tách khỏi tế bào mẹ và tồn tại độc lập. quá trình nảy chồi có thể thực hiện cùng một lúc tại nhiều vị trí khác nhau trên thành tế bào mẹ. khi đó, nấm men sẽ có hình chum tế bào kết dính lại với nhau hoặc hình sợi giả ( pseudomycellium ). Trong nhóm phương pháp sinh sản hữu tính, thông thường hai tế bào nấm men sẽ tiếp hợp nhau tạo điều kiện cho sự tiếp hợp giữa hai nhân. Tiếp theo là sự phân chia vật chất di truyền tronh nhân và tạo thành các bào tử. mỗi tế bào sẽ mang thông tin di truyền từ hai tế bào ban đầu. sau cùng là quá trình giải phóng bào tử và sự chuyển hóa chúng về lại trạng thái tế bào sinh dưỡng. các tế bào sinh dưỡng náy có thể sẽ tiếp tục sinh sản theo phương pháp sinh sản hữu tính hay vô tính. Kluyveromyces marxianus 2. Nấm sợi (moulds): có dạng hình sợi, phân nhánh. Trong tự nhiên nấm sợi được tim thấy trong nhiều loại thực phẩm, quần áo, sách vở,…Trên một số vật liệu vô cơ dính bụi như thấu kính, máy ảnh, ống nhòm, …nấm sợi vẫn có thể phát triển, sinh acid và làm mờ các vật liệu này. Hầu hết các nấm sợi thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ sinh trưởng tôi ưu từ 20-30oC. Dưới đây là một số loài nấm sợi thường nhiễm vào sữa: Penicillium camembertii, P. roquefortii, P. casei, Geotrichum candidum, Rhizopus stolonifer… Trong số các nấm sợi nói trên, vài loài thuộc nhóm Penicillium được sử dụng trong một số loại phô mai. Việc nhiễm nấm sợi vào sữa gây nhiều khó khăn trong công nghệ chế biến sữa, đặc biệt là trong sản xuất phô mai và ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên, khác với nhóm vi khuẩn sinh bào tử chịu nhiệt, hầu hết các loài nấm men và nấm sợi đều bị tiêu diệt trong quá trình thanh trùng sữa ở 75oC trong thời gian từ 10-15 giây. Vấn đề quan trọng là phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về vệ sinh để tránh hiện tượng tái nhiễm VSV vào sữa sau khi đã qua thanh trùng. Hình thức sinh sản của nấm sợi : Chúng thường sinh sản theo phương pháp vô tính bằng cách tạo ra bào tử. sự phát triển của hệ nấm sợi kéo theo việc tổng hợp các bào tử nấm sợi với số lượng lớn. các bào tử này có thể tồn tại trong các điều kiện không thuận lợi về nhiệt độ,độ ẩm… gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ phát triển thành các hệ sợi nấm mới. Một số nấm sợi có thể sinh sản thao phương pháp hữu tính thông qua sự tiếp hợp và trao đổi vật chất di truyền giữa các sợi nấm. nấm sợi Như vây: sự sinh trưởng và sự trao đổi chất của hệ VSV có trong sữa là những quá trình sinh học quan trọng trong bảo quản sữa tươi. Sự sinh trưởng của VSV sẽ làm thay đổi sâu sắc thành phần hóa học và các tính chất cảm quan của sữa ( màu sắc, mùi ,vị …) để hạn chế những biến đổi sinh học trong quá trình bảo quản sữa ta cần sử dụng ba biện pháp kết hợp dưới đây: Đảm bảo các điều kiện vệ sinh trong giai đoạn vắt và vận chuyển sữa từ nơi thu hoạch về nhà máy chế biến, nhằm giảm đến mức tối đa hàm lượng VSV ban đầu có trong sữa. Tại nhà máy, nếu sữa tươi chưa đưa vào chế biến ngay thì có thể tiến hành thanh trùng sữa ( nhiệt độ 630C,thời gian 15 giây). Quá trình bảo quản sữa từ sau khi vắt đến trước khi chế biến phải được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt : nhiệt độ sữa không lớn 40C, tránh sự khoấy trộn và sự có mặt của oxy trong sữa. Theo Mahieu H (1985),nếu hàm lượng VSV trong sữa tươi không lớn hơn 10.000tb/ml, quá trình bảo quản sữa ở 40C có thể kéo dài trong ba ngày mà không có những thay đổi đáng kể về chất lượng sữa. tuy nhiên ,cần lưu ý rằng, sau ba ngày bào quản sữa cho dù ở nhiệt độ thấp ,tổng hàm lượng VSV trong sữa có thể tăng đến 1.000.000tb/ml. khi đó, những biến đổi làm hư hỏng chất lượng sữa do VSV sẽ diễn ra với tốc độ nhanh hơn. Nếu hàm lượng VSV trong sữa tươi sau khi vắt lên đến 50.000tb/ml, quá trình bảo quản sữa ở 40C chỉ có thể kéo dài trong hai ngày. Sau hai ngày, lượng VSV trong sữa sẽ tăng lên 1.000.000tb/ml. III. Chỉ tiêu vi sinh vật trong sữa tươi. Trước khi sữa được đưa thu mua từ các hộ gia đình tới nhà máy thì ta cần phải kiểm tra lượng VSV có trong sữa tươi. Đó là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của sữa tươi. Để xác định lượng VSV có trong sữa tươi ta xác định các chỉ sau: 1. Chất chỉ thị xanh metylen a) Nguyên tắc: dựa vào tính chất khử của enzyme reductaza làm mất màu xanh của chất chỉ thị xanh metylen. Enzyme reductaza do vi khuần tiết ra, lượng vi khuần càng nhiếu thì enzyme reductaza càng lớn và sự mất màu càng nhanh. b) Cách tiến hành : cho 10ml sữa vào ống nghiệm ( có nút) và 1ml xanh metylen. Lắc đều . đặt ống nghiệm vào nối cách thuỷ có nhiệt độ 37-380C là thích hợp cho reductaza . chú ý để mức nước bên ngoài ống nghiệm cao hơn mức sữa trong ống nghiệm . sau khi nhiệt độ trong ống sữa đạt 38-400C thì bắt đấu tính thời gian. Dựa vào kết quả thời gian mất màu,người ta phân loại chất lượng sữa theo phương pháp mất màu xanh metylen như sau: Thời gian mất màu( phút) Lượng vi sinh vật trong 1ml sữa Chất lượng sữa Xếp loại =< 20 >= 20 triệu Rất tồi IV 20-120 4-20 triệu Tồi III 120-330 500000-4 triệu Trung bình II >330 (5,5h) < 500000 Tốt I 2. Chất chỉ thị resazurin : dùng để phân loại sữa a) Nguyên tắc : sự thay đổi màu của chất chỉ thị này theo thời gian phụ thuộc vào sự hoạt động của vi sinh vật và tế bào thân thể hiện diện trong sữa. diều đó cũng có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta biết mức độ hoạt động của vi sinh vật hơn là số lượng của chúng. b) Cách tiến hành: lấy vào ống nghiệm ( đã được tiệt trùng) 10ml sữa và 1ml resazurin ,lắc đều . đặt vào nồi cách thuỷ 37-380C và tính thời gan thay đổi màu từ khi hỗn hợp đạt được nhiệt độ trên. Dựa vào sự thay đổi màu của hỗn hợp sữa và resazurin người ta phân loại sữa như sau: Thời gian mất màu(phút) Sự thay đổi màu Chất lượng sữa Xếp loại =< 20 Trắng Rất tồi IV Sau 1h Hồng Tồi III Sau 1h Xanh- tím Trung bình II Sau 1h Xanh ( không đồi màu) Tốt I 3. Xác định tổng lượng vi sinh vật hiếu khí: dùng để kiểm tra nguyên liệu sữa và các sản phẩm sữa. a) Nguyên tắc: phương pháp xác định số tế bào sống ( tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia, sinh sản). Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phat triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu. b) Cách tiến hành: Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu hai nồng độ 10-1 và 10-2. Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu thử vào giũa đĩa petri đã vô trùng, để dịch mẫu chảy tự do, khi mẫu đã chảy hết, chạm đầu pipet vào 1 chỗ khô trên đĩa. Rót vào đĩa khoảng 10-15 ml môi trường bột PCA 45oC. Dùng tay lắc xoay tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ cho môi trường cấy và dịch mẫu thử hòa đều với nhau. Để đĩa đông tụ tự nhiên trên mặt bàn thử ( khoảng 5 – 10 phút ). Bên cạnh, rót khoảng 10 ml môi trường PCA vào đĩa petri chỉ có nước pha loãng mẫu và đĩa petri vô trùng không có dịch mẫu. Khi môi trường đông đặc, lật ngược đĩa cho vào tủ ấm 32 -+1oC ur aams trong 24-48 giờ. Kết quả: Có thể đếm khuẩn lạc bằng mắt thường hoạc bằng máy đếm khuẩn lạc và đếm ngay sau thời gian ủ chấm dứt. Trong trường hợp không thể đếm ngay, có thể giữ đĩa ở 4oC nhưng không quá 24 giờ và không được xem đây là công việc làm thường xuyên. Sự phân bố của khuẩn lạc phaair hợp lí, tức là số lần pha loãng càng cao, thì số khuẩn lạc càng ít. Lấy số khuẩn lạc nằm trong phạm vi 30 – 300 nhân với số lần pha loãng để báo kết quả. Nếu cả hai độ pha loãng co số khuẩn lạc nằm trong phạm vi 30 – 300 thì sau khi nhân với độ pha loãng, tỷ lệ của chúng không lớn hơn 2 thì lấy số pha loãng thấp để báo cáo kết quả. Nếu số khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng đều ít hơn 30, thì lấy số khuẩn lạc ở độ pha loãng thấp nhất nhân với số lần pha loãng báo cáo kết quả. Nếu số khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng đều trên 300, thì lấy số xấp xỉ 300 nhân với số lần pha loãng báo cáo kết quả. Nếu sự phân bố của khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng đều không hợp lý thì kiểm tra lại. Nếu khuẩn lạc mọc loang quá ½ diên tích đĩa thì tính là 1 khuẩn lạc. 4. Xác định sự lên men: dùng kiểm tra sữa, các sản phẩm sữa và nguyên liệu. a) Nguyên tắc: dựa vào sự thay đổi màu sắc, sinh hơi của môi trường PRB và mẫu trong ống Durham. b) Cáh tiến hành: Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu 10-1. Tiến hành với mẫu 100 và 10-1. Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml mẫu dịch thử cho vào ống nghiệm chứa môi trường PRB tiêt trùng, lắc đều. Cho vào tủ ấm 32 +-1oC ủ trong 24 và 48 +-3 giờ. Kết quả: Dương tính: Màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng và sinh hơi trong ống Durham . Âm tính: Môi trường màu đỏ, có thể chuyển sang màu vàng nhưng không sinh hơi trong ống Durham. 5. Xác định Staphylococcus a) Nguyên tắc: dựa vào sự biến đổi màu khi nhuộm thuốc nhuộm giữa Staphylococcus với các loại khác bằng phương pháp nhuộm Gram . b) Cách tiến hành: Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu. Dùng pipet vô trùng chuyển 10ml dịch mẫu thử đã pha loãng 1/10 hay 1ml mẫu sữa dạng lỏng (sữa tươi) vào đĩa petri vô trùng, để dịch mẫu chảy tự do. Rót khoảng 10 -15 ml môi trường nuôi cấy champman vào đĩa mẫu. Dùng tay lắc xoay tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ cho môi trường cấy và dịch mẫu hòa đều vào nhau. Để đĩa đông tụ tự nhiên trên mặt bàn thử ( khoảng 10 – 15 phút). Môi trường đông đặc, lật ngược đĩa cho vào tủ ấm 32+-1oC ủ trong 48 +-3 giờ. Sau đó, chọn khuẩn lạc tròn, màu vàng nhuộm Gram và thử phản ứng sinh hóa (phản ứng đông huyết tương). Nhuộm Gram: Dùng que cáy dàn đều khuẩn lạc trên phiến kính sau đó cố định tiêu bản bằng cách đưa nhẹ qau ngọn lửa đèn cồn rồi để khô, tiếp đó cho 1 giọt C.violet để yên thuốc nhuộm trong vòng 1 phút, rồi rửa lại nước,làm khô, cho 1 giọt lodine để yên trong 1 phút, rửa nước, rửa cồn 950, rồi rửa nước làm khô cho 1 giọt Safranin để yên trong 30 giây rồi lại rửa nước, làm khô đậy lá kính đưa vào kính hiển vi quan sát. Thử phản ứng đông huyết tương: Dùng que khuấy chuyển khuẩn lạc đặc trưng vào ống nghiệm chưa 0,3 ml huyết tương. Ủ ở 37+-10C trong 24+-2 giờ. Kết quả: Đếm khuẩn lạc có màu vàng hoặc trắng với môi trường xunh quanh màu vàng, Quan sát trên kinh hiển vi: Saphylococcus bắt màu tím (Gr ++, có dạng chùm nho. Phản ứng đông kết: dịch cấy tạo khối đông, đây là phản ứng dương tính. Đếm những khuẩn lạc đặc trưng, Gr+, làm đông huyết tương suy ra số khuẩn lạc trên một mẫu thử. 6. Xác định colifom a) Nguyên tắc: sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc, cùng với sự sinh khí và thay đổi của môi trường nuôi cấy. b) Cách tiến hành: Dùng pipet đã vô trùng chuyển 10ml dịch mẫu đã pha loãng 1/10 hay 1ml mẫu sữa dạng lỏng ( sữa tươi). Rót vào đĩa petri đã vô trùng, để dịch/ mẫu chảy tự do, khoảng 10-15 ml trong môi trường DLA (vào đĩa mẫu). Dùng tay lắc xoay tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ cho môi trường cấy và dịch mẫu hòa đều vào nhau. Để đĩa đông tụ tự nhiên trên mặt bàn thử ( khoảng 5 – 10 phút). Đổ một đĩa đối chứng cho mỗi chai môi trường cấy. Sau khi môi trường đã đông hoàn toàn, rót thêm 3-4ml môi trường DLA tráng kín bề mặt đĩa để tránh khuẩn lạc mọc trên mặt và mọc loang. Môi trường đông đặc, lật ngược đĩa cho vào tủ ấm 32+-10C ủ trong 24+-3 giờ. Trong trường hợp khuẩn lạc trên 1 đĩa mọc chi chit, vi trùng coliform có thể mọc lạc kiểu, thông thường nhỏ hơn 0,5 mm. Ngoài ra, men vi sinhvaf một vài loại vi trùng khác có thể mọc những núm mang đặc tính tiêu biểu của coliform, phải thực hiện tiếp thí nghiệm kiểm chứng trên môi trường BGLB như sau: tách khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào ống nghiệm có ống Durham chứa môi trường BGLB. Các ống đã cấy đượclắc đều và ủ 32+-10C ủ trong 48+-3 giờ . Ngoài ra có thể lấy mẫu kiểm tra lại ( nếu có) với nhiều hệ số pha loãng khác nhau. Kết quả: Đếm số núm khuẩn lạc coliform trên môi trường DLA có đường kính 0,5mm hay lớn hơn, ở giũa màu đỏ sẫm, xunh quanh màu hồng. Kết quả kiểm chứng: nếu có sự khí và thay đổi màu môi trường thì khuần lạc nghi ngờ là coliform . 7. Xác định E.coli a) Dựa vào các phản ứng IMViC + + - - hay - + - - . b) Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử. Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường BGBL 2% ( mỗi nồng độ 3 ống thử). Cho vào tủ 35+-10C ủ trong 24+-3 giờ. Dương tính: màu môi trường thay đổi và có sinh hơi trong ống Durham. Âm tính: màu môi trường không thay đổi và không sinh hơi trong ống Durham. Dùng khuyên cấy đã khử dịch mẫu trong ống có phản ứng dương tính cấy ria qua môi trường DLA. Cho vào tủ ấm 35+-10C ủ trong 24+-3 giờ. Thử phản ứng sinh hóa với khuẩn lạc mọc trên môi trường DLA ( khuẩn lạc hình tròn dẹt và khô, đường kính 0,5 mm, màu đỏ). Thử indol: dùng khuyên cấy đã khử trùng chuyển vi khuẩn cânf x