Tiểu luận Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng sinh Penicillin bằng Enzyme cố định Penicillin Acylase

có chứa nhóm –COOH như CM-cellulose hoặc nhựa tổng hợp thì cần được hoạt hoá trước khi gắn kết với enzyme bằng các phương pháp axit, carbodiimit - -14 Vì phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH=5) nên phương pháp này đặc biệt thuận lợi với các enzyme có tính acid như pepsin.  Kết hợp đồng hoá trị giữa các phân tử enzyme với chất mang. Cố định enzyme bằng cách liên kết đồng hoá trị được thực hiện bằng cách khác nhau : 1/ Liên kết đồng hoa trị được tạo ra giữa các nhóm phản ứng của vật mang và enzyme; trong một số trường hợp vật mang cần được hoạt hoá sơ bộ; 2/ Các phân tử enzyme sau khi được hấp thụ trên chất mang hoặc nằm trong lòng phân tử chất mang liên kết với nhau nhờ tính lưỡng chức hoặc đa chức của chất phản ứng. Người ta thường dùng aldehyde glutaric để găn các nhóm amin của - -15 lysine ở các phân tử enzyme. Ví dụ,trypsine cố định trysin được điều chế bằng cách dùng aldehyde glutaric 2! Để liên kết các phân tử enzyme và gắn chúng vào aminoethylcelluse. 3.2 Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel Để gói enzyme vào khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá học các gel khi có mặt đồng thời enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp enzyme bị giữ chắc trong gel. Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách ép qua rây có lỗ nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ thấp.Dẩn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993)thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N,N’-methylenbisacrylamide. Phương pháp này thường dùng do chất trùng hợp thu được dể tạo thành dạng hạt và tuỳ thuộc vào điều kiện tiến hành mà gel có thể có độ xốp khác nhau. Sau đây là một số phương pháp “gói”enzyme. Các gel có thể được hình thành từ các polymer tổng hợp như acrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate, tạo phức càng cua bằng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyvinyl, polyuretan. Enzyme được hoà tan hoặc phân tán trong một dung dịch monomer và sau đó trùng hợp trong sự có mặt của một hay nhiều tác nhân tạo phức càng cua. Gel có thể cắt thành màng đặt trên một giá thể rắn, hoặc cũng có thể nghiền thành bột sau khi loại trừ nước. Alginate và caraghenan lấy từ rong biển thường có khả năng tao gel rất tốt và thuận lợi để bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn. Các enzyme cũng có thể bị “nhốt” trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp. Với cách này người ta cho dịch lỏng chảy bên trong sợi , do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp với lớp màng. Một nhũ tương của cellulose triacetate trong methylene chlorua và enzyme trong dung dịch đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất nito. Các sợi đi ra khỏi khuôn được nhúng vào một cái bể đông tụ có chứa toluel, sau đó được làm khô trong chân không. Các sợi này bền với acid yếu hoặc kiềm yếu, lực ion cao và chịu được một số dung môi hữu cơ. Tuy nhiên phương pháp này chỉ thích hợp đối với những enzyme khó bị mất hoạt tính trong các dung môi không hoà lẫn với nước. - -16 Phương pháp gói enzyme trong các bao vi thể (microcapsul). Enzyme được gói trong các bao vi thể có màng bán thấm được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ đẻ ngăn cản sự khuếch tán của enzyme ra ngoài và đủ lớn đẻ cơ chất đi vào và sản phẩm phản ứng đi ra dễ dàng. Có nhiều phương pháp gói enzyme trong microcapsul. Sau đây là một trong các phương pháp đó. Cho một dung dịch loãng chứa enzyme và monomer ưa nước trong một dung môi hữu cơ không hoà lẫn trong nước đễ tạo nhũ tương , sau đó thêm một monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo ra một màng bao quanh những giọt lỏng nhỏ. Thường phải thêm vào một tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương cũng như để điều chỉnh các capsul có khích thước mong muốn từ 1 đến 100 μm Phương pháp tiền polymer để gói các chất xúc tác sinh học. Cố định enzyme bằng phương pháp này có những ưu điểm như sau:  Quá trình gói rất đơn giản trong những điều kiện nhẹ nhàng.  Các chất tiền trùng hợp không chứa các monomer vốn có thể gây ảnh hưởng xấu đến enzyme đã được gói.  Cấu trúc lưới của gel có thể được điều chỉnh bằng cách dùng các tiền polymer có chiều dài chuổi bất kỳ.  Các tính chất hoá chất lý hoá của gel có thể dịnh hướng trước bằng cách chọn các tiền chất polymer thích hợp vốn đã được tổng hợp hoá học trong điều kiện vắng mặt enzyme. Dưới đây là một ví dụ về phương pháp tiền polymer. Đó là phương pháp tạo enzyme liên kết chéo giữa các tiền polymer bằng cách chiếu tia cực tím để gói enzyme. Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa chất tiền polymer và enzyme thì sẽ tạo ra các liên kết chéo giữa các gốc của tiền polymer và một gel được hình thành bao lấy enzyme. Sự gói enzyme bằng phương pháp này có thể tiến hành ở điều kiện nhẹ nhàng, tránh được các thay đổi pH quá kiềm hoặc quá acid, thời gian lại rất nhanh, chỉ trong vòng từ 3-5 phút. Với phương pháp này có thể gói enzyme, tế bào vi sinh vật hoặc các bào quan - -17 3.3 Cố định enzyme bằng phương pháp hấp thụ trên các chất mang hoăc không có điện tích. Với phương pháp này enzyme được hấp thụ trên các chất co hoạt tính bề mặt như than hoạt tính, cellulose, tinh bột ,dextran, collagen,…và một số nhựa trao đổi ion, silicagen, thuỷ tinh. Trong trường hợp chất mang không có lổ enzyme được đính vào chất mang thành từng lớp trên bề mặt, khi chất mang có lỗ thì các phân tử enzyme sẽ xâm nhập vào trong các lỗ. 4. Một số đặc tính của enzyme cố định Việc cố định làm thay đổi đáng kể nhiều tính chất của enzyme như độ bền, tính đặc hiệu, đặc điểm động học. Thông thường việc cố định làm tắng đáng kể độ bền của enzyme. Ví dụ , cố định protease làm tăng đọ bền với nhiệt gấp chục nghìn lần. Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của enzyme tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích của enzyme cũng được mở rộng. Nhiệt độ cao làm cho enzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba của enzyme bị phá vỡ và enzyme bị mất hoạt tính. Khi enzyme được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biến tính sẽ bị ngăn cản, làm cho enzyem chịu được nhiệt độ cao. Trong trường hợp đối với các enzyme thuỷ phân protein, ví dụ papain và trysin sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tượng tự phân. Điều này rất có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của enzyme. Một trong các nguyên nhân làm biến đổi tính chất của enzyme khi chúng được cố định trên các chất mang có điện tích. Ví dụ một chất trao đổi anion mang điện tích âm được bao quanh bởi một môi trường giàu proton, và vì thế pH trong các lớp nằm kế sát với cho đường cong phụ thuộc pH của hoạt tính enzyme cố định trên các chất mang anionit,cationit và trung tính sẽ khác nhau. 5. Một số ứng dụng của enzyme trong sản xuất 5.1 Sử dụng aminoacylase cố định để sản xuất axitamin Trong quá trình tổng hợp hoá học hay lên men ( sinh tổng hợp) để sản xuất các axit amin nhưng nhược điểm lớn nhất của phương pháp này cho ra các sản phẩm - -18 raxemic, tức là hổn hợp của 2 dạng đồng phân quang học D và L trong đó chỉ có dạng L mới có hoạt tính sinh học cao ,có ý nghĩa trong khoa học hoá sinh. Nếu sử dụng phương pháp hoá học hay kết hợp với sinh tổng hợp ( lên men 2 pha ) sẽ tốn kém, không khả thi. Từ năm 1969 hãng tanabe Seizaku ( Nhật Bản ) sử dụng enzyme cố định amino acylaza ( AACD: enzyme đồng phân hoá chuyển từ dạng D sang dạng L của axit amin ) để chuyển hoá hổn hợp D,L axit amin. Trong đó enzyme aminoacylase được cố định trên DEAE. Sephadex bằng liên kết ion với thời gian bán huỷ là 65 ngày ở 50oC. 5.2 Sản xuất L-axit aspartic bằng enzyme asperza cố định Là cơ chất trung gian của rất nhiều quá trình chuyển hoá hoá sinh tổng hợp các axit amin khác nhau rất quan trọng trong dinh dưỡng động vật và chế biến thực phẩm (sản xuất axit l-vacin, tổng hợp axit α-xetoglutamic( tiền chất để chuyển hoá thành axit l-glutamic )). Cơ chế hoá sinh của sự tạo thành axut aspartic là quá trình tạo liên kết đồng hoá trị giửa NH3 với axit fumaric bởi enzyme aspartic. Từ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKY đã sử dụng tế bào có chứa enzyme aspartaza (nòi vi khuẩn Brevibacterium flavum nuôi cấy trên môi trường rỉ đường giàu biotin ) và gói nó trong gel polyacrylamit với bán chu kỳ hoạt động là 120 ngày ở 37C. 5.3 Thuỷ phân lactoza bằng enzyme lactaza cố định: Lactoza là disaccarit có trong sữa nên được gọi là đường sữa. Loại đường này có độ ngọt ngào thấp ( bằng 30% với đường saccaroza ở cùng nồng độ),độ hoà tan - -19 kém ( gây nên hiện tượng sạn đường trong sữa), một bộ phận người sử dụng sữa không có khả năng tiêu hoá hấp thụ được sữa này. Mặt khác đường sữa hầu như được thải cùng với sữa nếu thuỷ phân lactoza để tạo thành 2 monosaccarit cấu thành nó là glucoza và galactose sẽ mang lại hiệu quả cao. Lúc này sữa sẽ có chất lượng cao hơn, loại bỏ hiện tượng sạn sữa, nâng cao độ tiêu hoá, các monosaccarit sẽ được vi sinh vật sử dụng khi lên men sữa (các sản phẩm sữa chua và phomat ). 5.4 Sản xuất nhóm penicilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bằng enzyme cố định penicillinamidaza Penicillin là một nhóm chất có tính kháng sinh, cấu tạo chung là: Với R là gốc axyl thì ta có penicillin G- là penicillin thương mại và sinh hoạt phổ biến nhất hiện nay. Enzyme penicillinamidaza xúc tác thuỷ phân benzyl penicillin (penicillin để tạo thành nhóm penicillin 6-APA và axit phenyl axetic. 6-APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để sản xuất các loại kháng sinh họ penicillin. Hiện nay toàn bộ 6-APA của thế giới đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme penicillinamidaza cố định. Đây là enzyme nội bào khi sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Esterichia – coli, bacterium faecalic, alacaligus với moi trường cazein thuỷ phân, cao ngô, glucoza, axit phelnylaxetic làm chất cảm ứng. Phương pháp gói enzyme của hãng SNAM Progetti (Italy) như sau :10 lít dung dịch penicillinamidaza pH=8 trộn với 5kg triaxetic xenlulose trong 71.4 kg clorimetylin ở 4C, lắc kỹ cho đến khi tạo gel cả các sợi. mỗi kg sợi thành phẩm được nhồi trong các cột kích thước 43 x 14 cm. 26 lit penicillin G( muối kali ) cho chảy liên tục qua cột ở pH=8.2 cho đến khi đạt mức chuyền hoá 97% 6 APA Công nghệ của hãng TANABE SEIZAKU : sử dụng bioreactor tế bào cố định chứa penicillinamidaza trong gel polyacriamit như sau : dung dịch penicillin G - -20 0.65M ở pH = 8.5 cho chảy qua cột với tốc độ 0.12-0.14 thể tích cột/h. Hiệu suất phản ứng đạt 80%. II/ Chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp: 1. Lịch sử hình thành: Các penicillin là đại diện tiêu biểu cho các kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc. Ngoài ra còn có một vài kháng sinh khác như griseofulvin, trichotrxin, fumagillin… cũng được sinh ra từ các chủng nấm mốc khác nhau. Penicillin G là chất kháng sinh tiêu biểu được Alexander Flemming tìm ra đầu tiên vào năm 1928 trong quá trình nghiên cứu về tụ cầu khuẩn. Ông nhận thấy trên hộp petri nuôi cấy tụ cầu khuẩn có nhiễm nấm mốc Pinicillin notatum và tạo vòng vô khuẩn. Flemming gọi chất ức chế tạo vòng vô khuẩn này là penicillin. Sau đó, Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên. Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này. Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột. Năm 1942, đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P. Chrysogenum Wis Q - 176 (chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới ); đã thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic).... Năm 1943, penicillin được sản xuất ở qui mô công nghiệp ở Mỹ để phụ vụ các bệnh nhiễm trùng cho thương binh trong chiến tranh trong thế giới thứ II. - -21 Penicillin cũng là chất kháng sinh đầu tiên được sản xuất lên men chìm ở qui mô công nghiệp (1947). Năm 1941, penicillin G là kháng sinh có hiệu quả cao chống lại hầu hết các chủng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên đến đầu năm 1947 phần lớn các vi khuẩn phân lập trong bệnh viện đều kháng lại penicillin. Để giải quyết vấn đề này người ta đã nổ lực tìm ra các penicillin mới có tác dụng đều trị tốt hơn. Công nghệ sản xuất penicillin bán tổng hợp bắt đầu được nghiên cứu. 2. Cấu tạo của penicillin: Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòng thiazolidine, một vòng β -lactam, một nhóm amino gắn với CO2 và một mạch bên ( R). Tất cả các penicillin đều là dẫn suất của acid 6-aminopenicillanic. Sự thay thế R tạo nhiều acid amin khác nhau. Hầu hết các peniciliin đều được phân phối dưới dạng muối natri hoặc muối kali và có ý nghĩa trong điều trị cũng như trong thương mại như penicillin G, penicillin V… Cấu tạo chung của phân tử penicillin 3. Tính chất hóa lý: Tính chất vật lý: Các penicillin dưới dạng muối hoặc dạng acid là những bột trắng không mùi khi tinh khiết. - -22 Phổ UV: đa số các nhóm R acyl hóa trên 6-APA đều là vòng thom7nen6 cho phổ hấp thu ở vùng UV có thể ứng dụng được. Phổ IR: ở vùng 1600 – 1800 cm-1 có các đỉnh đặc trưng các nhóm sau :  Nhóm lactam ở giữa 1760 và 1730 cm-1.  Chức carboxyl ở khoảng giữa 1600 cm-1.  Nhóm chức amid ngoại vòng ở giữa 1700 và 1650 cm-1. Tính chất hóa học: Các penicillin có khả năng tạo muối natri và kali tan trong nước, trong khi đó các muối kim loại nặng ( vi dụ muối Cu2+) thì không tan hoặc kích thích sự phân hủy. Các penicillin cũng có khả năng tạo muối với các amin:  Tạo các penicillin thủy giải chậm ( tác động trễ) như procain penicillin ( tác động kéo dài từ 24 – 48h), benethamin penicillin ( tác động kéo dài thừ 3 – 7 ngày), benzathin penicillin ( tác động kéo dài 2 – 4 tuần).  Một số có tính base ví dụ các aminosid, các alkaloid khi trộn chung với penicillin trong cùng một ống tiêm sẽ gây ra kết tủa.  Các penicillin cũng có khả năng tạo ra các este, sẽ là những tiền chất có khả năng phóng thích các kháng sinh này trong invivo. Tính không bền của vòng beta lactam: Sự phân hủy trong môi trường kiềm: ở pH = 8 sẽ có sự tần công của ion OH- trên carbonyl lactam gây ra sự mở vòng theo qui luật chung, cuối cùng sẽ có sự tạo thành acid penicilloic, nhưng sự decarboxyl có thể xảy ra tiếp theo để tạo acid peniloic. Nếu trong môi trường có sự hiện diện của những muối kim loại nặng ( Zn2+, Cd2+, Pb2+ hoặc Hg2+) sẽ làm cho acid peniciloic bị phân hủy thành carbinolamin không bền, chất này sẽ tiếp tục bị phân hủy tạo D-penicillamin và acid penaldic. Acid penaloic đền lượt nó có thể bị decarboxyl hóa để trở thành penicillo-aldehyd. Sự alcol phân và amino phân: vòng beta lactam nhạy với một số tác nhân ái nhân khác với xúc tác của các ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+. - -23 Sự phân hủy trong môi trường acid: dưới sự hiện diện của ion H+, sự tần công ái điện tử trên nguyện tử S, kích thích sự mở vòng lactam và vòng thiazolidin, tiếp theo là sự tái sắp xếp để tạo thành cấu trúc oxazolic cua acid penicillenic. Cuối cùng, nếu môi trường quá acid có thể tạo thành acid penillic. Ngoài ra vòng lactam có thể bị mở bởi lactamase tiết ra từ vi khuẩn. 4. Các yếu tố ảnh hưởng : Trong quá trình nghiên cứu penicillin G, người ta đã tìm thấy được enzyme penicillin amidase có khả năng thủy phân penicillin G (hay V) thay thế các hóa chất đồng thời thúc đẩy phản ứng xảy ra nhanh hơn trong sản xuất kháng sinh penicillin bán tổng hợp. Do vậy để tăng hiệu quả sản xuất cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme thủy phân 4.1 Động học của enzyme penicillin acylase : Quá trình cố định có thể gây ảnh hưởng lớn đến tính ổn định của enzyme. Nếu quá trình cố định đưa ra bất kì một yếu tố nào làm biến dạng đối với enzyme, nó sẽ thúc đẩy sự bất hoạt của enzyme dưới các điều kiện gây biến tính như nhiệt độ, pH…Sự kết hợp giữa giá thể và enzyme càng tự nhiên thì sự ổn định của enzyme càng lớn, càng bảo vệ tính chất vật lí của enzyme, càng ít bị biến tính. Mức độ ổn định của enzyme được xác định bởi nồng độ gel và số lượng các tương tác cộng hóa trị . Các hằng số động học động học Km, Vmax…bị biến tính bởi quá trình cố định là do thay đổi cấu trúc bên trong và giới hạn vào vị trí hoạt động của enzyme, hay do những thay đổi của phân tử khếch tán trong môi trường. 4.2 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang: Các tính chất hóa học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước hay kỵ nước… đều ảnh hưởng đến lượng enzyme được liên kết , tính bền, dẫn xuất enzyme penicillin, tới khả năng của các chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của penicillin trong dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kỵ nước. - -24 Dung dịch đệm sử dụng trong trong sản xuất enzym penicillin acylase này là sephadex Đó là một loại dẫn xuất của dextran- một loại polysacchride phân tử lớn của một số loài vi sinh vật Leuconostoc sinh trưởng và phát triển trong môi trường có saccharose. Phân tử dextran được cấu tạo từ các chuổi, trong đó các gốc glucose nối với nhau bằng liên kết glycoside 1:6. Trọng lượng phân tử của dextran đạt đến một triệu hoặc cao hơn. Sexphadex được thu nhận tử dextran bằng phương pháp xử lý hoá học để tạo ra các liên kết ngang, làm cho sản phẩm không hoà tan trong nước nhưng có thể trương phồng trong nước. Ngày nay trên thế giới người ta đã sản xuất nhiều loại sephadex với kích thước hạt và độ phân nhánh khác nhau và do đó có khả năng tách chiết khác nhau. Những sản phẩm này được ký hiệu bằng các con số : G-10, G-25,G-50,G-75,G-100,G-200 v.v… Chất mang polyacrylamide: Là polymer rất đồng nhất, độ trương tốt,kích thước của lổ gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Polyacrylate và polyacrylate thường được nạp vào cột, và có rất nhiều dạng khác nhau như polymer có thiol,amine, hoặc aldehyde. Thường thì để tăng khả năng đóng mạch của gel polyacrylamide,cần phải bổ sung thêm N,N-methyllenbisacrylamide làm chất đóng mạch (crosslinking agent). 4.3 Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác:  Tốc độ khuếch tán của cơ chất, cơ chất và các chất hấp phụ khác phụ thuộc vào:  Kích thước lỗ gel của chất mang.  Trọng lượng phân tử của cơ chất. Sự chênh lệch nhiệt độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme penicillin amidase và dung dịch tự do. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động 600C. - -25 Trong đó kích thướt của chất mang và trọng lượng phân tử đóng vai trò quan trọng. Ảnh hưởng pH: Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đến pH tối ưu của enzyme, pH tối ưu của penicillin acylase sau gắn lên chất mang. pH thích hợp cho enzyme 7.5 - 8.0 III/ Quy trình sản xuất: 1. Kỷ thuật sản xuất enzyme penicillin acylase: Acylases Penicillin được tìm thấy trong các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, và nấm, được sử dụng để xúc tác các thủy phân tự nhiên của penicillin.  Penicillin ngoại bào được chiết xuất từ: xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Enzyme này có khả năng thủy phân các penicillin K, F, V nhanh, còn đối với penicillin G lại thủy phân rất chậm ( thấp hơn khoảng 100 lần)  Penicillin nội bào chủ yếu có trong vi khuẩn có tác dụng thủy phân nhanh phân tử penicillin G, cắt đứt dây nối peptid ở mạch bên 6-APA. Enzyme nôi bào và enzyme ngoại bào có pH hoạt động khác nhau: nội bào hoạt động mạnh ở pH=7.3-8.5; còn enzyme ngoại bào hoạt động mạnh ở pH-9.0. Việc sử dụng loại enzyme này là một trong những thành công sớm nhất của các quá trình liên quan đến các enzym cố định và có thể được tái sử dụng trên 100 lần. Các enzyme acylase thủy giải một số amides, được tổng quát bằng công thức dưới đây: R-CO-NHR' R-CO-NHR ' Quá trình thủy phân chủ yếu dựa vào gốc R (acyl) , còn gốc R , không có tác dụng thủy phân. - -26 Quy trình sản xuất: - -27 Pha vỡ tế bào, chiết ra bằng dd đệm, pH =8 Kết tủa amioniumsunfat 70% bảo hòa loại bỏ acia nucleic Lọc qua gel Sephadex G-200 Điện di trên gel polyacylamide + SAS Kiểm tra độ tinh sạch ezyme E.coli NCIM 2350 NCIM 2350 Dịch chiết thô Enzyme thô enzyme tinh sạch Enzyme cố định Giải thích quy trình: Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh enzyme penicillin acylase. Trong công nghiệp hay dùng E.coli được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng có thành phần môi trường dinh dưỡng như sau: Cao ngô: 2% Pepton : 0.5% Glucose: 2% Acid penylacetic 0.15% Nhiệt độ 300 Thời gian 24h Enzyme penicillin acylase được sản xuất từ E.coli NCIM 2350. Trước hết ta phá vỡ tế bào bằng máy nghiền và bổ sung thêm dung dịch đệm phosphate 0.03M ở pH = 8 để chiết rút dịch chiết thô có chứa enzyme. Dịch chiết thu được thường chứa rất nhiều protein các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme rất thấp. Do vậy ta cần bổ sung thêm các tác nhân gây kết tủa. Để tủa enzyme từ dịch chiết thô bằng amonium sulfate 70% vì muối này có độ hòa tan rất cao ( có thể đạt 720g/l, t0=250C) ít làm mất hoạt tính của enzyme, ngoài ra có thể làm bền enzyme.Sau đó đem ly tâm ....hòa tan tủa trở lại bằng dung dịch đệm ở pH=8.Ta thu được enzyme thô. Để tách từng phần và tiến tới tinh sạch hoàn toàn enzyme, người ta dùng phương pháp sắc ký lọc gel. Nguyên tắt của phương pháp này dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thướt khác nhau.Gel sử dụng Sephadex G-200.Các phân tử đi qua hệ thống các hạt gel, nếu có kích thướt nhỏ hơn kích thướt của các lỗ gel có thể chui vào trong hạt gel. Do đó thời gian đi qua cột sẽ lâu hơn các phân tử có kích thuớt lớn hơn. Còn các hạt có kích thướt lớn sẽ đi qua khoảng trống các lỗ gel. Các phân tử có kích thướt lớn sẽ chui ra trước các - -28 phân tử có kích thướt nhỏ sẽ chui ra sau. Nhờ vậy cho phép ta phân chia ra các đại phân tử có kích thướt khác nhau. Sử dụng kỷ thuật điện di gel polyacrylamide (PAGE) biến tính sử dụng gel và đệm có chứa sodium dodecyl sulfate ( SAS). Các phân tử enzyme trong môi trường có chứa SAS sẽ bị duỗi thẳng ra và trở nên tích điện âm, vì vậy sẽ dịch chuyển về cực dương trong điện trường. Tốc độ dịch chuyển phụ thuộc khối lượng phân tử của các enzyme, các enzyme có khối lượng càng nhỏ thì chạy càng nhanh, các emzyme có khối lượng phân tử nhỏ thì chạy chậm hơn. Sau quá trình điện di , gel được nhuộm bằng coomassie. Điện di trên gel polyacylamide có chứa SAS thường tiến hành với các enzyme chuẩn có khối lượng phân tử đã biết , vì thế dễ dàng xác định khối lượng của phân tử của enzyme penicillin acylase. Phương pháp điện di trên chất mang polyacrylamide (PAGE) Gel tạo bởi sự polymer hóa acrylamide hóa acrylamide có một số ưu điểm sau: có độ phân tách tốt đối với các phân tử protein và nucleic acid có MW trung bình (tới 106Da), tách được phân tử có kích thước tương đối lớn. Tương tác giửa phân tử di chuyển và nền gel là nhỏ và nền gel khá bền về mặt tính vật lý. Khác với phương pháp lọc gel, phương pháp điện di vừa có tính chất tách phân tử nhờ độ xốp của chất nền,lại vừa phân tách theo điện năng mà chúng có. Trong phuong2w pháp lọc gel phân tử lớn chạy nhanh hơn phân tử nhỏ,còn trong điện di lại ngược lại. Gel polyacrylamide tạo bởi quá trình polymer hóa acrylamide với chất tạo liên kết ngang N,N-methylene-bí-acrylenide. Quá trình trên được kiểm soát bởi soát bởi hệ xúc tác khởi động,ammonium péulfate-n,n,N’,N-tetramethylene diamine (TEMED), riboflavin xúc tác polymer hóa phụ thuộc UV. Gel để tách protein thường là loại gel 7.5% polyacrylamide,cho phép tách protein có MW từ 10.000-1.000.000 Da, tuy nhiên tốt hơn cả là trong khoảng từ 30.000-300.000Da. Nguyên tắc chủ yếu là nồng độ acrylamide càng thấp gel tạo thành càng xốp,càng cho phép phân tử lớn hơn. - -29 Phương pháp điện di gel polyacrylamide sodium dodecyl sulfate (SAS-PAGE) (SAS-PAGE). Phương pháp SAS-PAGE chủ yếu để xác định MW phân tử protein. Khi điện di phân tử protein trong SAS và mercaptoethanol. Do sự di chuyển của phức SAS-protein lúc này chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của phân tử protein, phân tử lớn di chuyển chậm hơn phân tử nhỏ. Kết quả thực nghiệm cho thấy có tương quan tuyến tính giữa log MW và tốc độ điện di. Kết quả điện di SAS cho thấy sự hiện diện của hai thành phần của dải polipeptid có khối lượng 20000 và 700000. Kết quả: Kết hợp với số liệu về khối lượng phân tử tự nhiên qua sắc kí lọc gel và điện di SDS cho thấy: Trong E.coli acylase penicillin có hai chuỗi monomer (A và B), trong đó bao gồm 209 và 557 axit amin.Hai chuỗi phân tử nà