Tiểu luận Nhân giống vô tính cây Lô hội

iều đặc tính y học, khi phơi khô ta có chất Nha Đam (Aloes) màu nâu đen hay ánh lục - Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành chùm, hoa to đều có màu vàng lục nhạt. - Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt. Nếu rạch một đường giữa lá Lô hội tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá Lô hội quan sát sẽ có một chất gel trong suốt. - Các cấu trúc lá lô hội được tạo thành từ bốn lớp:  Vỏ : lớp bảo vệ bên ngoài;  Sáp: một lớp chất lỏng đắng giúp bảo vệ các nhà máy từ động vật;  Chất nhầy Gel: phần bên trong của chiếc lá đó là buộc lại ra để làm cho Aloe Vera gel.  Aloe Vera (trong gel) gồm 8 thiết yếu Amino axit mà cơ thể con người cần nhưng không thể sản xuất. 2.3 Phân bố địa lý: Ở nước ta, cây Lô hội có thể trồng được ở nhiều nơi, nhưng sinh trưởng và phát triển tốt ở những khu vực có số ngày nắng trong năm cao như khu vực Miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt là Ninh Thuận và Bình Thuận. Khi trồng cây Lô hội không phải đầu tư ban đầu nhiều, kỹ thuật chăm sóc đơn giản và trồng một lần có thể thu hoạch lâu dài. 3. Thành phần hóa học: Trong hơn 50 năm qua, người ta đã xác định thành phần hóa học cùng với các đặc tính y khoa của chúng: Lignin - Saponin - Anthraquinones. - Lignin có tác dụng vận chuyển và thấm sâu vào da - Saponin có tác dụng tẩy trùng và khử trùng. - Các anthraquinones như Aloin có tác dụng là chất tẩy nhẹ, Aloe amodine có tác dụng sát trùng và nhuận tràng, Isobarbaloin tác dụng giảm đau và kháng sinh, Aloe ulcin hạn chế tiết dịch dạ dày. Ngoài ra, trong cây Lô hội còn chứa các hoạt chất: - Các vitamin: A, E (tan trong dầu mỡ), B1, B2, B6, follic acid, B3, C, Niacin (tan trong nước). Năm 1983, Arnold Fox cho biết cây Lô Hội là loại thực vật duy nhất chứa B12. Đây là nguyên chất sinh tạo máu của các loại động vật, thiếu B12 con người dễ bị những chứng bệnh : đau tim, bao tử, nhức đầu, đau xương, đau thần kinh, cúm, mệt mỏi, đau bắp thịt. - Chất khoáng: Calcium, zine, managanese, potassium, magnessium, chromium, sodium, copper, chromium. - Mono và Polysaccharit: Aldonantose, cellulose, glucose, L.Rhamnose, manose. Hình 2.1 Chất gel cây Lô hội - 6 - - Các axit amin thiết yếu: có 8/10 axit amin và có 11//14 axit amin không thiếu yếu: Alanice, arainine, acid aspartic cytine, acid glytamic, glycerine, histidien, hydroxyproline, isolecine, leucine, lysine, prolin méthionine. - Các enzym: Amylaza và Proteaza (tiêu hóa đường và đạm) Creatin Phosphokinaza (enzym thuộc nhóm cơ); Lipaza (hấp thụ chất béo), Bradikinaza (giảm đau, chống viêm, kích thích hệ miễn dịch). 4. Tác dụng: Từ 1700 năm trước Công nguyên, con người đã biết sử dụng cây Lô hội để trị bá bệnh như: da, lành vết thương. Sau đó, người ta đã dần dần phát hiện thêm nhiều tác dụng chữa bệnh khác của cây Lô hội: - 1930 – 1940: trị phỏng, mịn da, tăng cường sức khỏe. - 1960 – 1970: trị loét dạ dày, làm lành các vết thương. - 1981: Hội đồng Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ: Bảo vệ các viện bào chế các sản phẩm Lô hội. - 1986: hành loạt các sản phẩm được tổng hợp từ Lô hội. 4.1 Tác dụng dược lý:  Theo y học cổ truyền: - Lô hội có vị đắng, tính hàn. - Vào 4 kinh: can, tỳ, vị, đại tràng. - Có tác dụng thông đại tiện, mát huyết, hạ nhiệt. - Kinh nghiệm trị cam tích, kinh giản trẻ em, trị táo bón, ăn uống không tiêu, giúp tiêu hóa, đắp ngoài trị phỏng, rôm sảy, lác…  Theo y học hiện đại: a. Làm lành vết thương: Lô hội có chứa nhiều khoáng chất như Calci, Potassium, Kẽm… có chứa nhiều vitamin C và E. Các chất này là tiền chất cơ bản để đẩy nhanh tiến trình làm lành da. Calci giữ vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh và mô cơ, nó cũng là chất xúc tác chính trong tất cả các quá trình chữa lành vết thương. b. Chống viêm nhiễm dị ứng: Lô hội có tác dụng làm lành vết đứt, vết loét, vết phỏng hay vết sưng do côn trùng cắn đốt trên da vì nó có chứa những hợp chất hữu cơ gồm vitamin, các hormon, chất Magnesium lactate… có tác dụng ức chế phản ứng Histamin, ức chế và loại trừ Bradykinin là những thành phần gây phản ứng dị ứng và viêm. c. Chống sự lão hóa tế bào: Lô hộicó chứa Calci có liên quan đến tân dịch trong tế bào cơ thể, duy trì sự cân bằng giữa trong và ngoài tế bào, tạo ra các tế bào khỏe mạnh. - Lô hội có chứa 17 amino – acid cần thiết để tổng hợp protein và mô tế bào. - Lô hội có chứa các chất khoáng như Calci, Phospho, Đồng, Sắt, Magne, Potassium, Sodium… là các yếu tố cần thiết cho sự trao đổi chất và các hoạt động của tế bào d. Giải độc cho cơ thể: Lô hội có chứa Potassium cải thiện và kích thích chức năng gan, thận, hai cơ quan chủ yếu của việc loại trừ chất độc trong cơ thể. - Lô hội có chứa Uronic acid, loại trừ chất độc trong tế bào. - Lô hội có phần chất xơ cuốn sạch các thành phần chất thải nằm kẹt trong các nếp gấp của ruột. - 7 - e. Sinh năng lượng và dinh dưỡng: Lô hội có chứa Vitamin C thúc đầu quá trình trao đổi chất, sinh năng lượng cần thiết, và duy trì hoạt động miễn dịch giúp phòng được nhiều bệnh. - Lô hội có chứa các amino – acid để tạo protein giúp hình thành tế bào và mô. - Lô hội chứa các Enzym cần thiết để phân giải các chất đường, đạm và béo trong dạ dày và ruột. f. Vai trò tá dược: - Lô hội có chứa chất Lignin, là chất giúp thấm sâu và luân chuyển cùng với các yếu tố khác mà nó liên kết, đây là lý do nhiều sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm pha trộn với Lô hội. - Lô hội còn có polysaccharide, các chất khoáng, vitamin, amino acid… cùng với chất Lignintẩy sạch tế bào chết, kích thích tái sinh tế bào mới, và dinh dưỡng cho da. Một số loại bệnh cây Lô hội có thể chữa được : táo bón, mất ngủ, tăng huyết áp, viêm gan, vàng da, ngứa, mề đay, phong thấp, viêm đường tiết niệu, đứt tay chân, chảy máu, mặt mụn, nám, nhặm mắt, đỏ mắt, tiểu đường, phỏng nước sôi, phỏng lửa, khí hư bạch đới, rôm sẩy, mụn nhọt, vảy nến, da mịn, gia tăng sức khỏe, sinh lực. Lô hội chữa được AIDS, ung thư: các nghiên cứu thấy rằng Lô hội có chứa trên 20 loại polypeptids có tác dụng kích thích khả năng miễn dịch, cũng như có ít nhất là 3 chất chống khối u. Như vậy Lô hội sẽ góp phần chống các bệnh về siêu vi (trong đó gồm cả HIV) cũng như ung thư. Tuy vậy quá trình nghiên cứu vẫn đang tiếp tục, nên chưa thể khẳng định Lô hội sẽ thay thế được các thuốc đặc trị, mà chỉ nên dùng như một liệu pháp dinh dưỡng bổ sung 4.2 Các ứng dụng điều trị lâm sàng: - Trị táo bón: bột Lô hội, cao mật bò, bột cam thảo và tá dược; hay dùng: Lô hội tươi 100g, đậu xanh cả vỏ 20g, đường cát 50g nấu ăn. - Trị đau lưng: Lô hội tươi 50g, đậu đen 50g, đường cát 100g nấu ăn. - Trị mụn nhọt - Abces: giã nhuyễn cả lá lẫn vỏ đắp lên vùng sưng đỏ. - Trị rôm sảy mụn: lấy nước cốt Lô hội tươi thoa lên vùng da bệnh 4.3 Lô hội chăm sóc sắc đẹp: - Lô hội là một trong những thành phần quan trọng của mỹ phẩm, làm sạch da nhưng vẫn giữ cho da mịn màng và mềm mại. Chất Ligmin thấm sâu tới hạ bì, tẩy sạch vi khuẩn, bụi bặm sau đó các chất dinh dưỡng tự nhiên trong lô hội lại nuôi dưỡng da kích thích tái sinh tế bào mới. - Lô hội được sử dụng làm kem, giữ ẩm cho da, kem dưỡng da, kem chống nắng... 5. Kĩ thuật thu hoạch và chế biến: Lô hội muốn có dược tính cao yêu cầu phải có qui trình trồng trọt và thu hái hợp lý. Các lá đầu tiên thu hái là các lá tốt nhất được ưu tiên dùng trong mỹ phẩm. Sau khi rửa sạch lá bằng hơi nước, người ta lấy phần thịt bên trong lá, loại bỏ celluloza rồi xác định thành phần và hoạt tính sinh học để chế tạo gel. - 8 - Hình 2.2 Các sản phẩm từ cây Lô hội III. Các phương pháp nhân giống vô tính cây Lô hội: 1. Nhân giống vô tính cây Lô hội bằng kỹ thuật giâm cành, giâm hom: 1.1 Cơ sở khoa học:  Cơ sở khoa học: Khi có tác động cắt cành thì auxin sẽ được hình thành một cách nhanh chóng tại đỉnh sinh trưởng và các cơ quan non, sau đó qua hệ thống mạch libe, auxin được vận chuyển về phần vết cắt cành chiết, cành giâm để kích thích tạo rễ bất định. Người ta chia sự hình thành rễ bất định làm ba giai đoạn : - Giai đoạn phản phân hoá của tế bào tượng tầng trở lại chức năng phân chia của mô phân sinh tạo khối tế bào bất định (callus). Lượng auxin lớn để phản phân hoá tế bào (10-4 - 10-5 g/cm3) - Giai đoạn tái phân hoá : các tế bào bất định tái phân hoá hình thành mầm rễ bất định cần lượng auxin thấp hơn (10-7 g/cm3). - Giai đoạn sinh trưởng của mầm rễ để hình thành rễ bất định. Lượng auxin cần rất thấp (10-11 - 10-12 g/cm3) hoặc không cần. Thường sử dụng các chất thuộc nhóm auxin ngoại sinh để kích thích sự tạo rễ bất định nhanh và hiệu quả trong kỹ thuật giâm chiết cành: IBA, α-NAA, 2,4D... - 9 -  Ưu điểm: - Cây con giữ nguyên tính trạng của cây mẹ, cây đồng đều thuận tiện cho quá trình chăm sóc, thu hoạch. - Thời gian nhân giống tương đối nhanh, hệ số nhân giống cao. - Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao. 1.2 Vật liệu: - Đoạn thân của cây Lô hội trưởng thành (1năm tuổi) trồng trong vườn ươm từ cây giống in vitro. - Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm trong vườn. 1.3 Phương pháp nuôi cấy:  Phương pháp giâm hom thân: - Rửa sạch đoạn thân, cắt thành từng đoạn 2,0 - 2,5 cm sao cho các hom đều có mắt ngủ. - Hom được xử lý chống nấm thối bằng dung dịch Benlate 0,15% trong 10 phút. Sau đó được xử lý kích thích ra rễ bằng IBA rồi tiến hành giâm vào cát mịn đã được xử lý bằng thuốc chống nấm Benlate trước đó khoảng 5 ngày.  Phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng: - Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm tại vườn, dùng kéo hoặc dao sắc huỷ bỏ đỉnh sinh trưởng.  Phương pháp sử dụng chế phẩm dinh dưỡng: - Dùng chế phẩm dinh dưỡng 10% MS + 5ppm BAP, phun 10 ngày/lần lên cây Lô hội trưởng thành trong vườn ươm. 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng:  Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát sinh chồi nách tạo vật liệu giâm hom thân cây Lô hội. - Huỷ đỉnh sinh trưởng làm phát sinh chồi nách có thể xem là một trong những phương pháp nhân giống vô tính cổ truyền được áp dụng để nhân giống dinh dưỡng nhiều loại cây. - Bản chất của phương pháp là áp dụng kỹ thuật huỷ đỉnh sinh trưởng cưỡng bức, gây ức chế nội tại, kích thích các chồi ngủ tiềm ẩn ở nách lá, đầu rễ, phân hoá thành chồi mới. - Khảo sát thời gian hủy đỉnh sinh trưởng vào tháng 3,6,9,12. Bảng 1: Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát sinh chồi nách cây Lô hội Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ cây nảy chồi (%) Hệ số nhân (lần) Trạng thái chồi HĐST T3 100 5.2 T bình HĐST T6 100 5.0 Tốt HĐST T9 100 5.1 T bình HĐST T12 100 5.2 Tốt  Chú thích:  Kém : Chồi gầy, lá xanh nhạt  Trung bình : chồi mập, lá xanh nhạt  Tốt : chồi mập, lá xanh đậm - 10 - → Có thể áp dụng phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật huỷ đỉnh sinh trưởng để tăng hệ số nhân nhanh giống cây Lô hội.Thời vụ không ảnh hưởng nhiều đến hệ số nhân chồi cũng như chất lượng chồi qua các mùa vụ. Hình 3.1 : Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến hệ số nhân chồi cây Lô hội  Ảnh hưởng của việc xử lý IBA đến khả năng ra rễ và nảy mầm đoạn hom thân cây Lô hội : IBA là loại auxin có vai trò sinh lý kích thích sự ra rễ bất định của cây, đặc biệt đối với những loại cây khó ra rễ như cây Lô hội. Bảng 2: Ảnh hưởng của việc xử lý IBA đến khả năng ra rễ và nảy mầm đoạn hom thân cây Lô hội Ra rễ Hom nảy mầm Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Xứ lý nước lã 7 7.8 0 0 IBA dạng bột 32 35.5 8 8.8 IBA 10ppm 20 22.2 3 3.3 IBA 50ppm 26 28.9 5 5.6 IBA 100ppm 28 31.1 4 4.4 Sử dụng IBA dạng bột và dạng dung dịch với các nồng độ đậm đặc đều cho hiệu quả thấp đối với giâm hom thân cây Lô hội. So sánh tỷ lệ hom sống giữa không sử dụng IBA (7,8%) và có sử dụng IBA thì tỷ lệ hom sống khi có sử dụng IBA là cao hơn dao động từ 22,2% đến 35,5% ở các nồng độ 10 ppm IBA, 50 ppm IBA,100 ppm IBA,IBA dạng bột. Tuy nhiên hầu hết các nồng độ IBA đều cho tỷ lệ hom sống thấp, tỷ lệ hom sống cao nhất mới chỉ đạt (35,5%) khi sử dụng IBA dạng bột. Tỷ lệ hom nảy mầm là rất thấp, cao nhất mới chỉ đạt (8,8%) ở trường hợp sử dụng IBA dạng bột, thấp nhất là khi không sử dụng IBA, tỷ lệ hom nảy mầm là (0%). - 11 - Như vậy, nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp giâm hom thân cho hiệu quả thấp, vì vậy chỉ nên áp dụng nghiên cứu thực nghiệm không nên xây dựng quy trình sản xuất thực tiễn.  Ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng phát sinh chồi nách cây Lô hội: Việc nhân giống cây Lô hội hoàn toàn thụ động dựa vào việc tách chồi nách. Hạn chế của phương pháp nhân giống này là thụ động, phụ thuộc vào yếu tố tự nhiên, hệ số nhân thấp, chất lượng giống cây không đồng đều. Xử lý kích thích chồi nách cây Lô hội bằng cách phun chế phẩm dinh dưưỡng bao gồm 10%MS + 5ppm BAP giúp nâng cao hiệu quả nhân giống và giải quyết các hạn chế trên. Bảng 3: Ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng phát sinh chồi nách cây Lô hội Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ bật chồi nách (%) Số chồi / cây (chồi) So vối đối chứng (%) Không xử lý 50.5 1.6 100 Xử lý 10% MS + 5mg/l BAP 100 4.9 306.2 Khi không phun chế phẩm chất dinh dưỡng thì tỷ lệ cây bật chồi nách không đồng đều đạt (50,5%), số chồi trên cây mẹ chỉ đạt (1,6 chồi/cây). Khi có xử lý phun chế phẩm dinh dưỡng thì 100% số cây thí nghiệm đều nảy chồi nách, với số chồi bình quân (4,9 chồi/cây). Vậy, việc áp dụng phun chế phẩm dinh dưỡng xử lý kích thích nảy chồi nách cho tỷ lệ cây nảy chồi và hệ số nhân chồi lớn, đây là biện pháp khoa học và có hiệu quả. 2. Nhân giống vô tính cây Lô hội bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro: 2.1 Cơ sở khoa học: - Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. - Cơ sở lý luận: Dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào: mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Haberlandt (1902)). - Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào. - 12 - - Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. 2.2 Vật liệu: - Chồi đỉnh của cây Lô hội dòng Aloe vera Linne. Sinensis. Berger (Lô hội lá nhỏ) Đây là cây Lô hội được chọn lọc trong điều kiện tự nhiên, cây khỏe mạnh, không có triệu chứng nhiễm virus. - Các chất điều tiết sinh trưởng: thuộc hai nhóm auxin (-NAA, IBA) và xytokinin (BAP, kinetin), với các nồng độ BAP và kinetin từ 0,5 ppm đến 3,0 ppm, - IAA có nồng độ từ 0,2 ppm đến 1,0 ppm. Ngoài ra, còn sử dụng than hoạt tính. 2.3 Phương pháp nuôi cấy:  Điều kiện nuôi cấy: - Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi có chế độ chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối với cường độ ánh sáng 2.500 – 3.000 Lux. - Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 20C. - Độ ẩm không khí: 50 – 60%.  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: - Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige & Skoog, 1968) với 30g/l đường saccaroza và 6,5 g/l agar. - Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và than hoạt tính. - Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là : 5,8 – 6,0. - Thể tích dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi cấy là 20 - 35 ml/bình - Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm trong 20 phút.  Phương pháp khử trùng mẫu cấy: - Mẫu được cắt bằng dao hoặc kéo sắc rồi được đem vào rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới vòi nước chảy và tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất. - Khử trùng sơ bộ bằng cồn 75%. Tiếp đó đem mẫu vào tủ cấy để tiến hành các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% theo 2 phương pháp là khử trùng đơn hoặc khử trùng kép. - Khử trùng kép : Lần 1 khử trùng bằng HgCl2 0,1% sau đó tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng, khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1%. - 13 - - Thời gian khử trùng: 7 phút. - Cấy vào môi trường dinh dưỡng. Hình 3.2 Cây Lô hội sạch bệnh Hình 3.3 Cây Lô hội bị nhiễm  Phương pháp nhân nhanh chồi: - Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2-3cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm xytoki nin và auxin. Hình 3.4 Cây Lô hội giai đoạn nhân nhanh  Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh: - Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4-5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và than hoạt tính. Hình 3.5 Cây lô hội hoàn chỉnh - 14 - 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng: 2.4.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu invitro:  Ảnh hưởng của phương thức và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Lô hội: - Để loại bỏ các vi sinh vật, trong kỹ thuật khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường, có thể dùng nhiều loại chất khử trùng khác nhau như NaOCl, Ca(OCl)2, H2O2, HgCl2 ... - 0,1% HgCl2 được sử dụng là chất khử trùng rất có hiệu quả cho nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Tuy nhiên, mỗi loại đối tượng cây trồng cần nghiên cứu về chế độ khử trùng thích hợp. - Tiến hành so sánh hai phương thức khử trùng (đơn, kép) với thời gian khử trùng khác nhau trên mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh của cây Lô hội. Bảng 4: Ảnh hưởng của phương thức và thời lượng khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy Lô hội (10 ngày sau cấy) Thời gian khử trùng và phương thức khử trùng (đơn và kép) có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ mẫu sống và bật chồi. - Đối với phương pháp khử trùng đơn: tiến hành khử trùng mẫu ở các thời gian khác nhau 3 phút, 5 phút, 7 phút kết quả cho thấy: + Khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu sống có khả năng bật chồi tăng. Cụ thể là tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm từ (90,2%) ở công thức 1 xuống còn (25,8%) ở công thức 3 khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút. + Trong các công thức khử trùng với thời gian 3 phút và 5 phút chưa thấy xuất hiện mẫu chết nhưng khi tăng đến 7 phút thì tỷ lệ mẫu chết là (5,7%) ở công thức 3 . + Tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng từ (9,8%) ở công thức 1 đến (68,5%) ở công thức 3 khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút. - 15 - Hình 3.6: Ảnh hưởng của phương thức và thời lượng khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy - Đối với phương pháp khử trùng kép: vẫn sử dụng tổng thời gian khử trùng là 3 phút, 5 phút, 7 phút nhưng tiến hành khử trùng làm 2 lần. Lần đầu khử trùng trong thời gian 2 phút, 3 phút, 4 phút sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng rồi khử trùng tiếp lần thứ 2 trong thời gian 1 phút, 2 phút, 3 phút. + Hiệu quả khử trùng vẫn theo quy luật như khử trùng đơn, tức là tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu sống bật chồi tăng dần theo chiều tăng của tổng lượng thời gian khử trùng từ 3 phút, 5 phút đến 7 phút. Tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm (92,5%) xuống còn (10%), tỷ lệ mẫu chết tăng từ (0%) lên (23,2%), tỷ lệ mẫu sống bật chồi tăng từ (7,5%) đến (66,8%). - So sánh hai phương thức khử trùng đơn và kép thì phương thức khử trùng đơn cho kết quả khử trùng cao hơn không đáng kể so với phương thức khử trùng kép. Ở phương thức khử trùng đơn tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng từ (9,8%) đến (68,5%), còn ở phương thức khử trùng kép có tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng từ (7,5%) đến (66,8%) khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút, 5 phút đến 7 phút. - 16 - - Như vậy từ kết quả trên, lựa chọn chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp nhất là khử trùng đơn bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút, kết quả khử trùng cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt (68,5%).  Ảnh hưởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy: - Các thời vụ trong năm khác nhau thì trạng thái sinh trưởng phát triển của cây trồng cũng khác nhau và điều này sẽ ảnh hưởng đến khả năng phát sinh chồi của mẫu cấy. Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi mẫu cấy Lô hội 2.4.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi: - Trong quy trình nhân giống in vitro, giai đoạn nhân nhanh quyết định hiệu quả của quá trình nhân giống vô tính. Để có được hệ số nhân giống cao, đồng nhất, cây có trạng thái sinh trưởng tốt thì việc xác định môi trường nhân nhanh thích hợp là quan trọng. - Chất điều tiết sinh trưởng xytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự tái sinh mẫu cấy theo hướng tạo chồi làm tăng hệ số nhân. Đặc biệt, việc phối hợp các chất điều tiết sinh trưởng một cách hợp lý lại tỏ ra hiệu quả hơn so với khi sử dụng riêng rẽ. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) cho thấy các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh còn phối hợp các chất điều tiết sinh trưởng nội sinh trong việc phân hóa và biệt hoá các tế bào. - 17 -  Ảnh hưởng của BAP (Benzyl Adenin Purin) và Kinetin (Ki) đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội in vitro. - BAP là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào.Trong nhân giống in vitro, BAP có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân và chất lượng chồi hình thành. - Kinetin là một dẫn xuất của Bazơ nitơ adenin có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, duy trì sự sống của mô, định hướng tế bào trong con đường phân hóa và tăng cường tổng hợp chất diệp lục ở lá cây. Bảng 5: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin (Ki) đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội (sau 3 tuần nuôi cấy)  Chú thích:  Kém : Chồi gầy, lá xanh nhạt  Trung bình : chồi mập, lá xanh nhạt  Tốt : chồi mập, lá xanh đậm - 18 - Hình 3.8: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến hệ số nhân chồi Hình 3.9: Ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến hệ số nhân chồi - Các công thức bổ sung nhóm chất xytokinin (BAP, Ki) đều cho tỷ lệ phát sinh chồi đạt 100% so với công thức đối chứng chỉ đạt 25% ở cả hai chất BAP và Ki. Đối với BAP thì hệ số nhân tăng lên cùng với chiều tăng của nồng độ từ 0,5 đến 2,5 ppm (hệ số nhân đạt cao nhất 3,7 lần), khả năng sinh trưởng phát triển của chồi cũng tăng lên cùng chiều tăng nồng độ đến 2,5 ppm, chiều cao chồi dao động 2,7 cm đến 3,8 cm với 2,3 - 5,3 lá/chồi và trạng thái chồi cũng đạt loại tốt. Nếu tăng tiếp nồng độ đến 3,0 ppm BAP thì các chỉ tiêu theo dõi đều có xu hướng giảm xuống. - 19 - - Trong khi đó đối với kinetin thì hệ số nhân tăng lên đến nồng độ 1,5 ppm (2,9 lần), sau đó giảm xuống khi nồng độ tăng tiếp đến 3,0 ppm (2,1 lần). Khả năng sinh trưởng phát triển của chồi cũng theo quy luật tăng lên đến nồng độ 1,5 ppm với chiều cao 2,9 cm và 2,9 lá/chồi, sau đó giảm xuống 2,1 cm với 2,2 lá/chồi. Đối với trạng thái chồi thì tất cả các công thức bổ sung kinetin đều có trạng thái chồi ở mức kém đến trung bình. - Như vậy, môi trường có bổ sung 2,5 ppm BAP là thích hợp nhất đối với chồi Lô hội, cho hệ số nhân cao và chất lượng chồi tốt, còn bổ sung kinetin là hoàn toàn không phù hợp.  Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và β–IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội in vitro: Bảng 6: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và β - IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội in vitro (sau 3 tuần nuôi cấy)  Chú thích:  Kém : Chồi gầy, lá xanh nhạt  Trung bình : chồi mập, lá xanh nhạt  Tốt : chồi mập, lá xanh đậm  Giá trị trung bình trong mỗi cột có mang chữ khác nhau là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Hình 3.10: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và β-IAA đến hệ số nhân chồi Lô hội in vitro - 20 - - Tổ hợp giữa 2,5 ppm BAP với 0,2 - 1,0 ppm β - IAA không có sự sai khác có ý nghĩa ở các công thức trong tất cả các chỉ tiêu theo dõi. Thậm chí công thức bổ sung BAP với 0,2 và 0,4 ppm β - IAA còn làm cho hệ số nhân giảm chút ít so với đối chứng. Chỉ tiêu về chiều cao cây thì giảm đáng kể so với công thức đối chứng (công thức thí nghiệm chiều cao cây dao động từ 3,0 cm - 3,5 cm, công thức đối chứng là 3,8 cm). Trạng thái cây đạt mức từ trung bình đến tốt Như vậy, đối với chồi lô hội việc bổ sung hỗn hợp BAP với β - IAA không có tác dụng làm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi in vitro. 2.4.3 Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh:  Ảnh hưởng của α - NAA và IBA tới khả năng ra rễ cây Lô hội in vitro: - α - NAA và IBA đều thuộc nhóm auxin ngoại sinh có khả năng kích thích sự ra rễ bất định nên thường được sử dụng trong lĩnh vực nhân giống vô tính cây trồng bằng giâm cành, chiết cành và ra rễ in vitro (vi giâm cành). Bảng 7: Ảnh hưởng của α -NAA và IBA tới khả năng ra rễ cây Lô hội in vitro (sau 2 tuần nuôi cấy) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Nồng độ ppm 5,2 32,7 48,6 79,1 66,7 Tỷ lệ chồi ra rễ % Hình 3.11: Ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA tới tỷ lệ chồi ra rễ - 21 - 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Nồng độ ppm 5,1 30,4 51,2 89,1 66,7 Tỷ lệ chồi ra rễ % Hình 3.12: Ảnh hưởng của hàm lượng IBA tới tỷ lệ chồi ra rễ - Các công thức bổ sung α-NAA và IB