Tiểu luận PCR (Polymerase chain reaction)

h tự mồi là một tham số có ý nghĩa vô cùng quan trọng đảm bảo sự thành công của quá trình khuếch đại. Nhiệt độ nóng chảy của một acide nucleic mạch kép tăng lên theo chiều dài của nó cũng như là số lượng (G+C). Công thức đơn giản để tính nhiệt độ nóng chảy (temperature melting-Tm) của một đoạn DNA kép là: Tm (oC) = 4(G + C) + 2(A + T) Do đó, nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature-Ta) cho một phản ứng PCR nhất định phụ thuộc trực tiếp vào thành phần và chiều dài mồi. Nhiệt độ Ta nên chọn thấp hơn khoảng 5oC so với nhiệt độ Tm thấp nhất của cặp mồi được sử dụng (Innis và GelfDNA, 1990). Rychlik và nhiều người khác (1990) đã chỉ ra cách xử sự của Ta. Họ cho rằng nếu tăng nhiệt độ Ta lên 1oC sau mỗi chu trình thì tính đặc hiệu của quá trình khuếch đại và số lượng sản phẩm (1kb chiều dài) đều tăng lên. Một hệ quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá thấp là một hay cả hai đoạn mồi lại gắn vào các trình tự khác chứ không phải trình tự đích, do các bắt cặp sai một bazơ hay sự gắn mồi một phần. Điều này không gây ảnh hưởng gì nếu ta chỉ khuếch đại các trình tự đích thân thuộc hoặc tương tự nhau. Tuy nhiên, điều này có thể dẫn đến việc khuếch đại “không đặc hiệu” và hậu quả là số lượng các sản phẩm mong muốn bị giảm xuống. Một hậu quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá cao là rất ít sản phẩm được tạo ra do khả năng gắn mồi bị giảm xuống. Một điều quan trọng khác cần cân nhắc là một cặp mồi với nhiệt độ Ta không thích hợp sẽ không bao giờ cho sản phẩm duy nhất với số lượng đáng kể, và còn có thể dẫn đến sự khuếch đại không đối xứng có nghĩa là sự khuếch đại sợi được gắn mồi hiệu quả hơn. Sự gắn mồi không thể diễn ra trong thời gian dài: hầu hết các mồi chỉ gắn hiệu quả được trong 30 giây hay ít hơn, trừ trường hợp nhiệt độ Ta rất gần nhiệt độ Tm hoặc các mồi dài bất thường. Hình trên minh hoạ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi dến tính đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại của papillomavirus người type 16 (Human papillomavirus type 16, HPV-16) (Williamson và Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171). Plasmide và khuôn DNA mẫu được khuếch đại ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau như đã chỉ ra ở trên. Chú ý rằng trong khi plasmide được khuếch đại trong khoảng từ 37oC đến 55o C thì HPA, ADN chỉ được khuếch đại đặc hiệu ở 50oC. 6.4 Thời gian và nhiệt độ kéo dài mạch: Thông thường người ta tiến hành ở 70oC - 72oC trong 0,5 đến 3 phút. Trong khi đó, Taq hoạt động thực sự đặc hiệu ở 37oC, nhiệt độ rất gần với nhiệt độ hoạt động của đoạn Klenow của E.coli DNA polymerase I. Đây quả là một nghịch lý, làm thế nào mà các đoạn mồi chỉ gắn vào mạch khuôn ở nhiệt độ tối ưu của nó lại có thể được kéo dài ở nhiệt độ cao một cách đáng kể như vậy. Câu trả lời là sự kéo dài mạch xảy ra ngay từ khi bắt đầu có sự gắn mồi, thậm chí nếu điều này chỉ xảy ra trong thời gian rất ngắn ngủi, thì nó cũng dẫn đến sự ổn định đáng kể. Hoạt động này xảy ra tối ưu ở khoảng 70oC và sự mở rộng mồi diễn ra với tốc độ tối đa là 100 bazơ/giây. Thời gian khoảng một phút là đủ để sự khuếch đại trình tự 2kb là đáng tin cậy (Innis và GelfDNA, 1990). Các sản phẩm dài hơn thì cần thời gian lâu hơn: 3 phút cho sản phẩm 3kb hay dài hơn. Việc kéo dài thời gian là cần thiết trong những chu trình cuối khi mà nồng độ sản phẩm vượt quá nồng độ enzyme (>1nM), và khi dNTP và/hoặc sự suy giảm số lượng mồi có thể trở nên hạn chế. 6.6 Số chu trình. Số lượng chu trình cần thiết để tạo ra băng nhìn thấy được trên gel phụ thuộc phần lớn vào nồng độ ADN đích ban đầu: Innis và GelfDNA (1990) đề xuất khuếch đại 40 - 45 chu trình đối với 50 phân tử đích, và 25-30 chu trình cho 3x105 phân tử cùng nồng độ. Sự không tương xứng này do cái gọi là hiệu ứng bằng (plateau effect) gây nên. Đây là sự giảm tốc độ tăng của sự tích luỹ sản phẩm theo cấp số mũ ở những giai đoạn cuối của PCR, khi mà nồng độ sản phẩm đạt đến 0,3 - 1,0 nM. Có thể sự phân rã của các chất phản ứng (dNTPs, enzyme), sự depletion của chất phản ứng (mồi, dNTPs - cái đầu là trục trặc đối với các sản phẩm ngắn, cái sau là trục trặc đối với các sản phẩm dài), sự ức chế đầu sản phẩm (end-product) (sự hình thành Pyrophosphate), sự cạnh tranh của các sản phẩm không đặc hiệu với chất tham gia phản ứng, sự cạnh tranh của việc tái gắn mồi của các sản phẩm nồng độ cao (10nM) với việc gắn mồi (Innis và GelfDNA, 1990). Nếu sản phẩm mong muốn không được tạo ra sau 30 chu trình, tốt hơn là lấy một mẫu nhỏ (1ml) của hỗn hợp đã khuếch đại làm hỗn hợp phản ứng mới, đem khuếch đại 20-30 lần chứ không nên tiếp tục chạy thêm nhiều chu trình. Trong một số trường hợp khi mà nồng độ khuôn hạn chế, điều này có thể tạo ra sản phẩm tốt trong khi việc tiếp tục chu trình đến 40 lần hay hơn không làm được. Một biến số quyết định số lượng chu trình là PCR mồi làm tổ. Sự khuếch đại PCR được thực hiện với một tập hợp các mồi, sau đó sản phẩm nào đó được lấy ra - có hay không có sự bỏ thuốc thử- để khuếch đại lại, vói tập hợp các mồi nằm bên trong, hay còn gọi là mồi làm tổ. Quá trình này làm tăng mức độ của tính đặc hiệu, có nghĩa là tất cả các sản phẩm không đặc hiệu được khuếch đại trong lần chạy đầu tiên sẽ không được khuếch đại trong lần chạy thứ hai. Điều này được minh hoạ như sau:  Thời gian cho một chu kỳ khởi đầu mục đích bung liên kết của chuỗi xoắn kép ADN là không vượt quá 5 phút. Đối với 25-40 chu kỳ tiếp theo, thời gian cho giai đoạn 1 (bung liên kết ) là 10 giây – 2 phút; thời gian cho giai đoạn 2 (mồi bám) không quá nhanh hoặc quá lâu, thông thường dưới 1 phút; thời gian cho giai đoạn 3 (tổng hợp) tuỳ thuộc vào độ dài vùng ADN cần nhân lên, nhưng nói chung theo qui luật, 1 phút cho 1 kb (1000 nucleotide). Ví dụ cần có sản phẩm là 3 kb, thời gian thích hợp là 3 phút. Thời gian dài hơn không ảnh hưởng lớn đến ADN có độ dài ngắn hơn. Trong thực tế, phản ứng được thực hiện trong 25-40 chu kỳ, và không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diến tiến qua hai giai đoạn: trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: - Sự phân huỷ xảy ra và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Có sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với các cặp mồi mà bắt cặp với nhau. Phản ứng PCR ít khi được thực hiện dưới 25 chu kỳ, vì như thế số lượng nhân bản sẽ ít và lượng ADN thu được trong sản phẩm PCR thấp. Số chu kỳ cho một phản ứng phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ, nếu số lượng bản mẫu là 105 thì cần 25-30 chu kỳ, nếu số lượng bản mẫu là 102-103 thì số chu kỳ phải là 35-40. 7. Yếu tố chu trình nhiệt Một yếu tố quan trọng đảm bảo sự thành công của phản ứng PCR là nhiệt độ của chu trình nhiệt ở giai đoạn thứ 2 khi mồi bám vào khuôn (giai đoạn mồi bám). Một kinh nghiệm có tính qui luật là nhiệt độ cho mồi bám phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi là ít nhất 4o C. 8. Nước Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kỳ ion nào, không chứa enzyme phân huỷ ADN (ADNaza), phân huỷ ARN (ARnaza), enzyme giới hạn cắt Adn (endonucleaza) và bất kỳ các thành phần nào khác. Ion khác lạ sẽ ảnh hưởng nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzyme sẽ pha huỷ hay cắt bỏ ADN làm khuôn hoặc sản phẩm PCR. 9. Thiết bị và dụng cụ Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành phản ứng PCR ngay ở trên mô tế bào,… Tuy nhiên mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị. Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phan ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cúng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuếch đại. VIII . Các hạn chế của phản ứng PCR Do độ nhạy rất cao của PCR dồng thời với thao tác rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên phương pháp có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có 3 vấn đề lớn khi sử dụng kỹ thuật PCR: 1. Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. 2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiệm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dụng cụ… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khấc phục các vấn đề này bằng một số biện pháp sau; - Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác. đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Tất cả mọi thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với 1 , 2 lần thao tác. - Ngoài ra các hãng sản xuất còn tung ra thị trường những hệ thống cho phép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm, ví dụ hãng Perkin - Elmer- Cetus đề xuất việc sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hưởng đến phản ứng. Trước mỗi lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracylglycolase; enzyme này sẽ phân huỷ tất cả các ADN có mang dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời, enzyme sẽ bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. Bất lợi của các hệ thống này là giá thành cao. 3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase. Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ khá cao (104 nghĩa là cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của ADN. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt, ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức. * Độ tin cậy của kỹ thuật PCR/RT- PCR Cũng như tất cả các quá trình sinh học khác, tái bản ADN là một quá trình không hoàn hảo, đôi khi enzyme ADN polymerase cũng nhân nhầm một nucleotide không bổ sung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên là 1/106 . Trong tế bào sinh vật, những bazơ không bổ sung này được một hệ thống sửa sai ngay, nhưng trong thí ngiệm (invitro), Taq-polymerase không có khả năng sửa chữa những bazơ nhân nhầm này. Do vậy cứ tổng hợp 2x104 nucleotide bằng PCR có thể có một nucleotide không chính xác. Tuy nhiên sai sót này không trầm trọng lắm vì trong ống nghiệm cùng một lúc có tập hợp nhiều phản ứng, cùng nhân một đoạn ADN giống nhau nên số ADN có một nucleotide sai sót là không lớn, và sẽ được điều chỉnh chính xác sau khi so sánh các chuỗi khác nhau của cùng đoạn gen. Tuy vậy nếu dùng ADN này làm vật liệu ban đầu đẻ nhân tiếp vectơ trong vi khuẩn E.coli cung có thể gây nguy hiểm sai khác với vật liệu ban đầu. Vì mỗi dòng vô tính plamsmide chứa một đoạn ADN được nhân qua PCR, nếu đoạn ADN đó chứa một vài nucleotide nhầm thì tất cả các mẫu khác từ dòng này đều có chung một đột biến ttương tự. Để khắc phục cần một lượng lớn ADN nguyên bản và giảm số chu kỳ nhân xuống để chỉ thu được ít số phân tử cần nhân lên, và dĩ nhiên sau khi có chuỗi qua giải trình tự, nhất thiết cần so sánh kiểm tra bằng nhiều phương pháp khác nhau. IX. Các lĩnh vực ứng dụng của phản ứng PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp từ khi được Kary Mullis đề xuất và hoàn thiện, đã có những ứng dụng hết sức rộng rãi bao trùm nhiều lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu và trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội. 1. Trong nghiên cứu khoa học: Kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotide của các đoạn ADN được nhân; có thể sử dụng PCR để tác dòng những đoạn ADN đặc hiệu, mặc dù trong nhiều trường hợp không cần đến PCR; nó giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ; giúp nghiên cứu quá trình tiến hoá ở mức phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. 2. Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng đặc biệt đối với động vật và thực vật bậc cao, vốn trước đây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống là rất khó khăn, cần nhiều năm nay kỹ thuật PCR cho phép thực hiện chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ. 3. Trong Y học PCR có thể giúp chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, các bệnh do virus, do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư. Trong tư vấn di truyền Y học, PCR cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đoán trước sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể từ khi thai mới được 8 tuần tuổi và điều quan trọng là không cần chọc ối, chỉ cần lấy một giọt máu ngoại vi của người mẹ để làm mẫu thí nghiệm. 4. Trong khoa học hình sự, kỹ thuật PCR giúp cho chẩn đoán nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ một vết máu khô, một sợi tóc hoặc một sinh phẩm nào đó như tinh trùng… mà thủ phạm đã để lại trên hiện trường. Ngoài ra kỹ thuật PCR giúp cho điều tra quan hệ huyết thống cha con, ông cháu trong những vụ tranh chấp con cái, những trường hợp đi tìm người thừa kế rất hay được dùng trong giám định Y pháp. Hiện nay việc nghiên cứu và sử dụng các locus có số đoạn lặp khác nhau (VNTRs) dùng trong công tác khoa học hình sự, y học chẩn đoán bệnh và để xác định các quan hệ huyết thống đang được ứng dụng hết sức rộng rãi. Phương pháp sử dụng PCR để nhân bản các locut này đã làm giảm đáng kể thời gian tiến hành thí nghiệm và nâng cao được độ chính xác của kết quả so với các phương pháp nghiên cứu truyền thống như: căn cứ vào hình dáng bên ngoài, các nhóm máu hay các hệ isozym... Ví dụ: Phản ứng PCR Dựa trên nguyên lý của Kary Mullis với các cặp mồi đặc hiệu cho locut D1S80 xác định các quan hệ huyết thốngMẹ Con Bố Marker Có quan hệ huyết thống 517 506 396 334 298 1018 529 497 481 449 Mẫu 1 Mẫu 2 Marker Không có quan hệ huyết thống 517 506 396 344 1018 545 497 433 298 220 201 154 134 529 449 5 . PCR đối với sức khoẻ con người và dự án hệ gen người. PCR đã nhanh chóng trở thành một công cụ thiết yếu trong việc cải thiện sức khoẻ và cuộc sống con người. Y học nghiên cứu và Y học lâm sàng đang thừa hưởng lợi ích của PCR đối với hai lĩnh vực chính: phát hiện bệnh nhiễm khuẩn, phát hiện sự thay đổi và đột biến gen, đặc biệt là gen người. Bởi vì PCR có thể khuếch đại một lượng rất nhỏ ADN thậm chí chỉ từ một tế bào. Các thầy thuốc và các nhà nghiên cứu có thể kiểm tra từ một tinh trùng. Phương pháp này có lợi trong việc tìm kiếm các cơ quan bệnh mà rất khó trong việc nuôi cấy như một số loài vi khuẩn, nấm, vivrus, vì nó tạo ra một khối lượng chất liệu di truyền của sinh vật đó có thể phân tích được để xác định. Ví dụ phát hiện virus AIDS sớm trong vài tuần đầu tiên sau khi nhiễm và hơn là xét nghiệm ELISA tiêu chuẩn. PCR tìm kiếm trực tiếp ADN duy nhất từ virus, thay vì phương pháp xét nghiệm tiêu chuẩn phải tìm gián tiếp bằng chứng xuất hiện của virus từ việc tìm kiếm những kháng thể của cơ thể sinh ra để chống lại sự nhiễm bệnh của virus. PCR cũng có thể chính xác hơn xét nghiệm chuẩn. Nó đang tạo ra một sự khác nhau, ví dụ như trong một tổn thương, đau và thường một sự rủi ro của đứa trẻ như nhiễm khuẩn tai giữa gây ra viêm tai. Kỹ thuật PCR đã phát hiện ADN của vi khuẩn trong dịch tai giữa của đứa trẻ bị viêm tai, trong khi nuôi cấy có thể không phát hiện ra. Bệnh Lyme, đau do viêm khớp gây ra bởi vi khuẩn truyền qua vết cắn của con ve, bệnh này được chẩn đoán dựa trên những triệu chứng cơ bản. Nhưng PCR có thể tập trung vào ADN từ những sinh vật chứa trong dịch khớp cho phép điều trị nhanh để có thể ngăn chặn được những biến chứng nghiêm trọng. PCR là một phương pháp đánh giá nhạy và đặc hiệu nhất đối với vi kuẩn Helicobacter Pylory, bệnh hiện nay hầu hết gây ra loét dạ dày. Không giống như những xét nghiệm trước đây, PCR có thể phát hiện được 3 bệnh truyền nhiễm qua đường tình dục trên cùng một mẫu bệnh phẩm (Herpes, papillomavius, Chlamydia) và thậm chí có thể phân biệt chủng đặc biệt của papillomavius có thể gây ra ung thư mà các xét nghiệm khác không thể làm được. Tóm lại, nếu có một loại nhiễm khuẩn, theo nguyên tắc thì PCR có thể tìm ra được nguyên nhân. Hơn 60 mô hình PCR để xác định tác nhân gây bệnh và ít nhất có 10 sản phẩm lâm sàng để phát hiện sự xâm nhập các cơ quan gây ra như bệnh lao, Chlamydia, virus gây viêm màng não, Viêm gan virus, AIDS, và Cytomegalovirus. Do PCR có thể dễ dàng phân biệt những biến đổi nhỏ trong AND ở mỗi người và tạo ra ở chúng ta tính chất di truyền duy nhất, phương pháp này đưa đến một loại xét nghiệm di truyền mới. Những xét nghiệm này không chỉ để giúp chẩn đoán với những người có rối loạn di truyền mà cả với những người mang những biến đổi có hại như đột biến mà có thể truyền cho con cái của họ (những người mang gen này thường bản thân họ không bị ảnh hưởng bởi đột biến gen mà họ có thể truyền bệnh cho thế hệ sau). PCR có thể mang lại sự an tâm cho những người đang muốn có được đứa con, ví dụ xua đi những nguy cơ có thể có những đưa con có những bệnh di truyền đặc biệt. Kỹ thuật này thậm chí cứu sống những đứa trẻ trước khi chúng sinh ra. Các bác sĩ đã sử dụng nó để xét nghiệm AND thai nhi từ nhóm máu của mẹ và của con xem có hoà hợp với nhau không. Tình trạng này thường dẫn đến những nguy hiểm gây chết thai nhưng có thể được điều trị thành công. PCR có thể giúp chẩn đoán những bệnh trong quá khứ. Cựu phó tổng thống và ứng cử tổng thống Hubert H. Humphrey đã trải qua xét nghiệm vì ung thư bàng quang năm 1967. Mặc dù xét nghiệm là âm tính, ông ta chết vì bệnh này năm 1978. Năm 1994 các nhà nghiên cứu so sánh mẫu năm 1976 với mẫu ung thư bàng quang của ông năm 1967. Với sự trợ giúp của PCR nhân bản từ một lượng nhỏ ADN trong mẫu nước tiểu cảu một người 27 tuổi, họ phát hiện ra rằng có sự đột biến giống nhau ở gen p53 trong cả hai mẫu. Các nhà nghiên cứu đã nói “ bệnh của Humphrey có thể phát hiện được ung thư nếu các kỹ thuật của sinh học phân tử phát triển được như hiện nay ”. Lịch sử di truyền quay trở lại nhờ PCR. Sau bệnh mù màu, nhà hoá học người Anh, John Dalton chết năm 1884, một số mô mắt của ông đã được lưu giữ. Dalton đã hỏi trước khi chết xem lý do tại sao ông lại nhầm lẫn giữa màu đỏ tươi và màu xanh lá cây, màu hồng và màu xanh da trời. Xét ngiệm ADN gần đây từ mô mắt của ông bằng nhân bản ADN đã cho thấy rằng Dalton thiếu một gen để tạo ra một trong ba chất sắc tố cần thiết để phân biệt màu bình thường. *PCR và pháp luật Khả năng vô song của kỹ thuật này đối với xác định và nhân bản một lượng rất nhỏ, thậm chí từ những ADN đã lâu hoặc bị phân huỷ đã được chứng minh là có giá trị đối với pháp luật đặc biệt trong lĩnh vực tội phạm, PCR là một phần không thể thiếu được với giám định pháp y, thường gọi là ADN fingerpriting (in dấu ADN). Đối với những loại ADN, ví dụ ADN tách chiết từ máu tìm thấy trên quần áo của nạn nhân nghi ngờ bị sát hại, các nhà khoa học nghiên cứu trên những vị trí ADN biến đổi giữa những cá thể là điển hình. Việc này giúp cho xác định rất có khả năng mẫu đó phù hợp với ADN của một người cụ thể nào đó. Mặc dù thời gian đầu ADN typing đã gây tranh luận, các phòng xét nghiệm chuẩn đã tiến hành xét nghiệm ADN typing rất kỹ lưỡng, hiện nay trên thế giới được chấp nhận là một bằng chứng rất có giá trị tại toà án. ADN typing là một trong những chứng cớ để kết tội nhưng cũng là một bằng chứng có giá trị để chứng tỏ người vô tội. Rất nhiều những vụ liên quan đến những người bị buộc tội vào tù nhiều năm vì bị cho rằng phạm tội, ví dụ Maryland bị tù 9 năm vì hiếp dâm và giết hại một đứa trẻ 9 tuổi nhưng đã được thả tự do nhờ có kỹ thuật PCR. Thậm chí khi những chứng cứ như tinh dịch, vết máu đã lâu năm, PCR có thể không hạn chế nhân bản một lượng ADN rất nhỏ còn lại trong dấu vết sinh học như đã tiến hành trong trường hợp của Maryland. * ADN cổ đại và mối quan hệ tiến hoá Các nhà khoả cổ học đã dựa vào PCR và ứng dụng nó theo nhiều cách kác hau rất hữu ích, PCR giúp phân loại mối quan hệ giữa những nhóm người đã bị tuyệt chủng và những vết tích của những người di cư. Nghiên cứu những bọ não người sống cách 8000 năm trong một hố sụt ở Florida còn nhiều hay ít, ví dụ xem những người đó có khác di truyền học với những người Mỹ hiện nay? Các nhà khảo cổ đã thây rằng PCR có thể làm sáng tỏ thực tế nền văn hoá con người. Phân tích màu sơn từ tranh đá 4000 năm tuổi ở Texas, họ phát hiện thấy một chất là ADN, có thể từ rừng Bizon, động vật không thể sống ở gần sông Pecos trong thời gian đó. Vì vậy các nhà nghệ thuật phải cố gắng nỗ lực để có được những chất liệu không bình thường như vậy cho tranh của họ. 6. Trong bảo vệ môi trường, việc xác định mức độ ô nhiễm sinh học có thể thực hiện rất hiệu quả nhanh chóng bằng kỹ thuật PCR 7. PCR với hệ thống hiện đại, nghiên cứu sinh thái học Với PCR các nhà hệ thống có thể trực tiếp đo được sự khác nhau của chuỗi ADN giữa các loài và lựa chọn những chuỗi có ít thay đổi trong quá trình tiến hoá, giữa những nhánh sinh vật chính. Tốc độ và sự tự động hoá của các phương tiện, các nhà khoa học có thể dễ dàng so sánh hàng tá, thậm chí hàng trăm cá thể. Với PCR, các nhà khoa học thể hiện lại những thông tin di truyền từ những dấu vết mờ nhạt nhất, nước tiểu, phân động vật, tóc hoặc da người dính trên cây. Thêm những thông tin để giúp phân loại những cá thể có thể được xác định để ước tính lượng dân số trong vùng hay để xác định vùng địa lý của động vật đơn lẻ hay từng nhóm. Kỹ thuật này có thể được chấp nhận để nghiên cứu tỷ lệ đối với thực vật, phân tích sự gieo rắc hạt và mối liên quan sinh sản của những loài thực vật đặc biệt. X- Tương lai của PCR Công nghệ hiên nay để tiến hành PCR sẽ ngày càng phát triền hoàn thiện. Bằng cách thay đổi các chất hoá và pH, các nhà nghiên cứu đã thành công ở mức độ nhân bản càng ngày càng lớn hơn từ những đoạn ADN, kể cả toàn bộ hẹ gen HIV. Sự thu nhỏ hoá của phần cứng, khi các nhà thí nghiệm đưa PCR vào thiết bị xử lý kích cỡ. Ghép chéo giữa hoá chất và ADN với nhau. Thiết bị xử lý làm tăng nhiệt điện và lạnh nhanh hơn những thế hệ máy móc hiện nay, vì vậy việc nhân bản ADN sẽ được tiến hành nhanh hơn. Các nhà khoa học sử dụng những máy năng lượng điện nhỏ để nhân bản những đoạn ADN có 8 vị trí đột biến khác nhau gây xơ nang. Trong khi những thiết bị chip-base vẫn chưa được chuẩn bị cho thí nghiệm, các nhà khoa học có thể mang chúng ra ngoài đường và bệnh nhân sẽ có thể được đọc ADN của họ tại ngay hiện trường. Nó có thể thường qui dùng để chẩn đoán một bệnh nhiễm khuẩn hay những rối loạn di truyền, thậm chí phát hiện một bệnh di truyền có khả năng gây ung thư hoặc bệnh tim ở ngay tại phòng khám của bác sĩ. Theo nguyên tắc, PCR có thể tạo ra vật chất di truyền của một loài sinh vật cần thiết với số lượng không hạn chế, vì vậy nó có thể dùng để phân tích những tế bào nào chứa vật chất đó. Chúng có thể là tế bào mầm, hoặc thực vật hiếm có trong y học, hoặc con người, thực tế chúng ta có thể biết được những gì được ghi lại trên ADN của chúng. Với những sinh vật đơn giản, biết ADN của chúng là sẽ biết được hầu hết về chúng, với những sinh vật phức tạp như con người, ADN chỉ là một thứ rất nhỏ nhưng cũng là một phần vô cùng lớn. Nhờ PCR chúng ta sẽ dò tìm gen quá khứ và xem xét những gen trong tương lai trong nhiều năm tiếp theo. Những hiểu biết xung quanh PCR “PCR là kỹ thuật khoa học mới quan trọng nhất trong suốt một trăm năm qua.” -Mark R. Hughes, phú giỏm đốc trung tõm nghiờn cứu hệ gen người quốc gia, viện sức khoẻ quốc gia (Powledge 1998). Thoạt đầu, tưởng như con đường cao tốc ở California, mựa xuõn núng nực ở cụng viờn quốc gia Đỏ vàng (Yellowstone National Park) và giải thưởng Nobel về hoỏ học chẳng cú điểm chung nào. Nhưng ẩn dấu bờn trong cỏi vẻ bề ngoài dường như khụng liờn quan gỡ đến nhau là “một ý tưởng quỏ tài tỡnh đến mức đó làm thay đổi cỏch con người đặt cõu hỏi” (Rhee 1998). Sự phỏt triển đột phỏ của kỹ thuật PCR bởi Kary Mullis được thai nghộn vào năm 1983 (