Tiểu luận Phụ gia thực phẩm: Enzyme Glucose Isomerase và Glucose Oxidase

hanol by yeasts, and (iii) engineering ofphiên bản của xylose để sản xuất ethanol bằng nấm men, và kỹ thuật the protein to alter its properties to suit its biotechnologicalprotein để thay đổi thuộc tính của nó cho phù hợp với công nghệ sinh học của nóapplications. ứng dụng. Molecular cloning and expression of GI have Phân tử nhân bản và biểu hiện của GI đã been carried out in both homologous and heterologous hostsđược thực hiện trong máy cả hai tương đồng và dị and in yeasts.và nấm men. Sự tương đồng tế bào vật chủ Tương đồng tế bào vật chủ cung cấp một số lợi thế cho việc nhân bản and expression of exogenous DNA.và biểu hiện của DNA ngoại sinh. One of them is the easyCó một vài báo cáo về sự tương đồng nhân bản của GI from Escherichia coli and Streptomyces species.GI từ loài Escherichia coli và Streptomyces. E. coli. Báo cáo đầu tiên về sự cô lập của gen GI from Etừ E. coli by Ho et al.coli bởi Ho et al. (84). DD-Xylose isomerase and xylu- - Xylose isomerase và hoạt động xylu lokinase activities were amplified by transformation of a GI-lokinase đã được khuếch đại bằng cách chuyển đổi của một GI-deficient E. thiếu E. coli strain with plasmid pMB9 bearing a Hin dIIIcoli biến dạng với các pMB9 plasmid mang một HindIII hạn chế mảnh của E. coli DNA nhiểm sắc thể. Các GI gene from E.gen GI từ E. coli was sequenced and was shown to code for coli được giải trình tự và hiển thị mã GI by purification of the cloned gene product (142).GI bằng cách thanh lọc của sản phẩm gen nhân bản vô tính. Nhân bản phân tử, trình tự, và biểu hiện của gen GI trong E. coli have also been reported by Briggs et al.E. coli cũng đã được báo cáo của Briggs et al Lawlis et al.al. (107), and Ueng et al.và Ueng et al. GI đã được sản xuất nhiều hơn trong E. coli by several workers (17, 85).E. coli bởi nhiều công nhân. Ho and Stevis observed thatHo và Stevis quan sát thấy rằng hyperexpression of the gene was not accomplished by merelyhyperexpression của gen này đã không được thực hiện bằng cách chỉ đơn thuần là cloning it on a high-copy-number plasmid, probably becausenhân bản nó trên một số cao sao chép plasmid, có lẽ bởi vì the expression of the gene in E.sự biểu hiện của gen ở E. coli is highly regulated throughcoli là rất cao quy định thông qua its natural promoter. tế bào chủ tự nhiên của nó. Sự hợp nhất của gen cấu trúc strong promoters such as lac or tac resulted in 20-fold over-với chất xúc tác mạnh mẽ như lac hoặc tac trong 20 lần hơn sản xuất các men tiêu hóa. Các gen mã hóa chịu nhiệt GI in Clostridium thermosulfurogenes was cloned in E.GI trong thermosulfurogenes Clostridium đã được nhân bản vô tính trong E. coli by acoli bởi một new plate assay method (110)tấm khảo nghiệm phương pháp mới. The expression of the protein inCác biểu hiện của các protein trong E. coli was higher (0.46 U mgE. coli cao hơn (0.46 U mg-1) so với tế bào chủ (0.19 U mg-1) và được cấu thành. Gen GI từ thermophile Clostridium thermohydrosulfuricum has been cloned in E.Clostridium thermohydrosulfuricum đã được nhân bản vô tính trong E. colicoli with a Bacillus GI gene as a probe for screening of recombi-với một gen vi khuẩn Bacillus GI là một thăm dò cho chiếu recombi-nants (52).nants. Nhân bản, trình tự, và biểu hiện của gen GI genes from Lactobacillus brevis (27), Ampullariella sp.từ brevis Lactobacillus, Ampullariella sp. strainbiến dạng 3876 (139), Arthrobacter 3876, Arthrobacter sp. strain NRRL B3728 (115), Kleb-biến dạng NRRL B3728, Kleb siella pneumoniae 1033 (65), and Thermus thermophilus (53) insiella pneumoniae năm 1033, và Thermus thermophilus E. coli have been reported.E. coli đã được báo cáo. Các tế bào vi khuẩn chủ khác Bacillus thường được coi là vi sinh vật an toànmicroorganism.. Therefore, the GI gene from E.Do đó, gen GI từ E. coli was clonedcoli được nhân bản in Bacillus species by using a bifunctional plas trong các loài vi khuẩn Bacillus bằng cách sử dụng một plasmid bifunctional . However,Tuy nhiên, expression of the gene was not observed.biểu hiện của gen này đã không quan sát thấy. Sự hợp nhất các gen cấu trúc của E. coli của các chất xúc tác của penicillinase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis kết quả chức năng biểu hiện của GI Bacillus subtilis. Các gen GI từ Clostridium thermosulfurogenes was cloned in Bacillus subtilis Thermosulfurogenes Clostridium đã được nhân bản vô tính trong vi khuẩn Bacillus subtilis với E.coli coli - Bacillus shuttle plasmid pMG1.- Bacillus pMG1 qua lại plasmid. Sự biểu hiện của gen GI trong B. subtilis was constitutive and was higher (1.54subtilis đã được cấu thành và cao hơn (1.54 U mg-1) so với sản xuất trong C.thermosulfurogenes (0.29 U thermosulfurogenes (0.29 U mg-1). Nấm men Nhiều loại vi sinh vật có thể sử dụng xylose, but none of them can ferment it to ethanol.nhưng không loài nào trong số nó có thể lên men thành ethanol. Lối đi hẹp chính nằm trong chuyển đổi của xylose vào xylulose, đó là thực hiện trong đường hiếu khí, trong Candida utilis .utilis. Các nấm men pentose sử dụng như Pachysolen tannophilus can ferment xylose anaerobically, but the rate of fermentationcó thể lên men xylose anaerobically, nhưng tỷ lệ lên men is formidably low and is accompanied by considerable amountsformidably thấp và được đi kèm với một lượng đáng kể of side products. Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharo-các sản phẩm phụ. Saccharomyces cerevisiae và Schizosaccharo- myces pombe offer a high fermentation rate, higher end prod-myces pombe cung cấp một tỷ lệ lên men cao, cao hơn năng xuất cuối cùng, và sản lượng ethanol tăng. Chuyển đổi của gen GI đẻ nấm men chủ đảm bảo cho sự phát triển một cơ quan mà có thể lên men xylose để sản xuất trực tiếp để sản xuất ethanol. Một mảnh DNA 2.4 - kb The main bottle- chứa gen GI từ E. coli was iso-coli là iso- lated from the Clarke-Carbon gene bank and introduced intolated từ ngân hang gen Clarke-Carbon và được đưa vào S.pombe thông qua plasmid. Plasmid tái tổ hợp cho thấy sự bù với GI-thiếu E. coli and expres-coli và biểu hiện của các gen trong nắm men. Sự chuyển đổi S.pombe là có thể để lên men 10% (wt/wol) xylose để sản xuất 3.0 (wt/vol) ethanol. Nghiên cứu các quá trình trao đổi chất của D – Xylose trong nấm men được chuyển đổi cho thấy rằng xylytol, một sản phẩm của quá trình lên men xylose trong nấm men, không có hiệu quả trên hoạt động của GI. Các hoạt động thấp của GI trong nấm men là do suy thoái thủy phân protein của men protease và là hạn chế trong quá trình lên men xylose của nấm men. Gen GI từ vi khuẩn Bacillus subtilis và missouriensis Actinoplanes iso- lated by complementation of a GI-negative E.lated bằng cách bù GI đột biến E. coli.The Các coding region of the GI gene from B.mã hóa khu vực của gen GI từ B. subtilis was fused to the subtilis đã được hợp nhất, yeast pyruvate decarboxylase promoter.men pyruvate decarboxylase xúc tác. Các Saccharomyces cerevisiae sản xuất protein xylose isomerase 5% của tổng số protein của tế bào, nhưng nó đã được ức chế không hoạt động. Vùng mã hóa của GI từ A.missouriensis was fused to themissouriensis được hợp nhất để xúc tác nấm men GALI. Sự chuyển đổi cho thấy sự hiện diện của mARN xylose isomerase cụ thể nhưng không có hoạt động enzyme. Đầu vào để nghiên cứu thêm là cần thiết để cải thiện sự biểu hiện của gen GI trong nấm men và ngăn chặng các enzyme bị suy thoái từ protein sở tại. Thực vật Gen GI từ E. coli has been cloned on acoli đã được nhân bản vô tính trên một plasmid pBR322 derivative downstream of the nopaline syn-plasmid pBR322 bắt nguồn từ phía ra của các gen nopaline synthetase xúc tác của Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58.plasmid pTiC58. Nhân bản của gen GI từ E. coli in potato ( Solanum tuberosum ) and in tomato ( Lycopersi-coli trong khoai tây (Solanum tuberosum) và cà chua (Lycopersi cum esculentum ) has been achieved and the presence of the xylcum esculentum) đã đạt được và sự hiện diện của gen xyl gene has been confirmed by the expression of GI activity (98,đã được xác nhận bởi sự biểu hiện của hoạt động tiêu hóa. Quy chế di truyền và sinh tổng hợp glucose ispmerase D-Xylose, though not as common a sugar as glucose, is a-Xylose, mặc dù không phổ biến như đường như glucose, là một major component of plant hemicelluloses.thành phần chính của hemicelluloses thực vật . The microorganismsCác vi sinh vật that survive on decaying plant materials have evolved efficientsống sót trên các nguyên liệu thực vật mục nát đã phát triển hiệu quả trênbiochemical pathways to assimilate con đường sinh hóa để đồng hóa DD-xylose.-Xylose. DD-Xylose as an-Xylose như là một energy source is utilized by bacteria through a pathway involv-nguồn năng lượng được sử dụng bởi các vi khuẩn thông qua một con đường involving vận chuyển qua màng tế bào chất và isomerization để D-Xylose. Dư lượng pentulose là phosphoryl hóa bởi xylulokinase đến năng suất D-Xylose-5-phosphate và coj đường Embden – Meyer – Hoff. Tổ chức di truyền của gen xyl Salmonella typhimurium và E. coli. Genetic studies on Sacoli: Nghiên cứu di truyền trên Sal - monella typhimurium provided evidence for the existence ofmonella typhimurium cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của four clustered genes ( xyl operon) that are responsible for xy-bốn nhóm gen (xyl operon) chịu trách nhiệm về xy – mất dị hóa; đây là những xylT, một gen quy định cụ thể việc vận chuyển of xylose across the cell membrane; xylA , the glucose/xxylose qua màng tế bào; xylA, glucose / xyloseisomerase gene; xylB , the xylulokinase gene; and xylR , a regu- isomerase gen; xylB, gen xylulokinase, và xylR, một quy định latory element essential for transcription of xyl genes (145,latory yếu tố cần thiết cho phiên mã của gen xyl. Các phân tích dẫn truyền của S. typhimurium genes indi-typhimurium gen cá cated the order to be xylT-xylR-xylB-xylA .tạp để có thể được xylT-xylR xylB-xylA. Các nghiên cứu về hệ gen E. colicoli genome revealed an analogous genetic organization and simi-cho thấy một tổ chức di truyền tương tự như con đường sử dụng xylose. Cách ly của E. coli đột biến với đột biến trong xylA, xylB, và xylR (T), cùng với việc bổ trợ dữ liệu, cho thấy thứ tự của các gen được xy- lR ( T )- xylA-xylB (138).lR (T) - xylA-xylB. Những kết quả này hỗ trợ mạnh mẽ một chất kìm hãm điều hành cơ chế cho các quy định của biểu hiện xylAB và giả thiết có một mô hình phối hợp (tích cực) kiểm soát của xylA, xylB, gen xylT bởi các sản phẩm gen xylR. Trong trường hợp không có xylose, sản phẩm xylR hoạt động như một chất kìm hãm, trong khi nó hoạt động như một kích hoạt trong sự hiện diện của xylose, tương tự hoạt động của gen araC của arabinose regulon. Các β – galactosidase sản phẩm hoạt động của phản ứng tổng hợp gây ra bởi xylose nhưng không phải bởi arabinose và được ngăn chặng bởi glucose. Klebsiella pneumoniae : Feldmann et al. have suggested theđã đề nghị presence of a regulatory gene in the 5 upstream region of thesự hiện diện của một gen quy định ở khu vực ngược dòng của 5 gen xylA của Klebsiella pneumoniae, chịu trách nhiệm về xyl phủ định kiểu hình trong việc tái tổ hợp E. coli đột biến. Các loài Bacillus : Quy định của operon xyl trong Bacillus spp.spp has been studied by constructing a xyl-lacZ fusion geneđã được nghiên cứu bằng cách xây dựng một gen tổng hợpxyl-lacZ và tích hợp nó vào gen amy của B. subtilis 168 (71).subtilis 168. Tăng biểu hiện của sản phẩm nhiệt hạch xyl-lacZ, khi chuẩn độ với xyl điều khiển DNA trong trans, đã đề nghị phủ định sự điều khiển của operon trong B. subtilis , in contrast tosubtilis trái ngược với các cơ chế kiểm soát tích cực được mô tả cho các operon xyl của E. coli và S. typhimurium , suggesting that regulation occurs attyphimurium, cho thấy rằng quy định xảy ra tại mức độ phiên mã. Một chuỗi 25-bp, ở 10 bp phần xuống của xyl xúc tác , được xác định là một xyl điều khiển trong B. subtilis 23 (99)subtilis 23. Các loài staphylcoccus Các gen xyl từ S. xylosus được nhân bản vô tính S. carnosus bằng cách bổ sung xylose sử dụng. XylR, xylA, và xylB khung đọc mở được đặt với phân cực tương tự. Hai đơn vị phiên mã, xylR và xylA, được ngăn cách bởi một kết thúc phiên mã giữa gen, và sự hiện diện của các trình tự giống như chất xúc tác liên tục được quan sát ngược dòng của cả hai transcriptional bắt đầu hoạt động. xylA và xylB được phân cách bởi chỉ có 5 nucleotide giữa dừng lại và bắt đầu codon tương ứng. Điều này quan sát, cùng với không có cấu trúc giống như kết thúc giữa xylA và xylB, đề nghị mạnh mẽ rằng nó là cotranscribed. Cotranslation của hai gen này cũng được chỉ định bởi sự hiện diện của một điện thế Shine-Dalgarno trình tự xylB (AAGGA) trùng lặp với codon cuối cùng của xylA. Những kết quả này ủng hộ mạnh mẽ repressor điều hành cơ chế cho các quy định của xylAB. Một phương pháp mới liên quan đến sự hợp nhất của các luxA và luxB gen của biển vi khuẩn gram âm Vibrio harveyi MAV để operon xyl từ S. xylosus được sử dụng cho định lượng cảm ứng và áp catabolite của operon xyl S.carnosus TM 300. Streptomyces species: Đột biến của Streptomyces violaceoniger thiếu isomerase xylose hoặc xylulosekinase được phân lập. Mảnh vỡ nhiễm sắc thể với khả năng để bổ sung cho tất cả ba lớp khác nhau của âm xyl đột biến đã được nhân bản vô tính trên một plasmid. Nội địa hóa của các genchỉ ra rằng gen xylulosekinase giả định nằm gần gen glucose isomerase, mà là phù hợp với tổ chức của locus trong Salmonella typhimurium, E. coli, và vi khuẩn Bacillus subtilis Chất xúc tác khác nhau Các nghiên cứu về gen xylA của Streptomyces violaceoniger có chỉ ra rằng xylA và xylB thúc đẩy phiên mã ở đối diện hướng. Sự tồn tại của các chất xúc tác khác nhau trong Streptomyces spp. và prokaryote khác đã được báo cáo trước đây. Trình tự phân tích đã chỉ ra sự hiện diện của 1/3 đọc khung hình, trong đó mã hóa một protein điều. Hai gen được ngăn cách bởi một khu vực ngắn (195 bp), trong đó tiết lộ sự hiện diện của một phần tử đối xứng với palindromic đặc trưng của các nhà khai thác vi khuẩn. Hai gen được phiên mã divergently từ trong một chuỗi 114-bp tách hai vùng mã hóa, trái ngược với trước đó quan sát gen xylA và xylB là một phần của một operon. Sao chép các phạm vi hoạt động bắt đầu là 40 và 20 bp phần xuống của các phạm vi hoạt động bắt đầu dịch của xylA và xylB tương ứng. Xúc tác của các gen chia sẻ 33 bp phủ lên nhau trình tự trong các khu vực untranscribed giữa hai gen. Phiên mã của gen xyl S. rubiginosus gây ra bởi xylose và bị ức chế bởi glucose. Người ta tin rằng 114-bp khu vực intergenic nucleotide cung cấp các ràng buộc về hoạt động cho các protein điều hòa. Sự ức chế catabolite Sự biểu hiện của operons xyl trong Salmonella typhimurium và E. coli dường như được quy định bởi một cơ chế kiểm soát tích cực và ức chế catabolite tác dụng bởi glucose. Ngoài ra, một tác dụng điều tiết của xylose isomerase chính nó đã được mô tả cho E. Coli. Trong E. coli, ức chế catabolite thông qua kích hoạt phiên mã bởi catabolite gen hoạt hóa protein và cyclic AMP (cAMP). Bacillus subtilis, operon xyl phủ định sự gối lên nhau bởi repressor xyl và cảm ứng bởi xylose. Các cAMP-cAMP cơ chế trung gian thụ thể quan sát thấy ở vi khuẩn E. Coli không chức năng B. subtilis, bằng chứng là các quan sát như vậy nồng độ cAMP là không bị ảnh hưởng bởi nồng độ của chất ức chế catabolite, các protein thụ thể cAMP đã không được phát hiện trong các vi khuẩn gram dương và ức chế catabolite trong B. Subtilis là tiêu cực tại các mức độ phiên mã. Jacob et al. đã chứng minh rằng glucose ức chế xảy ra ở mức độ phiên mã, là độc lập của một gen điều khiển chức năng cảm ứng xylose và phụ thuộc trên một trình tự cis trong khung đọc dịch của xylA. Các nghiên cứu của Kraus et al. Chứng tỏ rằng glucose cho thấy một loại trừ cảm ứng bổ sung loại áp xylA độc lập của cis-hành động yếu tố nhưng đòi hỏi một xylR chức năng và phụ thuộc vào nồng độ glucose và inducer (xylose). Trong kết luận, tổ chức của xylA và xylB dường như được bảo tồn cao độ trong tất cả các vi khuẩn. Hai gen luôn liền kề với nhau, nhưng kiểm tra kỹ hơn cho thấy đánh dấu sự khác biệt trong tổ chức của nó, như trong hính dưới: Trong Bacillus subtilis, các gen xylR có một phân cực ngược lại đến các gen xylA không giống như trong Staphylococcus xylosus và Lactobacillus spp. Trong Streptomyces spp, các gen được phiên mã xylA và xylB divergently sợi khác nhau, trong khi ở vi khuẩn E. coli, Lactobacillus spp. Và Bacillus spp. Đã ược phiên mã từ cùng một sợi. Các phân tích gen xyl từ một loạt các sinh vật sẽ giúp hình thành một ý kiến đồng thuận về việc tổ chức di truyền và các quy định của các gen xyl. Cải thiện di truyền của glucose isomerase bằng đột biến có định hướng phạm vi hoat động Những tiến bộ trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thành công cách ly gen của protein. Kỹ thuật protein bởi thao tác của các gen của họ là trình bày một cách tiếp cận khả thi trong đó bổ sung cho cấu trúc chức năng nghiên cứu thực hiện bởi phương pháp tồn tại từ trước và cho phép sản xuất protein thích hợp thực hiện với những đặc tính mong muốn để cho một cái nhìn đầy đủ về cơ chế của enzyme. Những nghiên cứu này dẫn đến một giả thuyết mà có thể được xác định bởi kỹ thuật protein. Đột biến có định hướng phạm vi hoạt động (SDM) của GI đã được thực hiện với một số mục tiêu của tầm quan trọng học tập và công nghiệp, chẳng hạn như tăng sự ổn định nhiệt, giảm pH tối ưu, thay đổi ưa thích chất nền, suy luậnvai trò chức năng của dư lượng axit amin thiết yếu, vànghiên cứu sự tương tác tiểu đơn vị. Những nghiên cứu này đã góp phần đáng kể vào hiểu biết của chúng ta về cơ chế phân tử GI và đã tạo ra khả năng mới của sản xuất một enzyme với tính chất phù hợp hơn cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học. Một vài ví dụ về cách đã giúp SDM nâng cao kiến ​​thức về cơ chế hoạt động của enzyme và đã sản xuất một loại enzyme với những đặc tính được cải thiện được ghi nhận dưới đây. Ổn định nhiệt độ Hầu hết các chế phẩm thương mại của GI có một nhiệt độ tối ưu từ 60 đến 650C. Hoạt động của GI suy giảm là một kết quả của việc nhiệt của nó ngừng hoạt động. Điều này ban một giới hạn về thời gian hoạt động của lò phản ứng. Một vài cơ chế được biết là có tham gia vào bất hoạt không thể đảo ngược của GI, chẳng hạn như mở ra không thể đảo ngược, glycation, và / hoặc deamidation của ASN hoặc GLN. Trong điều kiện thực tế, GI được tiếp xúc với nồng độ đường cao có thể dẫn đến glycation nonenzymaticdư lượng lysine và bất hoạt tiếp theo của GI. Thiết kế thí nghiệm kỹ thuật protein trên GI từ Actinoplanes missouriensis đã cho thấy rằng một đột biến GI có chứa một sự thay thế arginine cho lysine ở vị trí 253 tại giao diện dimer-dimer tăng một nửa sự tồn tại của enzyme 30% . Việc đạt được sự ổn định lớn nhất là đạt được trong một trong ba đột biến (G70S/A73S/G74T) của enzyme, cho cả hai hòa tan và bất động chuẩn bị. Tương tác kỵ nước trong số các acid amin thơm có mặt trong các hoạt động của GI là mặc nhiên công nhận là một trong những yếu tố quan trọng là giúp duy trì sự liên kết của monome vào hoạt động dimers. Sự gia tăng trong chịu nhiệt do đó có thể đạt được bằng cách tăng cường sự tương tác giao diện của các hoạt động dimers. Tăng cường tính chịu nhiệt của GI được thu thập từ Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes như là một hậu quả của việc giảm kỵ nước có thể tiếp cận được bề mặt bằng cách đột biến có định hướng phạm vi hoạt động của axit amin thơm trong các phạm vi hoạt động. Thay thế W139 với F, M, hoặc dẫn đến hiệu quả xúc tác làm tăng tỷ lệ thuận với giảm sợ nước của chuỗi bên của các thay thế amino acid. Ảnh hưởng của thay đổi dư lượng tại các giao diện tiểu đơn vị về hoạt động và chịu nhiệt của GI từ Arthrobacter spp. đã được nghiên cứu bởi Varsani et al. Giới thiệu một hoặc hai mối liên kết disulfide, cầu muối tại giao diện tiểu đơn vị không kết quả trong bất kỳ sự thay đổi trong hoạt động của enzyme hay sự ổn định. Một phân tích các kết quả chỉ ra rằng tiểu đơn vị phân ly không phải là trên con đường ngừng hoạt động, nhiệt nhưng đó chuyển động của nhóm hoạt động, phạm vi hoạt động có thể gây ra những thay đổi conformational mà có thể chịu trách nhiệm về việc bắt đầu diễn tiến của protein. Tìm hiểu vai trò của các ion kim loại Phân tích được các vai trò của các ion kim loại có liên quan đến tính chịu nhiệtvà xúc tác là khó khăn. Các đặc tính sinh hóa của GIA. missouriensis điều tra sau khi các chuỗi bên tham gia vào các liên kết kim loại được thay thế bởi SDM. Các kết quả chứng minh rằng hai ion kim loại đóng một vai trò quan trọng trong liên kết và ổn định các hình thức mở bề mặt và hydride xúc tác trong việc chuyển giao giữa vị trí C-1 và C-2. Vai trò riêng biệt của hai ion magiê cần thiết cho hoạt động GI olivochromogenes Streptomyces được xác định phân tích kích hoạt neutron và SDM. Một trong những phạm vi liên kết kim loại, M-1, đã được gỡ bỏ thay thế của Glu-180 bởi Lys. Mở vòng thử nghiệm với các E180K đột biến với 1 thioglucose như bề mặt cho thấy rằng Glu-180 thiết yếu cho đồng phân nhưng không cho mở vòng. Sự thay đổi đặc trưng của cơ chất GI hiển thị ái lực cao hơn cho xylose hơn cho glucose. Tuy nhiên, tăng ái lực đối với glucose là mong muốn của mình ứng dụng trong sản xuất HFCS. Những nỗ lực nhằm làm thay đổi chất nền ưu đãi của GI ưa nhiệt từ Clostridium thermosulfurogenes đã được thực hiện bằng cách thiết kế lại các axit amin nằm trong túi chất nền ràng buộc. W-139ÒF thay thế giảm Km và tăng Kcat. đột biến đối với glucose, trong khi hiệu ứng ngược lại đối với xylose được quan sát thấy. Đột biến tăng gấp đôi (W-139 Ò F/V-186 Ò TW-139 và W-139 Ò F/V-186 Ò S) có năm và gấp đôi cao hơn hiệu quả sử dụng xúc tác, tương ứng, so với các loại tự nhiên. Những kết quả này cung cấp bằng chứng rằng các đặc trưng chất nền có thể được thay đổi bằng cách giảm các khó khăn steric và tăng cường năng lực liên kết hydro cho glucose trong túi substratebinding của các phạm vi hoạt động. Vai trò chức năng của lượng dư acid amin thiết yếu Các phạm vi cần thiết lượng dư histidine hoạt động trong GI Clostridium thermosulfurogenes đã được xác định bằng cách thay thế dư lượng histidine ở bốn vị trí khác nhau. Thay thế của His-101 bởi phenylalanine bãi bỏ các hoạt động của enzyme, trong khi đó thay thế dư lượng histidine khác không có tác dụng. His-101 và His-271 được chứng minh là thành phần thiết yếu của phạm vi hoạt động của GI từ E. coli bằng cách thay thế chọn lọc của mỗi acid amin. Đó là suy đoán rằng His-101 là cơ sở trung gian xúc tác phản ứng trong khi His-271 vận hành hư là một phối tử cho một trong các ion kim loại trong các phạm vi hoạt động của GI. SDM được sử dụng để đánh giá vai trò cấu trúc và chức năng dư lượng axit amin cụ thể trong GI từ Actinoplanes missouriensis. His-220 và His-54 là quan trọng nhưng không cần thiết cho xúc tác. His-54 là ngụ ý đến chi phối đặc trưng anomeric. Lys-183 đã được giả định để đóng một vai trò quan trọng trong các bước đồng phân bằng cách hỗ trợ chuyển động qua lải của proton. Lys-294 là gián tiếp liên quan đến việc ràng buộc các cation kích hoạt, trong khi TRP-16 và TRP-137 góp phần duy trì kiến trúc chung của phạm vi ràng buộc chất nền. SDM của lượng dư tryptophan được bảo tồn trong enzyme E. coli (Trp-49 và Trp-188) cho thấy huỳnh quang dập tắt những dư lượng xảy ra trong quá trình liên kết của xylose bởi các enzyme tự nhiên. Các phạm vi hoạt động thay thế tại His-101, mà kết quả bất hoạt các men tiêu hóa, cho thấy thay đổi đặc điểm quang phổ. Thay đổi trong pH tối ưu Ứng dụng thương mại của GI đòi hỏi một điểm pH tối ưu có tính axit để cho phép hóa lỏng tinh bột và đồng phân glucose được thực hiện trong một bước duy nhất. Glu-186 là một bảo tồn dư lượng nằm gần vị trí hoạt động của GI từ A.missouriensis nhưng không tham gia vào các chất nền hoặc ion kim loại ràng buộc. Các điện tích âm từ nhóm này đã được gỡ bỏ do đột biến glutamine, kết quả trong việc giảm pH tối ưu của nó đến 6.25 và thay đổi xu thế từ Mg2+ sang Mn2+. Nghiên cứu này cho biết thêm thông tin mới về các cơ chế xúc tác của đồng phân aldose-ketose GI và chứng minh thay thế một amino acid có thể thay đổi pH tối ưu hơn 1 đơn vị pH. Xác định vấn đề quan trong và giải pháp mang lại hiệu quá tiềm năng Giới thiệu về đồng phân enzyme glucose sản xuất HFCS là gặp phải một số vấn đề. Trong số các vấn đề lớn là bất hoạt của GI ở nhiệt độ cao, pH cao tối ưu của nhiều các chế phẩm GI, yêu cầu của Co2+ cho các hoạt động của enzyme, các mối quan hệ thấp hơn của GI glucose hơn xylose, và nồng độ tối ưu của sản phẩm. Chuyên sâu nghiên cứu cách khắc phục những vấn đề này có kết quả trong sự phát triển của cải tiến đáng kể quy trình. Tuy nhiên, có phạm vi để tiếp tục cải thiện trong tất cả các lĩnh vực nói trên để phát triển một quá trình thương mại khả thi về mặt kinh tế để thay thế cho glucose bởi HFCS. Một trong số những vấn đề quan trọng phải đối mặt trong công nghiệp ứng dụng của GI và các giải pháp chính đáng, chúng sẽ được thảo luận dưới đây. Tăng cường tính chịu nhiệt Việc chuyển đổi trạng thái cân bằng của đường fructose dưới điều kiện quá trình công nghiệp là khoảng 50%, và các entanpy của phản ứng là 5 kJ /mol. Các ứng dụng thương mại của HFCS yêu cầu sử dụng fructose nồng độ