Tiểu luận Tìm hiểu về vi khuẩn Clostridium Botulinum gây bệnh trong thực phẩm và độc tố Botulin

nhất của loài này là việc sản xuất các dược lý độc tố thần kinh được công nhận là chịu trách nhiệm về bệnh ngộ độc. Tám huyết thanh độc tố khác biệt được công nhận là: A, B, C1, C2, D, E, F, và G, mặc dù C2 không phải là một chất độc thần kinh, một chủng duy nhất của Clostridium Botulinum sẽ thường chỉ sản xuất một loại, mặc dù có những ngoại lệ. Năm 1985, một số chủng Clostridium barati và Clostridium butyricum chịu trách nhiệm đối với trường hợp bệnh ngộ độc cho trẻ sơ sinh được phát hiện là có sản xuất độc tố thần kinh tương tự, mặc dù chúng không hề liên quan đến bất kỳ trường hợp ngộ độc thực phẩm nào. Phân nhóm Dựa vào các đặc điểm sinh lý người ta phân Clostridium botulinum thành 4 nhóm như bảng sau: Nhóm I II III IV Loại độc tố A, B, F B, E, F C1, C2, D G Phân giải Protein Có Không Không Có Phân giải Lipid Có Có Có Không Phân giải Saccharose Có Có Có Không Psychrotrophic (t0min tăng trưởng) Không (10 – 120C) Có (3 – 50C) Không (150C) (120C) Sự ức chế của muối (aw) 10% (0.94) 5% (0.975) 3% >3% Bền nhiệt Có (Chết ở 1210C, 0.1 – 0.25 phút) Không (Chết ở 800C, 0.6 – 3.3 phút) Đối tượng gây bệnh Người Người Chim và động vật Người Nhóm I phân giải protein mạnh mẽ và thường sẽ cho ta biết sự hiện diện của chúng trong thực phẩm bởi một phần các sản phẩm bị phân rã trở nên có mùi ôi. Nhóm I là chủng không ưa lạnh và vì thế ít liên quan đến sản phẩm đông lạnh. Tuy nhiên chúng thực hiện việc sản xuất ra phần lớn các bào tử chịu nhiệt và có thể gây ra một vấn đề khi các loại thực phẩm đó phụ thuộc vào bước làm nóng. Ngược lại, nhóm II chủng đại diện cho một mối nguy hiểm tiềm năng lớn hơn trong các thực phẩm đông lạnh. Chúng không phân giải protein với các protein có nguồn gốc, có thể phát triển và sản xuất chất độc ở nhiệt độ xuống dưới 30C và sản sinh bào tử với sức đề kháng nhiệt thấp. Chúng cũng có xu hướng dễ bị ức chế bởi muối. (bảng 1). Tỷ lệ tăng trưởng và sản xuất độc tố ở giới hạn nhiệt độ thấp hơn là làm chậm và sẽ giảm hơn nữa bằng bất kỳ yếu tố khác bất lợi đến tăng trưởng. Nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng thời gian lưu trữ 1 – 3 tháng là cần thiết để sản xuất chất độc ở 3.30C. Cá trích đóng gói hút chân không được cấy vào 100 bào tử / bao trở thành độc hại sau 15 ngày lưu trữ ở 50C. Hầu hết các trường hợp bệnh ngộ độc ở người đều do các típ chất độc loại A, B, E và tỷ lệ gây bệnh của các típ độc khác cho con người là rất hiếm. Nhóm III sản xuất chất độc chủng loại C và D thường là liên quan với các căn bệnh ở động vật và chim. Kể từ khi bệnh ngộ độc không nhất thiết phải là nguyên nhân gây ra cái chết trong những trường hợp này, và đã có không có báo cáo nào về sự có mặt của típ G loại trong thực phẩm, vai trò của nó trong việc gây bệnh từ thực phẩm là đáng ngờ. Nhóm IV chủng sản xuất độc tố loại G và một số Clostridium botulinum không sinh độc tố được chỉ định là một loài mới, Clostridium argentinense. Phân bố Mặc dù cũng có trường hợp nó được tìm thấy ở đường tiêu hóa của loài chim và động vật có vú, nhưng Clostridium botulinum bản chất là một vi khuẩn hoại sinh sống trong đất. Nó xuất hiện rất phổ biến, mặc dù sự phân bố địa lý không đồng nhất. Khảo sát tiến hành tại Hoa Kỳ tìm thấy típ độc loại A là phổ biến nhất ở phía Tây, hiếm có ở thung lũng Mississippi, rất ít ở vùng dọc theo ven biển phía Đông, nơi típ độc loại B đã chiếm ưu thế. Phân phối này đã được phản ánh trong các dịch bệnh ngộ độc tại Hoa Kỳ trong giai đoạn 1950 – 1979, khi 85% những người ở phía tây sông Mississippi bị ngộ độc do loại độc tố A và 63% của những người phía đông bị ngộ độc do loại B. Vùng đất châu Âu típ độc loại B có xu hướng phổ biến hơn loại A. Bùn thủy sản cung cấp ẩm, kỵ khí, môi trường giàu chất dinh dưỡng do đó Clostridium botulinum có thể phát triển, vì vậy việc phân lập các Clostridium botulinum từ các nguồn này là nhiều hơn từ các loại đất. Típ độc loại E ưa lạnh đã được đặc biệt liên quan đến môi trường trong khu vực như miền tây Bắc Mỹ, Nhật Bản và bờ biển Baltic. Kết quả là, loại E là thường là nguyên nhân về sự bùng phát của bệnh ngộ độc mà cá là phương tiện lây nhiễm chủ yếu. Bệnh và triệu chứng lâm sàng Độc tố botulin Clostridium botulinum có 8 típ độc tố là A, B, C1, C2, D, E, F, và G, (mặc dù C2 không phải là một chất độc thần kinh), được gọi chung là botulin. Phân biệt giữa chúng với nhau bằng các đặc tính kháng nguyên. Trong đó có 3 típ gây độc là A, B, E (độc nhất là típ A, đến típ B). Độc tố này có tính độc mạnh nhất trong các chất độc đã biết. Nó độc gấp 7 lần so với độc tố uốn ván, gây chết người với một lượng rất nhỏ chỉ 10-8g. Lợi dụng độc tố này con người đã từng sử dụng chúng trong chiến tranh để làm vũ khí sinh học. Hình: Ảnh 3D độc tố botulin Đặc điểm của độc tố này có là không bị phân hủy trong môi trường aicd của dạ dày và dưới tác dụng của các enzyme tiêu hóa (pepsin, trysin), nó chịu được nhiệt độ thấp, nhưng lại mất hoạt tính ở nhiệt độ cao và môi trường kiềm. Ở 500C độc tố đã bị phá hủy sau 30 phút. Tuy nhiên, nếu được sử dụng với một liều lượng rất nhỏ thì độc tố botulin trở nên có hữu ích trong điều trị y tế. Trên thực tế, độc tố Botulinum đã được sử dụng để làm giảm nếp nhăn trên khuôn mặt bằng cách ngăn ngừa co thắt của cơ bắp dưới da, và cho các trường hợp y tế khác, chẳng hạn như co thắt mí mắt và mồ hôi nách nặng. Tuy nhiên, đã có trường hợp xuất hiện của tác dụng phụ nghiêm trọng, chẳng hạn như tê liệt cơ bắp lan ra ngoài vùng được điều trị. Điều đó cho thấy với việc sử dụng các chất độc botulinum vì lý do y tế cần phải hết sức thận trọng vì botulin là con dao hai lưỡi. Ngộ độc botulin Ba loại bệnh ngộ độc được ghi nhận: do thực phẩm gây bệnh ngộ độc, bệnh ngộ độc trẻ em hoặc truyền nhiễm và các nhiễm độc vết thương. Chỉ có ở hai loại hình đầu tiên là thực phẩm luôn luôn có liên quan. Nhiễm độc thực phẩm là một ví dụ về ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn: đó là kết quả của việc tiêu hóa một ngoại độc tố được tạo ra bởi Clostridium botulinum phát triển trong thực phẩm. Các độc tố botulin là độc tố thần kinh; không giống như độc tố khác có hoạt động cục bộ trong ruột, chúng ảnh hưởng đến chủ yếu là các dây thần kinh tiết acetylcholine của hệ thần kinh ngoại vi. Các thử nghiệm trên động vật cho thấy độc tố ăn phải cùng với thức ăn và còn hoạt tính sẽ được hấp thu ở phần trên của ruột non và đi đến mạch máu thông qua hệ bạch huyết. Nó liên kết đến những dây thần kinh cuối tại ngã ba dây thần kinh cơ, ngăn chặn sự giải phóng các acetylcholine có trách nhiệm truyền các kích thích, do đó tạo ra trạng thái tê liệt. Các triệu chứng ban đầu của nhiễm độc xảy ra từ 8 giờ đến 8 ngày, thông thường là 12 – 48 h sau khi ăn phải các thực phẩm có chứa độc tố. Các triệu chứng tiến triển theo tuần tự bao gồm: ói mửa, táo bón, bí tiểu, nhìn một thành hai, khó nuốt (chứng khó nuốt), miệng khô và khó khăn trong việc nói (dysphonia). Bệnh nhân vẫn tỉnh táo cho đến khi các kết quả suy nhược tiến triển như suy hô hấp hoặc suy tim dẫn đến tử vong. Điều này thường xuất hiện 1 – 7 ngày sau khi khởi phát triệu chứng. Bệnh nhân nếu còn sống có thể phải mất đến 8 tháng đến hồi phục hoàn toàn. Các bác sĩ có thể thực hiện việc để giảm nhẹ tác động của độc tố đã tích tụ tại các khớp thần kinh cơ, mặc dù thuốc kháng độc tố phong tỏa thần kinh cơ như 4 – aminopyridine được tạo ra có cải thiện tạm thời. Do đó sự tồn tại quan phụ thuộc vào chẩn đoán và điều trị sớm, chủ yếu bằng cách rửa dạ dày bằng kiềm rửa để loại bỏ bất kỳ thực phẩm độc hại còn lại, truyền tĩnh mạch của kháng độc tố cụ thể hoặc polyvalent để trung hòa độc tố lưu hành, và hỗ trợ hô hấp cơ học khi cần thiết. Tỷ lệ tử vong thường cao (20 – 50%), nhưng sẽ phụ thuộc vào có nhiều yếu tố như các loại độc tố (loại A thường tạo ra một tỷ lệ tử vong cao hơn B, E), số lượng ăn phải, các loại thực phẩm và tốc độ của chữa trị. Nó đã được chứng minh, ít nhất là đối với các loại C và D, là thông tin di truyền mã hóa cho sản xuất độc tố được kết hợp với một vi khuẩn ôn hoà. Điều này vẫn tiếp diễn trong tế bào vi khuẩn như prophage một; DNA của nó kết hợp và tái tạo với các nhiễm sắc thể của vi khuẩn mà không gây phân giải. Trạng thái phân giải xảy ra rộng rãi trong vi khuẩn trong tự nhiên, thường không làm thay đổi vi sinh vật đặc trưng, nhưng đôi khi, như ở đây, nó liên kết với việc sản xuất chất độc. Một ví dụ khác là việc sản xuất các độc tố bệnh bạch hầu bằng chế phẩm Corynebacterium diphtheriae. Trẻ sơ sinh bị ngộ độc khác với hội chứng cổ điển ở chỗ nó kết quả của tích tụ của trong ruột trẻ sơ sinh với C. botulinum và sản xuất độc tố tại chỗ. Nó đã được mô tả đầu tiên (năm 1976) và thường xuyên nhất được báo cáo tại Hoa Kỳ, mặc dù các trường hợp đã xuất hiện tại Úc, Canada, châu Âu và Nam Mỹ. Đến năm 2005 đã có 6 các trường hợp xác nhận của bệnh ngộ độc cho trẻ sơ sinh ở Anh, chủ yếu liên quan đến sản xuất độc tố loại B. Nó xảy ra chủ yếu ở trẻ tuổi từ 2 tuần đến 6 tháng, đặc biệt khoảng thời gian đó không có thức ăn sữa được cung cấp Ở giai đoạn này, trẻ sơ sinh hệ vi khuẩn đường ruột không phát triển đầy đủ và chưa có khả năng cạnh tranh và loại trừ ra C. botulinum. Kể từ khi nó chỉ có đòi hỏi ăn phải bào tử tồn tại, các nguồn môi trường khác với thực phẩm có thể tham gia và những loại thực phẩm mà hoạt động như phương tiện không nhất thiết có khả năng hỗ trợ tăng trưởng của sinh vật. Mật ong là liên quan với một số trường hợp ngộ độc cho trẻ sơ sinh ở Mỹ và một số cuộc điều tra đã tìm thấy bào tử tồn tại của C. botulinum trong 10% số mẫu kiểm tra. Do đó nó được cho là không nên ăn mật ong đối với trẻ em dưới một năm tuổi. Bệnh này có đặc điểm là các triệu chứng thần kinh cơ liên quan đến các cổ điển và chẩn đoán ngộ độc có thể được xác nhận bởi sự cô lập của sinh vật và độc tố của nó từ phân. Mặc dù liên quan đến một tỷ lệ nhỏ (4%) các trường hợp hội chứng đột tử trẻ sơ sinh tại Hoa Kỳ, tỷ lệ tử vong thấp trong các trường hợp được điều trị. Ngộ độc vết thương là do một nhiễm trùng dưới da với C. botulinum. Điều này có thể là kết quả của chấn thương, nhưng trong những năm gần đây có thường kết hợp với sử dụng thuốc tiêm tĩnh mạch. Tai nạn quá liều độc tố botulinum trong khi sử dụng mỹ phẩm của mình đến loại bỏ nếp nhăn trên khuôn mặt cũng gây ra các trường hợp đôi khi. 2.4.2. Nguyên nhân ngộ độc ● Trẻ sơ sinh bị ngộ độc: Trẻ sơ sinh ngộ độc sau khi tiêu thụ các bào tử của vi khuẩn, mà sau đó phát triển và nhân lên trong ruột và tạo ra độc tố. Nguồn gốc của bệnh ngộ độc cho trẻ sơ sinh có thể từ mật ong, nhưng nhiều khả năng tiếp xúc với đất bị ô nhiễm với vi khuẩn. ● Qua thực phẩm bị ngộ độc: Nguồn gốc của bệnh ngộ độc qua thực phẩm thường từ thực phẩm đóng hộp tại nhà, chẳng hạn như đậu xanh, ngô và củ cải đường. Tuy nhiên, bệnh cũng đã xảy ra từ ớt, khoai tây nướng và dầu truyền với tỏi. Khi ăn thức ăn có chứa các độc tố, nó sẽ phá vỡ chức năng thần kinh, gây tê liệt. ● Vết thương ngộ độc: Khi vi khuẩn C. botulinum nhập vào một vết thương, có thể là một chấn thươngmà không nhận thấy, nó có thể nhân lên và tạo ra độc tố. Vết thương ngộ độc đã tăng lên trong những thập kỷ gần đây ở những người tiêm chích heroin, có thể chứa các bào tử của vi khuẩn. Một số người cũng đã nhận được bệnh ngộ độc từ hít phải các bào tử từ cocaine. Người ta cũng tin rằng vi khuẩn gây bệnh ngộ độc có thể được sử dụng làm vũ khí – bằng cách cố ý bỏ vi khuẩn vào thực phẩm, hoặc thả vào trong không khí để người khác hít vào. Cơ chế ngộ độc tố Các độc tố botulin là chất độc hại nhất được biết đến, liều gây chết cho một người lớn là rất thấp chỉ 10 – 8g. Chúng là protein cao phân tử (150 kDa) và có thể bị bất hoạt ở 800C trong 10 phút. Trong nuôi cấy, độc tố được tạo ra trong suốt quá trình tăng trưởng logarit và giải phóng vào môi trường xung quanh để ly giải tế bào. Trong các khu phức hợp nhỏ nhất, khu phức hợp M, chất độc thần kinh thường có đi kèm theo là protein có kích thước tương tự như không có hoạt tính sinh học rõ ràng, trong khi trong các phức hợp L lớn hơn, một thành phần bổ sung ngưng kết tố hồng cầu cũng có mặt. Dường như chất độc thần kinh được tổng hợp ban đầu là chuỗi tiền độc tố duy nhất được kích hoạt theo sự phân giải protein để tạo ra một phân cao hơn tử bao gồm chuỗi nhẹ (Mr 50 kDa) và nặng (Mr 100 kDa) là 2 chuỗi liên kết có cầu nối disulfua (Hình 2). Trường hợp các sinh vật không tự sản xuất enzym thủy phân protein thích hợp, các tiền độc tố có thể được kích hoạt bằng các enzyme trypsin trong đường ruột. Mở rộng hơn sự phân giải protein như vậy sẽ dẫn tới khử hoạt tính độc tố đó, các nguy hiểm chết người uống độc tố A ở chuột gấp 104 – 105 lần so với quan sát thấy khi dùng intraperitoneally. Chuỗi nặng có trách nhiệm cụ thể liên kết với các tế bào thần kinh và sự thâm nhập tế bào theo các chuỗi nhẹ. Hình 2: Sản xuất và kích hoạt các độc tố botulin Các endopeptidase sẽ tách riêng ra các phức hợp sau đó bám và hòa trộn trong các túi tiếp hợp, các túi có chứa acetylcholine thần kinh. Các protein đặc biệt bị tấn công và bị thuỷ phân ở các liên kết peptide khác nhau đối với các loại độc tố khác nhau. Các loại độc tố B, D, F, và G thủy phân mỗi liên kết peptide liên quan khác nhau trên lớp protein màng túi, cũng gọi là khớp thần kinh. Các loại A và E tấn công các liên kết khác nhau trên các protein liên kết synaptosome, SNAP-25, và loại C1 làm thoái hóa SNAP-25 và syntaxin. Các minh họa được thể hiện ở hình ảnh bên dưới: Trường hợp không có độc tố botulin B).Trường hợp có độc tố Botulin 2.3.4. Phương pháp điều trị Để chẩn đoán bệnh ngộ độc, bác sĩ sẽ kiểm tra xem có các dấu hiệu suy yếu hoặc tê liệt cơ bắp, như mí mắt rủ và một giọng nói yếu. Bác sĩ cũng sẽ hỏi về các loại thực phẩm đã ăn trong vài ngày qua, và yêu cầu nếu có thể đã được tiếp xúc với các vi khuẩn qua vết thương. Xét nghiệm máu có thể xác nhận sự hiện diện của độc tố. Trong trường hợp ngộ độc trẻ sơ sinh, bác sĩ có thể hỏi, nếu trẻ đã ăn mật ong gần đây và đã có vấn đề như táo bón, trì trệ. Phân tích phân hoặc chất nôn cho bằng chứng về độc tố có thể giúp xác nhận một trẻ sơ sinh hoặc chẩn đoán ngộ độc thực phẩm, nhưng vì những thử nghiệm này có thể mất hàng ngày, kiểm tra lâm sàng của bác sĩ là phương tiện chính của chẩn đoán. Đối với trường hợp ngộ độc thực phẩm, các bác sĩ đôi khi làm sạch hệ tiêu hóa bằng cách gây ói mửa và cho thuốc để tăng đi tiêu. Nếu có bệnh ngộ độc ở vết thương, bác sĩ có thể cần phải phẫu thuật loại bỏ mô bị nhiễm bệnh. ● Kháng độc tố: Nếu được chẩn đoán ban đầu với các bệnh ngộ độc qua thực phẩm hoặc các vết thương, tiêm thuốc kháng độc làm giảm nguy cơ biến chứng. Các thuốc kháng độc tự gắn nó với độc tố mà vẫn còn lưu hành trong máu và giữ nó làm hại dây thần kinh. Các thuốc kháng độc có thể không gắn với độc tố, tuy nhiên, đảo ngược bất cứ thiệt hại thần kinh đã được thực hiện. Thuốc kháng độc không đề nghị cho trường hợp ngộ độc trẻ sơ sinh, vì nó không ảnh hưởng đến các vi trùng gây bệnh trong hệ thống tiêu hóa của bé. Một điều trị được gọi là globulin miễn dịch bệnh ngộ độc được sử dụng để chữa trị cho trẻ sơ sinh. ● Hỗ trợ thở: Nếu gặp khó thở, có thể sẽ cần phải có thông khí cơ khí. Các lực thở không khí vào phổi của thông qua một ống đưa vào trong đường thở bằng mũi hoặc miệng. Có thể dùng máy thở cho đến vài tuần khi các tác động của độc tố dần dần giảm bớt . Phục hồi chức năng: Khi khôi phục lại, cũng có thể cần điều trị để cải thiện giọng nói, nuốt và các chức năng khác bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này. Phân lập và nhận dạng Điều kiện nuôi cấy Trong quan điểm của sự đa dạng về trao đổi chất trong các loài trung gian chọn lọc được sử dụng hạn chế trong sự cô lập của các Clostridium botulinum và xác định dựa trên khả năng sản xuất độc tố của các khuẩn lạc điển hình trong nuôi cấy. Clostridium botulinum thường chỉ chiếm một tỷ trọng nhỏ trong tổng số sự phong phú các hệ vi sinh vật hoặc tiền ấp là cần thiết đến hoàn thiện khả năng cô lập. Đôi khi các dịch nuôi cấy được làm nóng trước khi ủ để loại bỏ vi khuẩn kị khí không sinh bào tử. Tuy nhiên, tùy thuộc vào chế độ làm nóng được sử dụng, 800C trong 10 phút thường được dùng, điều này cũng có thể loại bỏ các chủng ít kháng nhiệt của Clostridium botulinum và do đó thường bị bỏ qua. Sau khi làm giàu và tạo chủng C.botulinum trong môi trường nước luộc thịt ở 300C trong 7 ngày ta tiến nuôi cấy ria trên máu ngựa tươi hoặc lòng đỏ trứng có bổ sung agar và ủ yếm khí trong 3 ngày. Tính trạng khuẩn lạc mịn, đường kính 2 đến 3mm với rìa cạnh không đều và thấy hoạt động phân giải lypid trong lòng đỏ trứng trên môi trường thạch (trừ loại G) được chuyển vào môi trường nước, dùng để kiểm tra xem có sản xuất độc tố không. Một kỹ thuật đã được đơn giản hoá bằng cách kết hợp thuốc kháng độc vào môi trường thạch agar để sản xuất chất độc, khuẩn lạc được bao quanh bởi một khu vực của các kháng độc tố và làm kết tủa với độc tố. Thí nghiệm trên chuột Mặc dù sự phát triển của một loạt của các ống nghiệm trong quy trình xét nghiệm miễn dịch đối với độc tố, thì xét nghiệm trung hòa chuột (hình 2), vẫn còn là nhạy cảm nhất (liều gây chết một điển hình của độc tố đối với chuột là một vài picogram). Tuy nhiên, bản chất khó khăn của việc kiểm tra đảm bảo thay thế cuối cùng của nó ngay sau khi hệ thống miễn dịch khuếch đại đã được cải thiện đầy đủ. Hình 3: Thí nghiệm độc tố trên chuột Một mẫu độc tố được chia thành ba phần: phần thứ nhất để phục vụ như là kiểm soát, được đun nóng ở 1000C trong 10 phút để phá hủy bất kỳ loại độc tố trong mẫu, phần thứ hai là xử lý bằng trypsin để kích hoạt bất kỳ các tiền độc tố có thể có và phần thứ ba là không được xử lý. Mỗi phần được tiêm intraperitoneally vào 2 con chuột và quan sát trong 4 ngày để cho việc phát triển các triệu chứng điển hình như khó thở và xuất hiện “thắt lưng ong” đặc trưng. Sự hiện diện của loại độc tố có trong chuột được xác nhận bởi thuốc kháng độc polyvalent và loại độc tố đó có thể được xác định bằng cách sử dụng kháng huyết thanh monovalent. Phương pháp hiện đại ( PCR) Nhu cầu thực tế đưa ra, cần có phương pháp phát hiện nhanh C. botulinum gây ngộ độc hiện diện trong thực phẩm, có thể thay thế cho phương pháp truyền thống. Sự phát triển của lĩnh vực Sinh học phân tử trong những năm qua đã tạo ra nhiều kỹ thuật phát hiện mới, cho phép phát hiện vi sinh vật mục tiêu có trong mẫu thực phẩm hay bệnh phẩm. Trong đó kỹ thuật PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong các quy trình phân tích vi sinh. ( PCR machine) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao của khuân này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi(primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Phương pháp này cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Đây là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của 1 gen của một đối tượng vi sinh vật với độ chính xác cao. Nguyên tắc của phương pháp này là: Một cặp mồi thoái hóa được chọn để khuếch đại đặc hiệu một đoạn DNA 260-bp từ Clostridium botulinum loại A, B, E, F, và G, và năm mẫu dò riêng lẻ đã cho phép xác định mỗi toxinotype bởi sự lai của các sản phẩm PCR. 72 chủng của các loài Clostridium khác nhau được thử nghiệm và 11 loài vi khuẩn khác thường được tìm thấy trong các mẫu thực phẩm đã cho một sản phẩm khuếch đại. Xét nghiệm này đã có thể phát hiện 1 Clostridium botulinum loại A hoặc B và 10 chủng Clostridium botulinum loại E cho mỗi phản ứng. Với 184 mẫu thực phẩm bị ô nhiễm nhân tạo, sau một bước làm giàu 18h, độ nhạy là 10 vi khuẩn/g mẫu và tương đương với các BioAssay chuột đạt 95,6%. Quy trình: Nhằm khảo sát khả năng nhân bản sao gen BoNT bằng các cặp mổi CBML trong phản ứng PCR phát hiện C.btulinum, ta tiến hành các thí nghiệm sau: TN1: Thực hiện các phản ứng PCR phát hiện riêng từng chủng C.btulinum nhóm A, B, E, F bằng từng cặp mồi CBMLA, CBMLB, CBMLE, CBMLF với DNA bản mẫu tương ứng. TN2: Thực hiện các phản ứng PCR phát hiện riêng từng chủng C.btulinum nhóm A, B, E, F bằng từng cặp mồi CBMLA, CBMLB, CBMLE, CBMLF nhưng với hỗn hợp DNA của bốn chủng C.botulinum nhóm A, B, E và F. TN1 và TN2 ta đều thu được sản phẩm PCR: sản phẩm có kích thước một trong bốn sản phẩm sau: Sản phẩm có kích thước 782 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLA). Sản phẩm có kích thước 205 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLB). Sản phẩm có kích thước 389 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLE). Sản phẩm có kích thước 543 bp (đối với trường hợp sử dụng cặp mồi CBMLF). Kết quả được trình bày ở Bảng dưới đây: Nhóm Mồi Trình tự từ 5’ – 3’ Độ dài sản phẩm PCR (bp) A CBMLA1 AGCTACGGAGGCAGCTATGTT 782 CBMLA2 CGTATTTGGAAAGCTAGGAAGG B CBMLB1 CAGGAGAAGTGGAGCGAAAA 205 CBMLB2 CTTGCGCCTTTGTTTTCTTG E CBMLE1 CCAAGATTTTCATCCGCCTA 389 CBMLE2 GCTATTGATCCAAAACGGGA F CBMLF1 CGGCTTCATTAGAGAACGGA 543 CBMLF2 TAACTCCCCTAGCCCCGTAT Điện di gel agarose 1,5%, xem kết quả điện di trên đèn UV. Nếu giếng mẫu phân tích có 1 trong các vạch sau đây thì kết luận mẫu bị nhiễm C.botulinum tương ứng: + Sản phẩm có kích thước 782 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum A; + Sản phẩm có kích thước 205 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum B; + Sản phẩm có kích thước 389 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum E; + Sản phẩm có kích thước 543 bp: mẫu bị nhiễm C.botulinum F. ● Ưu điểm của phương pháp PCR: - Thời gian cho kết quả nhanh - Hóa chất sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn, không cần dụng cụ chuẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường - Ít tốn kém về mặt nhân sự ● Nhược điểm: - Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết. Clostridium botulinum liên quan đến thực phẩm Khả năng nhiễm Clostridium botulinum của thực phẩm Khi nhiễm vào thực phẩm, nếu gặp điều kiện thích hợp về nhiệt độ, độ pH, hàm lượng nước C.botulinum sẽ sinh trưởng, phát triển bằng cách sử dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn và phong phú trong thực phẩm, phân giải các cao phân tử gồm protein, lipid, saccharose sinh khí hoặc tạo mùi ôi khó chịu…và tiến hành sản sinh độc tố botulin. Bốn đặc điểm chung có thể nhận thấy trong sự bùng phát của bệnh ngộ độc thực phẩm là: Các món ăn đã bị nhiễm các bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn Clostridium botulinum từ đầu hoặc do trong quá trình chế biến. Thực phẩm đã bị phân hủy một phần do các vi dinh vật cạnh tranh , vi vậy trong điều kiện thường cũng nên kiểm soát C.botulinum. Thực phẩm là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật như nhiệt độ, hoạt độ của nước, pH, dinh dưỡng… Các thực phẩm được bảo quản lạnh hoặc sau khi xử lý nhiệt nhẹ không đủ để vô hiệu hóa độc tố. Ở môi trường acid thấp của sản phẩm đồ hộp, đây là môi trường đáp ứng đầy đử các tiêu chí trên, vì vậy trong việc sản xuất đồ hộp công nghiệp thì quá trình kiểm soát nghiêm ngặt là hết sức cần thiết. Khi sản phẩm đồ hộp được sản xuất theo quy mô nhỏ hộ gia định thì quá trình kiểm tra nghiêm ngặt trong việc phát hiện và loại bỏ những mầm bệnh gây độc tố là chưa phổ biến. Ở Mỹ, tại những nơi sản xuất nhỏ lẽ như hộ gia đình thì cách xử lý thực phẩm chưa đúng cách, đặc biệt là các sản phẩm từ rau là nguyên nhân của những ca ngộ độc thịt. Giữa năm 1899 – 1991 đã có 522 vụ liên quan đến ngộ độc do các sản phẩm đồ hộp gia đình gây ra, điều quan tâm ở đây là có 432 vụ liên quan đến rau. Điều này cũng được so sánh với 55 vụ ngộ độc do các sản phẩm thương mại đồ hộp gây ra trước giai đoạn 1925. Một loạt các loại thực phẩm có liên quan đến ngộ độc tại Vương quốc Anh mà nguyên nhân chính là do sản phẩm đồ hộp của các hộ sản xuất quy mô nhỏ. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp so với một số báo cáo ở một số nước châu Âu. Cá có thể bị nhiễm độc do Clostridium botulinum, ngộ độc là do độc tố loại E, và môi trường nước và các sản phẩm từ cá tươi là nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc do độc tố loại E. vì vậy chúng ta có thể kiểm soát sự phát triển của Clostridium botulinu bằng các biện pháp nhờ vào sự ức chế của muối, hun khói, gia nhiệt bằng phương pháp sấy để có thể ngăn chặn và tiêu diệt chúng. Với sự phát triển của công nghệ lạnh, thực phẩm hun khói và ướp muối đã được giảm bớt và thay vào đó là sự ưa thích của người tiêu dùng dành cho những sản phẩm có một chút hương vị đặc trưng. Trong những năm 1960, hai vụ ngộ độc lớn đã xảy ra ở bắc Mỹ do độc thịt loại E gây ra, mà nguyên nhân là do sản phẩm cá hun khói được bao gói bởi những bao bì hút chân không. Vụ ngộ độc này đã có sức lan tỏa khá lớn, Canada đã quyết định cấm nhập khẩu các sản phẩm từ cá hun khói. Năm 1970, một vụ ngộ độc cũng đã xảy ra tương tự ở Đức mà nguyên nhân là do cá hồi hun khói tại một trang trại cá. Bảng: Ngộ độc thực phẩm ở Vương quốc Anh. Năm Số người chết/vụ Loại thực phẩm (Sản xuất tại nhà) Độc tố tìm thấy 1922 8/8 Pate vịt (No) A 1932 1/2 Nước luộc thỏ và chim bồ câu (Yes) ? 1934 0/1 Thỏ hầm nồi đất (Yes) ? 1935 4?/5? Món chay hạt bắp (Yes) A 193