Tính chất Peroxydaza của phức Mn2 + - Histidin

ãa ph©n tö H2O2 ®· ®−îc nghiªn cøu vµ øng dông [15]. H×nh 1.4: Ho¹t hãa ph©n tö H2O2 b»ng phøc chÊt hai nh©n [LnM2 z+] ChÝnh c¬ chÕ ho¹t hãa nãi trªn ®−îc thùc hiÖn bëi c¸c chÊt xóc t¸c men (catalaza, peroxydaza) cã t©m ho¹t ®éng lµ phøc chÊt hai nh©n thuËn lîi vÒ mÆt kh«ng gian cho sù ®Þnh h−íng phèi trÝ cña ph©n tö H2O2 vµ sù t¸c ®éng ®Õn liªn kÕt O-O cña nã. D−íi t¸c dông xóc t¸c cña c¸c phøc, ph©n tö H2O2 ®−îc ho¹t hãa dÔ dµng ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é vµ ¸p suÊt b×nh th−êng, kÕt qu¶ lµ t¹o ra c¸c s¶n phÈm trung gian ®ã lµ c¸c tiÓu ph©n ho¹t ®éng O•H, O•2-, HO • 2 cã kh¶ n¨ng oxy ho¸ rÊt m¹nh nhiÒu hîp chÊt. Theo [37], nÕu sù ph©n huû H2O2 diÔn ra trong néi cÇu víi sù vËn chuyÓn 2 electron trong mét giai ®o¹n th× s¶n phÈm s¬ cÊp sÏ lµ O2( 1Δg) hoÆc phøc chÊt cña nã víi ion kim lo¹i. V× vËy, trong c¸c hÖ xóc t¸c men còng nh− trong c¸c hÖ xóc t¸c hãa häc nãi trªn, ®iÒu kiÖn cÇn ®Ó H2O2 ®−îc ho¹t hãa lµ sù t¹o thµnh c¸c phøc chÊt trung gian ho¹t ®éng [LnM2 z+H2O2], [LnM2 z+HO2 -] hoÆc [LnM2 z+O2 2-], trong ®ã H2O2, HO2 - hoÆc O2 2- cã ®Þnh h−íng thÝch hîp vµ liªn kÕt phèi trÝ víi hai +zM X Mz + Y dxy O * P 41 ion Mz+ trong néi cÇu cña phøc chÊt xóc t¸c LnM2 z+, chuÈn bÞ ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù trao ®æi, vËn chuyÓn 2 electron trong mét giai ®o¹n phï hîp víi c¬ chÕ ho¹t hãa H2O2 b»ng phøc chÊt hai nh©n (h×nh 1.4). NÕu phøc chÊt trung gian ®ã t−¬ng t¸c víi ph©n tö substrate S (thay v× ph©n tö H2O2 thø hai) th× trong hÖ sÏ diÔn ra qu¸ tr×nh peroxydaza ®−îc m« t¶ b»ng ph¶n øng tæng céng (1.19). §Æc biÖt nÕu cã sù phèi trÝ ®ång thêi cña c¸c ph©n tö H2O2 vµ S víi LnM2 z+ th× sÏ dÉn ®Õn sù t¹o thµnh phøc chÊt trung gian ho¹t ®éng [LnM2 z+H2O2SL], trong ®ã c¸c ph©n tö H2O2 vµ S cïng ®−îc ho¹t ho¸ víi sù trao ®æi, vËn chuyÓn 2 electron ®ång bé trong mét giai ®o¹n gi÷a c¸c chÊt ph¶n øng H2O2 vµ S qua hai ion M z+ cña phøc chÊt xóc t¸c LnM2 z+. ChÝnh v× vËy mµ qu¸ tr×nh peroxydaza diÔn ra trong cÇu phèi trÝ ë ®iÒu kiÖn mÒm víi tèc ®é vµ ®é chän läc cao theo c¬ chÕ ph©n tö: S¬ ®å c¬ chÕ 1.11 1. [LnM2 z+] + H2O2 + S → [LnM2z+H2O2S] 2. [LnM2 z+H2O2S] → [LnM2 z+] + P + 2OH- 1.5. Mét sè nhËn xÐt tæng quan Tõ c¸c tµi liÖu tæng quan ®· xÐt, cã thÓ rót ra c¸c kÕt luËn sau ®©y: 1 - §a sè c¸c kim lo¹i khi t¹o phøc víi c¸c ligan thÝch hîp sÏ t¹o thµnh phøc chÊt xóc t¸c cho c¸c ph¶n øng ®ång thÓ. Kim lo¹i chuyÓn tiÕp tån t¹i d−íi d¹ng phøc chÊt cã ho¹t tÝnh xóc t¸c cao h¬n h¼n khi nã tån t¹i d−íi d¹ng ion trong dung dÞch. 2 - Xóc t¸c ®ång thÓ b»ng phøc chÊt, ®Æc biÖt lµ phøc ®a nh©n cã liªn quan mËt thiÕt ®Õn c¸c qu¸ tr×nh trong giíi h÷u sinh, trong s¶n xuÊt c«ng nghiÖp, ®êi sèng do ®ã ngµy cµng ®−îc quan t©m vµ ph¸t triÓn m¹nh mÏ. 2e 2e 42 3 - Trong hÖ xóc t¸c oxy ho¸ - khö, MZ+ - L - H2O2 - S (Sr, Sl) tïy thuéc vµo c¸c yÕu tè kh¸c nhau nh− b¶n chÊt cña ligan, chÊt ph¶n øng, thµnh phÇn vµ ®é bÒn cña phøc xóc t¸c, phøc trung gian, thÕ oxy ho¸ - khö cña c¸c d¹ng ion, t−¬ng quan nång ®é gi÷a c¸c chÊt trong hÖ, pH cña dung dÞch vµ cã thÓ lµ c¶ c¸c yÕu tè tù nhiªn: oxy kh«ng khÝ hoµ tan, ¸nh s¸ng mÆt trêi (hν) mµ c¸c qu¸ tr×nh trong hÖ xóc t¸c cã thÓ diÔn ra rÊt phøc t¹p, ®a d¹ng theo c¸c c¬ chÕ kh¸c nhau. 4 - Ph¶n øng oxy ho¸ b»ng H2O2 hay O2 d−íi t¸c dông ho¹t hãa cña phøc chÊt víi môc ®Ých gi¶m thiÓu chÊt ®éc h¹i trong c¸c qu¸ tr×nh c«ng nghÖ ®ang ®−îc xem lµ c¸ch lùa chän ®¸ng tin cËy trong chiÕn l−îc b¶o vÖ m«i tr−êng. 5 - Trong sè c¸c nguyªn tè chuyÓn tiÕp 3d th× phøc chÊt cña s¾t ®· ®−îc nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu mét c¸ch hÖ thèng vµ cã kÕt qu¶. Trong khi ®ã, c¸c sè liÖu vÒ tÝnh chÊt xóc t¸c cña Mn2+ vµ hîp chÊt cña nã ®èi víi c¸c ph¶n øng oxy ho¸ khö ch−a nhiÒu. Mangan lµ nguyªn tè chøa trong thµnh phÇn cña nhiÒu xóc t¸c enzym, lµ thµnh phÇn vi l−îng trong nhiÒu lo¹i vËt liÖu, hãa häc vÒ mangan rÊt phøc t¹p v× kh¶ n¨ng biÕn ®æi sè oxy ho¸ trong mét kho¶ng riªng ë nh÷ng ®iÒu kiÖn hÕt søc kh¸c nhau, b¶n chÊt chuyÓn hãa cña mangan trong c¸c xóc t¸c phøc ch−a ®−îc nghiªn cøu s©u s¾c. Gi¶i quyÕt ®−îc nh÷ng vÊn ®Ò trªn sÏ cã ý nghÜa quan träng ®èi víi viÖc gãp phÇn x©y dùng lý thuyÕt xóc t¸c ®ång thÓ, còng nh− gãp phÇn gi¶i quyÕt nhiÒu môc ®Ých thùc tÕ kh¸c. Trªn c¬ së nh− vËy, trong khu«n khæ cña luËn v¨n, chóng t«i nghiªn cøu c¸c quy luËt ®éng häc xóc t¸c cña phøc Mn(II) - Histidin ®èi víi ph¶n øng oxy hãa Indigocamin b»ng H2O2 trong dung dÞch ®Öm H3BO3. 43 Ch−¬ng 2 C¬ së thùc nghiÖm vμ c¸c ph−¬ng ph¸p Nghiªn cøu 2.1. C¸c hÖ xóc t¸c ®−îc chän ®Ó nghiªn cøu. Nh− ®· tr×nh bµy trong phÇn tæng quan, ®Ó ®¹t ®−îc c¸c môc ®Ých nghiªn cøu chóng t«i chän c¸c hÖ xóc t¸c: HÖ 1: H2O - Mn 2+ - His - H3BO3 - Ind - H2O2 HÖ 2: H2O - Mn 2+ - His - H3BO3 - Ind - In- H2O2 (Víi In lµ chÊt øc chÕ a xÝt Ascorbic (Ac), hydroquinon (Hq), paranitrozo - - dimetylanilin (Pa)). Ion kim lo¹i t¹o phøc Mn2+ Mn2+ cã cÊu tróc vá electron lµ 1s22s22p63s23p63d54s0 3s2 3p6 3d5 4s0 Mn lµ nguyªn tè chuyÓn tiÕp cã líp ®iÖn tö d ch−a b·o hßa (3d5), b¸n kÝnh ion Mn2+ lµ 0,9 A0 (b¸n kÝnh nguyªn tö lµ 1,366 A0) víi thÕ khö chuÈn cña cÆp Mn2+/Mn lµ -1,18 V. Ion Mn2+ ®−îc chän lµm ion t¹o phøc v× Mn2+ cã thÓ t¹o phøc chÊt theo kiÓu t©m ho¹t ®éng cña c¸c chÊt xóc t¸c men [30]. Do ®ã cã thÓ dù ®o¸n r»ng phøc chÊt nh©n t¹o gi÷a ion Mn2+ víi ligan vµ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp sÏ lµ phøc chÊt xóc t¸c - kiÓu t©m ho¹t ®éng nh− chÊt xóc t¸c men trong hÖ ®· chän. ion Mn2+ cã thÓ thay ®æi sè oxy ho¸ mét c¸ch thuËn lîi t−¬ng øng víi c¬ chÕ vËn chuyÓn mét hay nhiÒu electron trong mét giai ®o¹n trong c¸c ph¶n øng xóc t¸c oxy ho¸ - khö [44]. Trong dung dÞch ion Mn2+ cã kh¶ n¨ng t¹o nªn nhiÒu phøc chÊt víi c¸c h»ng sè bÒn kh¸c nhau: Kb = 5,16.10 8 víi phøc 44 [MnHL]+ [3]; Kb = 1.10 3,4 víi phøc [MnHis]2+ vµ Kb = 1.10 2,4 ®èi víi phøc [Mn(His)2] 2+ [13], nh−ng h»ng sè bÒn cña nh÷ng phøc chÊt ®ã kh«ng cao h¬n so víi h»ng sè bÒn cña phøc chÊt c¸c kim lo¹i hãa trÞ 2 nh− Fe2+, Co2+, Ni2+ vµ Cu2+ do b¸n kÝnh ion Mn2+ lín nhÊt trong c¸c kim lo¹i kÓ trªn vµ n¨ng l−îng lµm bÒn bëi tr−êng tinh thÓ cña c¸c phøc chÊt cña Mn2+ ®Òu b»ng kh«ng [9]. Ligan lµ Histidin Histidin ®−îc ký hiÖu lµ His lµ amin axÝt, cã kh¶ n¨ng t¹o phøc chÊt víi c¸c ion nh−: Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, . CÊu t¹o ph©n tö, ®Æc ®iÓm vµ tÝnh chÊt cña His nh− sau: - C«ng thøc cÊu t¹o: N C CH2 CH COOH CH CH NH2 NH - §Æc ®iÓm vµ tÝnh chÊt cña His [33]: Chøa nit¬, o xy: − NH3+; = NH+; − COOH pK: 9,68; 6,97; 2,28 3 chøc (pH>5): − NH2; = N; − COOH 2 Chøc (pH<5): = N; − COOH ChÊt oxy ho¸ H2O2 Trong c¸c hÖ ®· cho th× H2O2 lµ chÊt oxy ho¸ tèi −u v× c¸c nguyªn nh©n sau ®©y: [25], [40]. Ph¶n øng oxy hãa c¸c substrate (S) b»ng H2O2 d−íi t¸c dông cña phøc chÊt - xóc t¸c cña c¸c ion kim lo¹i chuyÓn tiÕp lµ m« h×nh thÝch hîp nhÊt cho 45 viÖc nghiªn cøu thiÕt lËp quy luËt ®éng häc vµ c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh xóc t¸c ®ång thÓ oxy ho¸ - khö. [15]. D−íi t¸c dông ho¹t hãa cña c¸c phøc chÊt - xóc t¸c, H2O2 sÏ trë thµnh chÊt oxy ho¸ m¹nh - nguån ph¸t sinh gèc tù do O•H vµ O2(1Δg) thuÇn khiÕt vÒ mÆt sinh th¸i häc, cã thÓ tham gia t−¬ng t¸c, chuyÓn hãa hãa häc nhiÒu lo¹i hîp chÊt, c¬ b¶n kh¸c nhau (ankan, anken, ankin, phenol, r−îu, axÝt, SO2, CO, NO, H2S,) trong c¸c qu¸ tr×nh tæng hîp h÷u c¬, chÕ biÕn c¸c s¶n phÈm dÇu khÝ, polime hãa, ph©n huû c¸c chÊt ®éc h¹i trong xö lý c¸c chÊt th¶i c«ng nghiÖp, b¶o vÖ m«i tr−êng Dïng H2O2 thuËn tiÖn cho viÖc theo dâi tèc ®é qu¸ tr×nh xóc t¸c oxy ho¸ - khö b»ng c¸ch ®o thÓ tÝch O2 tho¸t ra (qu¸ tr×nh catalaza) hoÆc sù thay ®æi mËt ®é quang cña substrate S mang mµu víi qu¸ tr×nh peroxydaza. ChÊt ®Öm H3BO3 AxÝt boric (axÝt orthoboric) lµ axÝt mét nÊc vµ rÊt yÕu, yÕu h¬n axÝt cacbonic [8]. H3BO3 + H2O [B(OH)4] − + H+ K=10−9 §é tan cña axÝt boric lµ 5 [6], dung dÞch ®Öm borat lµ muèi cña axÝt boric. ChØ borat kim lo¹i kiÒm míi tan trong n−íc cßn c¸c borat kh¸c ®Òu khã tan trong n−íc. Borac (Na2B4O7.10H2O) lµ muèi borat, khi tan trong n−íc, borac bÞ thuû ph©n Na2B4O7 + 7H2O 4H3BO3 + 2NaOH nªn dung dÞch cña borac cã ph¶n øng kiÒm m¹nh vµ cã thÓ chuÈn ®é ®−îc b»ng axÝt clohidric víi chÊt chØ thÞ lµ metyl da cam. Bëi vËy trong hãa häc ph©n tÝch ng−êi ta th−êng dïng borac tinh khiÕt ®Ó pha lo·ng dung dÞch ®Öm. Khi chän ®−îc nång ®é dung dÞch ®Öm tèi −u cho tÊt c¶ c¸c thÝ nghiÖm th× cã thÓ duy tr× ®−îc pH cña dung dÞch kh«ng ®æi cho ®Õn cuèi ph¶n øng. 46 MÆt kh¸c sù cã mÆt H3BO3 trong kho¶ng nång ®é thÝch hîp cã thÓ hç trî xóc t¸c gióp cho ph¶n øng x¶y ra nhanh h¬n. V× H3BO3 t¹o liªn kÕt hydro víi H2O2 thµnh phøc chÊt peroxoborat [(H2O2B(OH)3)] hç trî phøc chÊt xóc t¸c [13] . C¬ chÊt Indigocamin (Ind) Indigocamin lµ chÊt bÞ oxy hãa vµ ®ång thêi lµ chÊt chØ thÞ cña ph¶n øng xóc t¸c. Indigocamin lµ chÊt t¹o phøc yÕu (pK<3), sù cã mÆt cña nã kh«ng lµm thay ®æi ®¸ng kÓ thÕ oxy hãa - khö cña phøc chÊt [25], [26]. CÊu t¹o cña Ind (Indigocarmin -5, 5'- disunfonat Natri) B¶ng 2.1: Mét sè tÝnh chÊt ®Æc tr−ng cña Ind [13] ϕ (v) 2 •+HOIndk (L.M-1S-1) HOIndk •+ (L.M-1S-1) λmax (nm) εmax (L.M-1S-1) - 0,125 8,5.103 17,8.109 612 1,02.104 2.2. C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Nghiªn cøu toµn diÖn, ®ång bé c¶ ba vÊn ®Ò nhiÖt ®éng häc t¹o phøc, ®éng häc vµ c¬ chÕ cña c¸c qu¸ tr×nh xóc t¸c diÔn ra trong c¸c hÖ kÓ trªn ®ßi hái ph¶i øng dông cã chän läc vµ phèi hîp c¸c ph−¬ng ph¸p hãa - lý vµ vËt lý thÝch hîp víi ®iÒu kiÖn xóc t¸c, tÝnh ®Æc thï vµ néi dung cña mçi vÊn ®Ò ®−îc nghiªn cøu. Nh− ®· tr×nh bµy ë phÇn tæng quan, c¬ chÕ cña c¸c qu¸ tr×nh xóc t¸c ®ång thÓ oxy ho¸ - khö lµ rÊt phøc t¹p, ®a d¹ng vµ phô thuéc vµo nhiÒu CC NH C NH C NaO3S O SO3Na 47 yÕu tè ¶nh h−ëng kh¸c nhau. V× vËy, ®Ó thiÕt lËp c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh diÔn ra trong hÖ xóc t¸c ®· ®−îc chän, ta cÇn nghiªn cøu: - VÒ mÆt ®Þnh tÝnh (c¬ chÕ nguyªn t¾c): x¸c ®Þnh, chøng minh c¸c d¹ng phøc chÊt ®ãng vai trß chÊt xóc t¸c (phøc chÊt ®¬n nh©n, ®a nh©n, phøc chÊt b·o hoµ hay ch−a b·o hoµ phèi trÝ, cÊu t¹o thµnh phÇn, nång ®é cña chóng), c¸c tiÓu ph©n trung gian ( phøc trung gian ho¹t ®éng vµ kh«ng ho¹t ®éng, c¸c gèc tù do O•H, HO•2), c¬ chÕ vËn chuyÓn electron (mét hay nhiÒu electron, néi hay ngo¹i cÇu phèi trÝ). - VÒ mÆt ®Þnh l−îng: ®ßi hái ph¶i biÕt ®−îc h»ng sè t−¬ng t¸c cña c¸c tiÓu ph©n trung gian ho¹t ®éng, trong ®ã cã c¸c gèc tù do O•H, HO•2(O • 2 - ) víi c¸c chÊt trong hÖ. V× vËy, c¸c vÊn ®Ò víi c¸c néi dung trªn ®−îc gi¶i quyÕt trong luËn v¨n nµy b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p sau ®©y: - Ph−¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô electron ph©n tö [5]. - Ph−¬ng ph¸p ®éng häc: cho phÐp x¸c ®Þnh c¸c biÓu thøc ®éng häc tèc ®é ph¶n øng xóc t¸c, sù t¹o thµnh phøc chÊt - xóc t¸c ®¬n nh©n hoÆc ®a nh©n (dùa trªn c¬ së bËc ph¶n øng theo nång ®é cña ion kim lo¹i t¹o phøc) [10], [31], x¸c ®Þnh bËc ph¶n øng, tõ ®ã x¸c ®Þnh ®−îc quy luËt ®éng häc vµ ®iÒu kiÖn tèi −u cho qu¸ tr×nh xóc t¸c. - Ph−¬ng ph¸p sö dông c¸c chÊt øc chÕ vµ ph−¬ng ph¸p c¸c chÊt c¹nh tranh [6], [10], [40] ph¸t hiÖn, chøng minh sù ph¸t sinh (hoÆc kh«ng ph¸t sinh) c¸c gèc tù do O•H, HO•2(O • 2 - )thø tù ph¸t sinh tr−íc, sau, ë giai ®o¹n nµo cña mçi lo¹i gèc ®ã vµ x¸c ®Þnh vÒ mÆt ®Þnh l−îng kh¶ n¨ng ph¶n øng cña chóng. §Ó ph¸t hiÖn sù tån t¹i cña c¸c gèc tù do xóc t¸c ®ång thÓ oxy ho¸ - khö b»ng phøc chÊt, ng−êi ta cã thÓ sö dông ph−¬ng ph¸p céng h−ëng tõ electron, thÝ dô víi nång ®é [O•H] ≥ 10-7 mol/l; [HO•2] hoÆc [O•2-] ≥ 10-6 mol/l; nh−ng víi ®iÒu kiÖn diÔn ra c¸c qu¸ tr×nh catalaza vµ peroxydaza [O•H] ≈ 10-12 ÷ 10-10 mol/l; [HO•2] hoÆc [O•2-] ≈ 10-11 ÷ 10-7 mol/l [40], do ®ã ph−¬ng 48 ph¸p céng h−ëng tõ electron bÞ h¹n chÕ. Víi ph−¬ng ph¸p c¸c chÊt øc chÕ vµ ph−¬ng ph¸p c¸c chÊt c¹nh tranh tá ra cã hiÖu qu¶ cao v× kh«ng chØ ph¸t hiÖn mµ cßn x¸c ®Þnh ®Þnh l−îng ®−îc c¸c gèc tù do. C¸c chÊt øc chÕ (In) cã hiÖu qu¶ khi t−¬ng t¸c víi gèc tù do O•H lµ Hydroquinon (Hq), Accorbic (Ac), Paranitrozodimetylanilin (Pa) (b¶ng 2.2) [2]. B¶ng 2.2: TÝnh chÊt ®Æc tr−ng cña mét sè chÊt øc chÕ C¸c chÊt øc chÕ (In) 2 •+HOIndk (L.M-1S-1) (pH = 7) HOIndk •+ (L.M-1S-1) λmax (nm) εmax (L.M-1S-1) Hydroquinon (Hq) C6H4(OH)2 12.109 288 3.103 Ascorbic (Ac) C6H8O6 7,2.10 9 265 Paranitrozodimetylanilin ON - C6H4 - N(CH3)2 18.109 440 3,42.104 Khi cho mét l−îng nhá c¸c chÊt øc chÕ ( 10-5 ÷ 10-4 mol/l) vµo m«i tr−êng ph¶n øng, th× tèc ®é qu¸ tr×nh xóc t¸c bÞ gi¶m ®i (khi chÊt øc chÕ yÕu) hoÆc bÞ k×m h·m hoµn toµn víi sù xuÊt hiÖn chu kú c¶m øng τ (nÕu lµ chÊt øc chÕ m¹nh). Vµo thêi ®iÓm kÕt thóc chu kú c¶m øng, khi chÊt øc chÕ ®¨ ph¶n øng hÕt víi gèc tù do, tèc ®é qu¸ tr×nh xóc t¸c l¹i nhanh chãng ®¹t ®−îc gi¸ trÞ gÇn nh− khi kh«ng cã mÆt chÊt øc chÕ - dÊu hiÖu ®Æc tr−ng cña c¬ chÕ m¹ch - gèc [40]. Ph−¬ng ph¸p c¸c chÊt øc chÕ vµ c¸c chÊt c¹nh tranh rÊt thuËn tiÖn trong viÖc x¸c ®Þnh c¸c h»ng sè tèc ®é giai ®o¹n [31]. Ph−¬ng ph¸p nµy dùa trªn c¸c ph¶n øng c¹nh tranh gi÷a c¸c chÊt S, In, H2O2 giµnh gèc tù do O •H ®Ó t¹o thµnh c¸c s¶n phÈm P1, P2, P3: 49 VÝ dô 7: ®èi víi hÖ H2O - Mn 2+ - His - H3BO3 - In- S - H2O2 cã c¸c ph¶n øng c¹nh tranh gèc tù do O•H nh− sau: S + O•H P1; W1 = k1[S]o[O •H]; )(1 HOSkk •+= (2.1) In + O•H P2; W2 = k2[In]o[O •H]; )(2 HOInkk •+= (2.2) H2O2 + O •H P3; W3 = k3[H2O2]o[O •H]; )(3 22 HOOH kk •+= (2.3) His + O•H P4; W4 = k4[His]0[O •H] )(4 HOHiskk •+= (2.4) Trong ®ã k2, k3, k4 ®· biÕt. Dùa vµo c¸c ph¶n øng (2.2), (2.3) vµ (2.4) thiÕt lËp ®−îc ph−¬ng tr×nh tÝnh k1 nh− sau: O OOO S S HiskOHkInk k aa C ][ ....][][][1 42232 1 +++=Δ ë ®©y SCΔ lµ biÕn thiªn nång ®é cña chÊt c¹nh tranh substrate S khi cã mÆt chÊt øc chÕ In; a lµ hÖ sè kinh nghiÖm, nh− nhau ®èi víi tÊt c¶ c¸c chÊt ®−îc nghiªn cøu trong ®iÒu kiÖn thùc nghiÖm kh«ng ®æi. §Æt bk ay C S ==Δ 1 ;1 vµ xS HiskOHkInk O OOO =++ ][ ....][][][ 42232 Ta cã: bxay += BiÕt k2, k3, k4, [In]O, [H2O2]O, [His]O vµ [S]O nªn x¸c ®Þnh ®−îc h»ng sè tèc ®é k1 b»ng ph−¬ng ph¸p sau ®©y: - Ph−¬ng ph¸p ®å thÞ [10]: Víi nång ®é cho tr−íc cña S vµ H2O2 ë cïng mét thêi ®iÓm cÇn x¸c ®Þnh b»ng thùc nghiÖm c¸c biÕn thiªn SCΔ t−¬ng k1 k2 k2 k3 (2.5) (2.6) 50 øng víi mçi gi¸ trÞ nång ®é cña chÊt øc chÕ [In]O ®−îc cho vµo hÖ xóc t¸c, ta sÏ thu ®−îc c¸c cÆp gi¸ trÞ y vµ x t−¬ng øng. Trªn c¬ së ®ã, x©y dùng ®å thÞ cña ph−¬ng tr×nh ®−êng th¼ng (2.6), tõ ®ã x¸c ®Þnh ®−îc c¸c gi¸ trÞ a vµ b, do ®ã tÝnh ®−îc k1. - Ph−¬ng ph¸p b×nh ph−¬ng bÐ nhÊt [10]: c¸c hÖ sè a vµ b ë ph−¬ng tr×nh (2.6) ®−îc x¸c ®Þnh theo c«ng thøc: )( 22 2 xxn xyxyxa Σ−Σ ΣΣ−ΣΣ= (2.7) 22 )( xxn yxxynb Σ−Σ ΣΣ−Σ= (2.8) Tõ (2.7), (2.8) ta tÝnh ®−îc k1. 2.3. Hãa chÊt, dông cô vμ thiÕt bÞ nghiªn cøu - TÊt c¶ c¸c hãa chÊt ®−îc sö dông trong hÖ xóc t¸c ®¨ ®−îc chän ®Ó nghiªn cøu ®Òu cã ®é s¹ch lo¹i PA. - ChÊt xóc t¸c ®−îc ®iÒu chÕ tõ MnSO4.H2O vµ Histidin. - C¸c dung dÞch nghiªn cøu ®Òu ®−îc pha chÕ b»ng n−íc cÊt hai lÇn, dung dÞch borac ®−îc chuÈn bÞ theo ph−¬ng ph¸p [34]. - §é pH cña c¸c dung dÞch ®−îc kiÓm tra b»ng pH- meter lo¹i Delta-320. - MËt ®é quang (D) trong vïng nh×n thÊy vµ tö ngo¹i ®−îc ®o trªn m¸y ®o quang UV -ViS 752. - M¸y khuÊy tõ M 10. - ThiÕt bÞ æn nhiÖt U-10. HÖ thèng thiÕt bÞ ph¶n øng ®−îc m« t¶ trªn h×nh 2.1. 51 H×nh 2.1: ThiÕt bÞ nghiªn cøu qu¸ tr×nh xóc t¸c 1. M¸y khuÊy tõ 5. Lç n¹p mÉu 2. N−íc tõ m¸y æn nhiÖt ®Õn 6. §iÖn cùc ®o pH 3. Thanh tõ 7. N−íc vÒ m¸y æn nhiÖt 4. Lç n¹p dung dÞch ®iÒu chØnh pH 8. Nót cao su 2.4. Ph−¬ng ph¸p tiÕn hμnh nghiªn cøu c¸c qu¸ tr×nh xóc t¸c ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh trong b×nh ph¶n øng cã cÊu t¹o nh− h×nh 2.1. Nhê cÊu t¹o ®Æc biÖt cña b×nh mµ cã thÓ æn ®Þnh ®−îc nhiÖt ®é ph¶n øng. Khi tiÕn hµnh ®o tèc ®é ph¶n øng, dung dÞch ph¶n øng liªn tôc ®−îc khuÊy b»ng m¸y khuÊy tõ. NhiÖt ®é ph¶n øng æn ®Þnh ë 300 C nhê m¸y ®iÒu nhiÖt cã sai sè ± 0,10 C. KiÓm tra pH cña hçn hîp ph¶n øng trªn m¸y pH - meter v¹n n¨ng cã ®é chÝnh x¸c ®Õn 0,01 ®¬n vÞ. ThÓ tÝch hçn hîp c¸c chÊt tham gia ph¶n øng lµ 30ml. §èi víi qu¸ tr×nh peroxydaza, thùc nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh nh− sau: Cho vµo b×nh ph¶n øng lÇn l−ît c¸c dung dÞch sau: dung dÞch ®Öm borat (thay cho dung m«i lµ n−íc cÊt hai lÇn), ligan Histidin, tiÕp theo cho dung 1 2 3 4 5 6 7 8 Hot plate magnetic stir Made in ChoLon 52 dÞch chøa ion Mn2+, substrate (Ind). KhuÊy ®Òu hçn hîp ph¶n øng, ®iÒu chØnh pH dung dÞch ph¶n øng nhê dung dÞch ®Öm borat. Sau khi æn ®Þnh ®−îc nhiÖt ®é, ®· ®¹t ®−îc gi¸ trÞ pH x¸c ®Þnh, hçn hîp ph¶n øng tiÕp tôc ®−îc khuÊy ®Òu, qua 1-2 phót th× cho dung dÞch H2O2 vµo b×nh, sao cho tæng thÓ tÝch cña hçn hîp ph¶n øng lµ 30ml. Thêi ®iÓm cho H2O2 vµo ®−îc xem lµ mèc b¾t ®Çu cña qu¸ tr×nh oxy hãa Ind trong ph¶n øng xóc t¸c kÌm theo sù mÊt mµu cña Ind. Do ®ã ta cã thÓ theo dâi vµ x¸c ®Þnh tèc ®é Ws cña qu¸ tr×nh xóc t¸c oxy hãa Substrate theo c¸c biÕn thiªn mËt ®é quang ΔD t¹i ®Ønh cùc ®¹i hÊp thô ¸nh s¸ng t−¬ng øng víi c¸c biÕn thiªn thêi gian Δt (s) cña chÊt mµu ®ã (h×nh 2.2). H×nh 2.2: D¹ng tæng qu¸t c¸c ®−êng cong ®éng häc xóc t¸c oxy hãa substrate §Ó x¸c ®Þnh tèc ®é ph¶n øng oxy hãa Ind qua mçi phót sau khi qu¸ tr×nh b¾t ®Çu diÔn ra th× ghi mét gi¸ trÞ ΔD (t−¬ng øng víi Δt) trªn m¸y quang phæ. Trªn c¬ së ®ã tÝnh ®−îc tèc ®é qu¸ tr×nh xóc t¸c oxy hãa Ind (WInd) theo c«ng thøc [31]. ).( .. 11 −−−Δ Δ= SLMW dt DW OS ε (2.9) Trong ®ã: WO lµ tèc ®é ph¶n øng kh«ng cã xóc t¸c (ph¶n øng nÒn), ε(L.M-1cm-1) lµ hÖ sè hÊp thô ph©n tö gam cña dung dÞch Indigocamin (ε = 1,02.104 Δt ΔD t(s) D D0 53 L.M-1cm-1), d(cm) - ®é dµy cuvet. Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i dïng cuvet cã d = 1 cm. Trªn ®−êng cong ®éng häc D = D(t) x¸c ®Þnh ΔD øng víi thêi gian ph¶n øng Δt, thay vµo (2.9) ®Ó tÝnh tèc ®é ph¶n øng WInd. TiÕp theo lËp ®å thÞ phô thuéc cña - lg(WInd) vµo - lgCi (Ci lµ nång ®é ban ®Çu cña chÊt i), cã d¹ng tæng qu¸t bxay += (h×nh 2.3) ®Ó x¸c ®Þnh bËc ph¶n øng ni cña chÊt i [10]: ni = tgα H×nh 2.3: X¸c ®Þnh bËc ph¶n øng theo ph−¬ng ph¸p ®å thÞ V× c¸c hÖ ®−îc nghiªn cøu ®Òu tiÕp xóc trùc tiÕp víi kh«ng khÝ, nªn ®Ó cã kÕt qu¶ chÝnh x¸c ph¶i kiÓm tra vai trß cña oxy kh«ng khÝ hoµ tan ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ tr×nh oxy ho¸ Indigocamin trong c¸c hÖ trªn. - lgCi - lg(WS) α 54 Ch−¬ng 3 KÕt qu¶ vμ th¶o luËn §Ó nghiªn cøu mét c¸ch cã hÖ thèng vµ ®¹t ®−îc môc ®Ých ®· nªu trong phÇn tæng quan chóng t«i lÇn l−ît tiÕn hµnh thùc nghiÖm c¸c hÖ tõ ®¬n gi¶n ®Õn hÖ phøc t¹p. 3.1. Nghiªn cøu sù t¹o phøc xóc t¸c gi÷a Mn2+ vμ His trong hÖ (1): H2O - Mn 2+ - His - H3BO3 - Ind - H2O2 (1) §Ó s¬ bé x¸c ®Þnh chÊt xóc t¸c trong hÖ chóng t«i ®· tiÕn hµnh kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña tõng thµnh phÇn t¹o chÊt xóc t¸c ®Õn tèc ®é ph¶n øng. Thµnh phÇn cña chÊt xóc t¸c bao gåm Mn2+, Histidin vµ c¸c phøc chÊt t¹o thµnh gi÷a Mn2+ vµ Histidin. C¸c thÝ nghiÖm ®o tèc ®é ph¶n øng WInd ®−îc tiÕn hµnh trong c¸c tr−êng hîp cã mÆt tõng chÊt riªng rÏ vµ khi cã mÆt ®ång thêi c¶ Mn2+ vµ His. §éng häc oxy hãa Ind trong hÖ ®· cho phô thuéc vµo sù cã mÆt cña c¸c chÊt ®−îc biÓu diÔn trong b¶ng 3.1 vµ h×nh 3.1. B¶ng 3.1: ¶nh h−ëng thµnh phÇn c¸c chÊt ®Õn tèc ®é ph¶n øng oxy hãa Ind pH = 8,0; to = 30o C Nång ®é c¸c chÊt (M) TT [Mn2+]O [His]O [H2O2]O [Ind]O Tèc ®é WInd.105 (Ml-1ph-1) §Æc ®iÓm cña hÖ 1 0 0 2,0.10-3 1,5.10-4 0 2 2.10-6 0 2,0.10-3 1,5.10-4 0 Cã dung dÞch ®Öm 3 0 10-3 2,0.10-3 1,5.10-4 0 Cã dung dÞch ®Öm 4 2.10-6 10-3 0 1,5.10-4 0 Cã dung dÞch ®Öm 5 2.10-6 10-3 2,0.10-3 1,5.10-4 4,17 6 2.10-6 10-3 2,0.10-3 1,5.10-4 5,57 Cã dung dÞch ®Öm 55 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 30 60 90 120 150 180 H×nh 3.1: C¸c ®−êng cong ®éng häc qu¸ tr×nh oxy ho¸ Ind trong hÖ H2O - Mn 2+ - His - H3BO3 - Ind - H2O2 [Mn2+]O = 2.10 -6 M; [His]0 = 10 -3 M, [H2O2]0=2,0.10 -3 M; [Ind]0 = 1,5.10 -4 M; pH=8,0 (1) H2O - Ind - H2O2 (2) H2O - Mn 2+- H3BO3 - Ind - H2O2 (3) H2O - His - H3BO3 - Ind - H2O2 (4) H2O - Mn 2+ - His - Ind - H3BO3 - O2 (kk) (5) H2O - Mn 2+ - His - Ind - H2O2 (6) H2O - Mn 2+- His - H3BO3 - Ind - H2O2 Dùa vµo kÕt qu¶ biÓu thÞ ë h×nh 3.1 ta thÊy: - §èi víi hÖ (1), (2), (3) vµ (4) qu¸ tr×nh oxy ho¸ Ind kh«ng x¶y ra, c¸c thµnh phÇn cã mÆt trong hÖ kh«ng ph¶i lµ c¸c chÊt xóc t¸c ®èi víi sù oxy ho¸ Ind. Gi÷a c¸c thµnh phÇn cßn l¹i cã thÓ t¹o liªn kÕt hydro, nh−ng còng chØ cã t¸c dông ho¹t hãa phô trî, ch−a cã thÓ g©y ra c¸c biÕn ®æi hãa häc víi sù oxy ho¸ Ind. - §èi víi hÖ (5) khi cã mÆt ®ång thêi c¶ Mn2+ vµ His, qu¸ tr×nh oxy ho¸ Ind diÔn ra víi tèc ®é lín (víi sù gi¶m mËt ®é quang theo thêi gian) lµ do t¸c dông xóc t¸c cña phøc chÊt ®−îc t¹o thµnh gi÷a Mn2+ vµ His. 1, 2, 3, 4 5 6 t(s) DInd 610 56 - Trong hÖ (6) qu¸ tr×nh oxy ho¸ Ind diÔn ra nhanh h¬n so víi trong hÖ (5) lµ do sù cã mÆt cña H3BO3, H2O2 ®−îc ho¹t hãa bæ trî (nhê cã sù t¹o thµnh liªn kÕt hydro gi÷a H2O2 vµ H3BO3). Trªn c¬ së ®ã, cã thÓ x¸c ®Þnh vai trß chÊt xóc t¸c trong hÖ nãi trªn chØ cã thÓ lµ [Mn(His)]2+, [Mn(His)2] 2+ hoÆc lµ phøc hai nh©n [Mn2(His)2] 2+. KÕt qu¶ nghiªn cøu trªn ®©y ®Ó s¬ bé x¸c ®Þnh sù t¹o phøc xóc t¸c gi÷a Mn2+ vµ His hoµn toµn phï hîp víi c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu [11], [13]. Cã rÊt nhiÒu ph−¬ng ph¸p ®Ó nghiªn cøu sù t¹o phøc xóc t¸c. Trong khu«n khæ cña luËn v¨n nµy nh÷ng kÕt luËn vÒ sù t¹o phøc xóc t¸c sÏ ®−îc lµm s¸ng tá vµ kh¼ng ®Þnh ë kÕt qu¶ nghiªn cøu b»ng ph−¬ng ph¸p ®éng häc ë phÇn sau ®©y. 3.2. ®éng häc qu¸ tr×nh xóc t¸c oxy hãa Ind trong hÖ (1) H2O - Mn 2+- His - H3BO3 - Ind - H2O2 (1). §Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÒu kiÖn tèi −u vµ thiÕt lËp quy luËt ®éng häc cña qu¸ tr×nh peroxydaza diÔn ra trong hÖ (1) chóng t«i ®· tiÕn hµnh kh¶o s¸t lÇn l−ît c¸c yÕu tè ¶nh h−ëng: pH, nång ®é ®Çu cña c¸c chÊt [Mn2+]O; [His]O hoÆc tû sè O O Mn His ][ ][ 2+=β ; [H2O2]O vµ [Ind]O. 3.2.1. ¶nh h−ëng cña pH ®Õn ho¹t tÝnh xóc t¸c cña hÖ (1) Thùc nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn: [Mn2+]O = 2.10 -6 M; β = 500; [H2O2]O = 2.10 -3 M; [Ind]O = 1,5.10 -4 M. pH = 7,8; 8,0; 8,2; 8,4; 8,6; 9,0; 9,1; 9,2. KÕt qu¶ nghiªn cøu sù biÕn ®æi mËt ®é quang cña Ind ( IndD610 ) ë mçi gi¸ trÞ pH theo thêi gian ®−îc tr×nh bµy trªn b¶ng 3.2a. B¶ng 3.2a: Sù phô thuéc cña IndD610 vµo pH t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 9,0 9,1 9,2 0 1,250 1,250 1,250 1,250 1,250 1,250 1,250 1,250 t(s) pH 57 15 1,107 1,085 1,077 1,064 1,030 0,998 1,009 1,053 30 0,993 0,966 0,940 0,913 0,860 0,814 0,845 0,889 45 0,987 0,933 0,899 0,860 0,798 0,742 0,774 0,821 60 0,983 0,900 0,868 0,816 0,740 0,690 0,721 0,769 75 0,977 0,877 0,832 0,776 0,689 0,640 0,667 0,718 90 0,972 0,847 0,802 0,736 0,646 0,591 0,615 0,685 105 0,967 0,813 0,771 0,706 0,607 0,548 0,573 0,645 120 0,962 0,791 0,739 0,669 0,568 0,501 0,533 0,615 135 0,956 0,761 0,712 0,643 0,527 0,457 0,486 0,582 150 0,951 0,73 0,681 0,612 0,486 0,413 0,449 0,554 165 0,946 0,709 0,653 0,591 0,454 0,384 0,419 0,529 180 0,941 0,686 0,629 0,572 0,429 0,355 0,394 0,503 Tõ c¸c sè liÖu ë b¶ng 3.2a cã thÓ ®−îc biÓu diÔn b»ng ®å thÞ ë h×nh 3.2a. 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 30 60 90 120 150 180 H×nh 3.2a: Sù phô thuéc cña IndD610 vµo pH t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau pH = 7,8; 8,0; 8,2; 8,4; 8,6; 9,0; 9,1; 9,2 øng víi c¸c ®−êng cong sè 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8. t(s) 1 2 3 8 4 7 5 6 DInd 610 58 Tõ c¸c sè liÖu trªn h×nh 3.2a lÊy Δt = 30s, ¸p dông c«ng thøc (2.9), ta thiÕt lËp ®−îc mèi quan hÖ gi÷a tèc ®é ph¶n øng oxy hãa Ind (WInd ) vµo pH vµ -lgWInd vµo –lg[H+]0. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trªn b¶ng 3.2b vµ h×nh 3.2(b,c). B¶ng 3.2b: Sù phô thuéc cña WInd vµo pH vµ -lgWInd vµo -lg[H+]O pH 7,8 8 8,2 8,4 8,6 9 9,1 9,2 ΔD 0,257 0,284 0,312 0,337 0,39 0,436 0,405 0,361 WInd.105 M.l-1ph-1 5,01 5,57 6,12 6,61 7,64 8,54 7,94 7,08 - lgWInd 4,3 4,25 4,21 4,18 4,12 4,06 4,1 4,15 - lg[H+]O 7,8 8 8,2 8,4 8,6 9 9,1 9,2 4 5 6 7 8 9 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 9,2 9,4 H×nh 3.2b: Sù phô thuéc cña WInd vµo pH (M.l-1ph-1) pH WInd.105 • • • • • • • • 59 4 4,1 4,2 4,3 4,4 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 9,2 9,4 H×nh 3.2c: Sù phô thuéc cña - lgWInd vµo -lg[H+]O C¸c kÕt qu¶ thùc nghiÖm trªn c¸c h×nh 3.2a vµ 3.2b cho thÊy tèc ®é ph¶n øng peroxydaza bÞ ¶nh h−ëng rÊt nhiÒu bëi sù thay ®æi pH. Tõ h×nh 3.2 b ta thÊy hiÖu øng xóc t¸c quan s¸t ®−îc b¾t ®Çu tõ m«i tr−êng kiÒm yÕu trong kho¶ng pH tõ 7,8 ®Õn 9 th× WInd t¨ng theo pH. KÕt qu¶ nµy còng t−¬ng tù nh− khi nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña pH ®Õn WLm trong hÖ H2O – Mn 2+ - Lm – HCO3 - - H2O2, trong vïng pH =7,5 ÷ 9 thuËn lîi cho viÖc oxy hãa Lm [4]. T¹i pH = 9, WInd ®¹t cùc ®¹i. Sau ®ã WInd gi¶m dÇn khi m«i tr−êng trë nªn kiÒm h¬n (khi pH>9). HiÖn t−îng nµy cã thÓ gi¶i thÝch nh− sau: Histidin lµ amin axÝt yÕu, trong dung dÞch nã cã thÓ ph©n ly ra c¸c ion H+ víi c¸c pK1=1,83 t−¬ng øng víi