Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa

Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein. 1. Tủa bằng muối Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel. Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch. Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối: Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu. Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. 2. Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi: ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D) Trong đó S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ Sw: độ hòa tan của protein trong nước D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào Dw: hằng số điện môi của nước R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối A: hằng số khí Công thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.