Tóm tắt Luận án Ảnh hưởng của sử dụng kết hợp thuốc bảo vệ thực vật hoạt chất Chlorpyrifos Ethyl và Fenobucarb đến hoạt tính Enzym Cholinesterase ở cá lóc (Channa Striata)

tên thương mại, trừ tỉnh Tiền Giang có số lượng tên thương mại thấp hơn (Bảng 3.1). Berg (2001) cho thấy vào năm 1999 có 64 loại thuốc BVTV khác nhau được sử dụng trong canh tác lúa ở Cần Thơ và Tiền Giang; trong đó, có 50% là thuốc trừ côn trùng, 25% là thuốc trừ bệnh, 25% là thuốc trừ cỏ. Vào năm 2007 cũng trong vùng nghiên cứu này có 66 loại thuốc BVTV (Berg and Tam, 2012). Theo Pham Van Toan (2011) có hơn 100 tên thuốc thương phẩm với hơn 50 hoạt chất khác nhau được nông dân sử dụng. Bùi Thị Nga và Võ Xuân Hùng (2012) cho thấy có khoảng 27 - 38 hoạt chất với 43 - 75 10 tên thương phẩm thuốc BVTV được sử dụng ở 3 huyện Vị Thủy, Phụng Hiệp và Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang. Kết quả nghiên cứu trong luận án này có sự đa dạng hơn về loại thuốc BVTV được sử dụng so với các nghiên cứu trước đây. Số lượng hoạt chất thuốc BVTV được phép sử dụng trong nông nghiệp tăng theo thời gian. Theo danh mục thuốc BVTV cho phép sử dụng năm 2007 thì có 675 hoạt chất được phép sử dụng nhưng năm 2012 là 1.418 hoạt chất. Mặt khác, trong luận án này cỡ mẫu được phỏng vấn lớn hơn và địa bàn phỏng vấn rộng hơn (4 tỉnh Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và Hậu Giang) nên sự đa dạng về các loại thuốc BVTV được sử dụng có nhiều hơn các nghiên cứu trước đây. Bảng 3.4: Chủng loại thuốc BVTV sử dụng ở các vùng nghiên cứu Tỉnh Nhóm thuốc Long An Tiền Giang Đồng Tháp Hậu Giang TB vùng nghiên cứu Hoạt chất Trừ côn trùng 18 20 20 16 20 Trừ bệnh 13 14 18 9 18 Trừ cỏ 7 7 8 9 9 Trừ ốc 5 2 5 2 5 Trừ chuột 6 5 6 6 6 Điều hòa sinh trưởng 7 6 6 7 7 Tổng 56 54 63 49 65 Tên thƣơng mại Trừ côn trùng 63 55 58 47 101 Trừ bệnh 26 28 31 31 54 Trừ cỏ 11 11 13 24 30 Trừ ốc 13 9 13 6 19 Trừ chuột 5 6 5 4 7 Điều hòa sinh trưởng 14 11 14 18 21 Tổng 132 120 134 130 232 Kết quả khảo sát cho thấy các hoạt chất như Chlorpyrifos ethyl, Pymetrozine, Fenobucarb, Emamectin, Chlorantramiliprole,. được sử dụng với tỷ lệ lần lượt là 14,2%, 13,2%, 12,5%, 8,2% và 6,0%. Thuốc chứa hoạt chất Fenobucarb với các tên thương mại như Abasa, Bassa, Bassa tigi, Dybacide, Bascide, Hopkill, Vibasa và chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl như B52 – USA, Mondeo 60EC, Dragon, Dragon nông,Wavotox được sử dụng phổ biến. Hai loại hoạt chất này thường cũng được phối trộn với nhau để phòng trừ rầy nâu và sâu cuốn lá, nhất là giai đoạn lúa từ 21 – 45 ngày tuổi. Hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb cũng được sử dụng khá phổ biến trong canh tác lúa (Pham Van Toan, 2011; Berg and Tam, 2012). Như vậy, nếu so với các nghiên cứu trước đây thì 2 hoạt chất Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl vẫn còn được sử dụng phổ biến trong canh tác lúa. 11 3.1.2 Tần suất và liều lượng thuốc BVTV sử dụng trong canh tác lúa 3.1.2. 1 Tần suất phun thuốc BVTV trong canh tác lúa Trung bình số lần phun thuốc BVTV ở tỉnh Tiền Giang là cao nhất (7,0±1,1 lần/vụ), kế đến là Hậu Giang 6,9±1,6 lần/vụ, Đồng Tháp 6,0±1,2 lần/vụ và thấp nhất là Long An với 5,3±0,9 lần/vụ. Qua đó cho thấy có sự khác nhau về số lần phun thuốc trong vụ giữa các địa phương. Long An Tieàn Giang Ñoàng Thaùp Haäu Giang TB vuøng NC T aàn s ua át p hu n (l aàn /v uï) 0 2 4 6 8 Tröø saâu beänh Tröø coû Tröø oác Hình 3.1: Tần suất phun các loại thuốc BVTV ở vùng nghiên cứu Berg (2001) cho thấy trung bình số lần phun thuốc ở Tiền Giang năm 1999 là 8,2 lần/vụ. Nghiên cứu của Pham Van Toan (2011) cho thấy ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ, trung bình tần suất phun xịt thuốc BVTV là 8 lần/vụ. Như vậy, kết quả nghiên cứu trong luận án này cho thấy có giảm thấp hơn về tần suất phun so với các nghiên cứu gần đây. 3.1.2. 2 Liều lượng sử dụng và phối trộn thuốc BVTV Kết quả phỏng vấn cho thấy trung bình trong vùng nghiên cứu có 42,7% nông dân phun bằng chỉ dẫn và 53,7% phun cao hơn chỉ dẫn ghi trên nhãn thuốc, rất ít (3,6%) phun thấp hơn chỉ dẫn. Khi phân tích riêng theo từng tỉnh thì tỷ lệ phun thuốc bằng chỉ dẫn ở Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp và Hậu Giang lần lượt là 50%, 16,9%, 38,5% và 76,7%. Trong khi đó tỷ lệ phun thuốc cao hơn chỉ dẫn ở các tỉnh theo thứ tự trên lần lượt là 49,3%, 72,3%, 61,1% và 20% (Bảng 3.2). Sử dụng thuốc BVTV liều cao hơn chỉ dẫn vừa làm hao phí thuốc vừa làm tăng nguy cơ gây độc cho sinh vật trong môi trường. Phun thuốc thấp hơn chỉ dẫn sẽ làm cho sâu bệnh không chết hết và tăng nguy cơ kháng thuốc. Qua nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sử dụng liều cao hơn chỉ dẫn rất cao (20-72,3%) đặc biệt là tỉnh Tiền Giang Bảng 3.2: Liều lượng sử dụng thuốc BVTV ở các vùng nghiên cứu Liều lƣợng phun Long An Tiền Giang Đồng Tháp Hậu giang TB vùng nghiên cứu Ít hơn liều chỉ dẫn 0,7 10,7 0,4 3,3 3,6 Bằng liều chỉ dẫn 50,0 16,9 38,5 76,7 42,7 Cao hơn liều chỉ dẫn 49,3 72,3 61,1 20,0 53,7 12 Qua phỏng vấn cho thấy trung bình các vùng nghiên cứu có đến 88,6% số nông hộ phối trộn các loại thuốc với nhau trước khi phun xịt. Nếu xét theo từng tỉnh, tỷ lệ phối trộn ở các tỉnh Long An, Đồng Tháp, Tiền Giang và Hậu Giang lần lượt đạt 93,3%, 91,9%, 89,3% và 72,7%. Thuốc trừ sâu với các hoạt chất khác nhau thường được phối trộn trước khi phun. Việc phối trộn các loại thuốc BVTV với nhau có thể làm giảm, tăng hay không thay đổi độc tính của thuốc đối với địch hại (Trần Văn Hai, 2005). Nếu các loại thuốc có cơ chế tác động khác nhau thì khi phối trội có thể làm cho nhiều cơ quan, chức năng khác nhau của sinh vật bị ảnh hưởng cùng lúc và khi đó hậu quả sẽ nghiêm trọng hơn. Ngoài ra, nếu các chất khác nhau có hiệu lực gây độc ở các thời gian phơi nhiễm khác nhau thì sẽ làm cho sinh vật bị ảnh hưởng lâu dài vì vừa hết bị tác động của thuốc này lại bắt đầu bị tác động của thuốc khác (Zeliger, 2008). Trong vùng nghiên cứu tỷ lệ người dân phối trộn các loại thuốc BVTV trước khi phun cao trong nghiên cứu này là rất đáng được quan tâm. Tóm lại, kết quả nghiên cứu ở nội dung 1 nhận thấy các thuốc trừ sâu chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb được sử dụng khá phổ biến. Hai hoạt chất này có độ độc cao, cùng cơ chế tác động là gây ức chế hoạt tính ChE ở sinh vật nên được chọn làm các nguồn gây độc trong các thí nghiệm ở nội dung 2 và 3. Nông dân thường phối trộn các thuốc BVTV với nhau (88,6%) nhằm giảm chi phí khi phun và thường phun ở liều lượng bằng (42,7%) hoặc cao hơn (53,7%) liều lượng hướng dẫn ghi trên nhãn thuốc. Đây là cơ sở để thực hiện nội dung 2 và 3 nhằm xem xét, đánh giá tác động riêng lẻ và phối trộn của 2 hoạt chất chất này đến ChE não cá lóc đồng điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng. 3.2 Nội dung 2: Ảnh hƣởng của phối trộn thuốc BVTV Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm 3.2.1 Nhiệt độ, DO, pH trong thí nghiệm Trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc BVTV, nhiệt độ buổi sáng dao động từ 24,8±0,1 0C đến 26,5±0,1 0C và từ 26,9±0,3 0C đến 28,9±0,2 0C vào buổi chiều. Oxy hoà tan (DO) ít khác biệt giữa các nghiệm thức và DO buổi sáng dao động từ 4,0±0,2 - 4,7±0,1 mg/L, có xu hướng cao hơn DO buổi chiều dao động từ 3,7±0,1 - 4,4±0,2 mg/L. Giá trị pH trung bình tuy có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và giữa hai buổi nhưng không quá 0,5 đơn vị, dao động từ 7,4±0,1 đến 7,5±0,1. Sau 96 giờ tiếp xúc với thuốc, cá được cho ra bể composite 600L chứa 100L nước máy (không có thuốc BVTV), có sục khí. Nhiệt độ dao động từ 28,0±0,2 o C - 28,9±0,2 oC vào buổi sáng và 28,2±0,2 oC - 29,6±0,2 oC vào buổi chiều. Hàm lượng DO trong các bể thí nghiệm khi cá ra nước máy cao hơn giai đoạn cá tiếp xúc thuốc BVTV trong 96 giờ do được sục khí, buổi sáng dao động từ 6,3±0,1 - 7,1±0,1 mg/L và buổi chiều dao động từ 6,4±0,2 - 7,1±0,1 mg/L. Giá trị pH buổi sáng dao động từ 6,9±0,1 - 7,2±0,1 và buổi chiều từ 7,0±0,1 - 7,2±0,1. 13 Nhìn chung nhiệt độ, DO và pH trong giai đoạn phơi nhiễm thuốc BVTV và phục hồi ChE trong nước máy đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá. Sự ổn định các yếu tố pH, DO và nhiệt độ giữa các nghiệm thức sẽ làm cho thí nghiệm mang tính đồng nhất cao về mặt môi trường nên tác động đồng đều đến sự ức chế ChE. 3.2.2 Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong bố trí thí nghiệm Kết quả phân tích đều không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện) Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl ở nghiệm thức đối chứng. Ở các nghiệm thức đơn chất, nồng độ sau khi chuẩn bị của Fenobucarb bằng 86,0 – 96,9% nồng độ lý thuyết (NĐLT) và Chlorpyrifos ethyl bằng 77,8 - 119,9% NĐLT. Ở các nghiệm thức hỗn hợp, nồng độ Fenobucarb thực tế đạt từ 96,4 - 109,9% NĐLT; nồng độ Chlorpyrifos ethyl bằng 82,4 - 96,3% NĐLT. Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl sau khi chuẩn bị dao động xung quanh giá trị nồng độ lý thuyết. Mặc dù không đúng như nồng độ lý thuyết nhưng vẫn phù hợp với thiết kế nồng độ tăng theo 1, 2, 5 và 10% LC50-96 giờ của từng loại thuốc đối với cá lóc. Bảng 3.3: Nồng độ Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl trong thí nghiệm Nghiệm thức Nồng độ thuốc BVTV (g/L) Nồng độ lý thuyết khi chuẩn bị Nồng độ thực tế sau khi chuẩn bị Nồng độ thực tế sau 96 giờ ÐC Fenobucarb 0,00 < DLF < DLF Chlorpyrifos ethyl 0,00 < DLChl < DLChl 1% Fenobucarb 36,00 31,20 5,40 2% Fenobucarb 72,00 68,40 11,00 5% Fenobucarb 180,00 175,00 49,90 10% Fenobucarb 360,00 351,60 69,90 1% Chlorpyrifos ethyl 0,27 0,21 < DLChl 2% Chlorpyrifos ethyl 0,54 0,47 0,06 5% Chlorpyrifos ethyl 1,36 1,63 0,14 10% Chlorpyrifos ethyl 2,70 2,48 0,29 1% Hỗn hợp Fenobucarb 36,00 39,90 5,30 Chlorpyrifos ethyl 0,27 0,26 0,04 2% Hỗn hợp Fenobucarb 72,00 76,70 10,00 Chlorpyrifos ethyl 0,54 0,48 0,08 5% Hỗn hợp Fenobucarb 180,00 191,60 59,20 Chlorpyrifos ethyl 1,36 1,12 0,13 10% Hỗn hợp Fenobucarb 360,00 350,11 52,40 Chlorpyrifos ethyl 2,70 2,29 0,46 DLF = 0,3 g/L, DLChl = 0,03 g/L Tại thời điểm 96 giờ sau bố trí, nồng độ Fenobucarb ở nghiệm thức đơn chất giảm từ 71,5 - 83,9% so với nồng độ thực sau khi bố trí. Nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl nồng độ hoạt chất này giảm từ 87,2% - 100%. Ở dạng hỗn hợp, tỷ lệ giảm nồng độ thuốc mạnh hơn, dao động từ 69,1% - 87,0% đối với Fenobucarb và từ 79,9-88,4% đối với Chlorpyrifos ethyl. 14 Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) 0 1 12 24 36 48 60 72 96 T y û l e ä ö ùc c h e á h o a ït tí n h C h o li n e st e ra se ( % ) -20 0 20 40 60 80 100 2% Chlorpyrifos Ethyl 2% Fenobucarb 2% HH (Chlor + Feno) a a a a a b * a a b b ab a a ab b c a b a a b a b ab a a a ** * Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) 0 1 12 24 36 48 60 72 96 T y û l e ä ö ùc c h e á h o a ït tí n h C h o li n e st e ra se ( % ) -20 0 20 40 60 80 100 1% Chlorpyrifos Ethyl 1% Fenobucarb 1% HH (Chlor + Feno) a a a b b a a b a a a a a a a a a ab a a a a a ab a a ab* * * * 3.2.3 Ảnh hưởng của phối trộn hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb đến ChE ở cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả phân tích phương sai cho thấy Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl, thời gian phơi nhiễm có ảnh hưởng đến hoạt tính ChE (p<0,05). Tuy nhiên, sự tương tác giữa Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl thì không có ý (p>0,05) (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Bảng phân tích phương sai xem xét tác động của Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và thời gian phơi nhiễm tác động đến hoạt tính ChE Nguồn tác động SS df MS F P Fenobucarb 663,8 4 165,9 46,5 0,00 Chlorpyrifos ethyl 50,4 4 12,6 3,5 0,01 Thời gian phơi nhiễm 16,0 1 16,0 4,5 0,04 Fenobucarb*Chlorpyrifos ethyl 30,8 4 7,7 2,2 0,07 Fenobucarb*Thời gian phơi nhiễm 310,6 4 77,7 21,7 0,00 Chlorpyrifos ethyl*Thời gian phơi nhiễm 98,4 4 24,6 6,9 0,00 Fenobucarb * Chlorpyrifos ethyl * Thời gian phơi nhiễm 48,8 4 12,2 3,4 0,01 SS: Tổng bình phương, MS: Trung bình bình phương  Ở nồng độ 1% LC50 – 96 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE ở tất cả các thời điểm đều khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05) (Hình 3.2A). (Hình 3.2A) (Hình 3.2B) Hình 3.2: Tỷ lệ ức chế hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE) sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp theo thời gian ở mức nồng độ 1% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2A), 2% LC50 - 96 giờ (Hình 3.2B). Trong cùng thời điểm phơi nhiễm, các số liệu có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test). Trong cùng đường số liệu có dấu * thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng. Ngược lại, tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức Fenobucarb cao nhất trong 96 giờ phơi nhiễm là 16,1% so với đối chứng (p<0,05) ở thời điểm 1 giờ sau khi tiếp xúc. Đây là nồng độ thấp nhất trong thí nghiệm thấy được ảnh hưởng của Fenobucarb đến ChE cá lóc (Hình 3.2A). Ở các thời điểm thu 15 mẫu còn lại, tỷ lệ ức chế ChE đều thấp và khác biệt không có khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05). Tương tự, ở nghiệm thức hỗn hợp thì tỷ lệ ức chế có sự khác biệt so với đối chứng (p<0,05) ở thời điểm 1, 48 và 96 giờ lần lượt là 18,7%, 9,6% và 12,8%.  Ở mức nồng độ 2% LC50 – 96 giờ Ở nồng độ này, Chlorpyrifos ethyl gây ức chế 20% ChE cá lóc (p<0,05) lúc 60 giờ phơi nhiễm (Hình 3.2B). Ở tất cả thời điểm còn lại, tỷ lệ ức chế ChE đều không khác khác biệt so với đối chứng (p>0,05). Ở nghiệm thức Fenobucarb, tỷ lệ ức chế ChE cao nhất là 22,2% so với đối chứng lúc 1 giờ sau phơi nhiễm (p<0,05) nhưng các thời điểm còn lại đều khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05). Tương tự, ở nghiệm thức hỗn hợp thì tỷ lệ ức chế ChE ở 1 giờ và 60 giờ lần lượt là 27,3% và 21,9% (Hình 3.2B). Aprea et al., 2001) cho rằng nếu ChE bị ức chế dưới 30% sẽ không gây hại cho sinh vật. Ở tất cả các nghiệm thức 1% và 2% LC50-96 giờ dù tỷ lệ ức chế có khác biệt so với đối chứng nhưng đều thấp hơn 30%. Qua đó cho thấy nồng độ thấp hơn hoặc bằng 2%LC50-96 giờ của Fenobucarb hay Chlorpyrifos ethyl đều chưa gây ảnh hưởng có hại đến cá lóc. Tuy nhiên có thể sử dụng đo ChE để chỉ cá đã bị phơi nhiễm với thuốc.  Ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ Ở nồng độ 5% LC50 - 96 giờ fenobucarb và chlorpyrifos ethyl gây ức chế ChE cá lóc rõ rệt. Ở nghiệm thức đơn Fenobucarb, tỷ lệ ức chế so với đối chứng ở các thời điểm 1, 12, 24, 36 giờ lần lượt là 46,4%, 50,6%, 36,9% và 30,2% (p<0,05) (Hình 3.3A). Các thời điểm còn lại, ChE giảm và khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05). Ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl thì tỷ lệ ức chế ChE tăng dần theo thời gian và ở các thời điểm 24, 48 và 60 giờ lần lượt đạt 19,4%, 22,2% và 22% so với đối chứng rồi sau đó giảm dần. Ở nghiệm thức hỗn hợp, tỷ lệ ức chế ChE giai đoạn từ 1 – 36 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Fenobucarb nhưng giai đoạn 48 – 96 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl. Cụ thể ở thời điểm 1 giờ, tỷ lệ ức chế ChE đạt cao nhất là 60%, sau đó giảm dần ở các thời điểm 12, 24, 36 giờ, lần lượt đạt 41,0%, 37,1% và 31,6% và đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05, Dunnet test) (Hình 3.3A). Giai đoạn từ 48 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ChE vẫn tiếp tục suy giảm nhưng có xu hướng giống tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE lần lượt ở các thời điểm 48, 60, 72 và 96 giờ lần lượt là 14,8%, 12,8%, -4,2% và 13,4%.  Ở nồng độ 10% LC50 – 96 giờ Đối với nghiệm thức đơn Fenobucarb, tỷ lệ ChE bị ức chế cao nhất ở thời điểm 1 - 12 giờ sau phơi nhiễm và sau đó có khuynh hướng giảm dần theo thời gian. Tỷ lệ ức chế ở các thời điểm 1, 12, 24, 36 và 48 giờ lần lượt 16 Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) 0 1 12 24 36 48 60 72 96 T y û l e ä ö ùc c h e á h o a ït tí n h C h o li n e st e ra se ( % ) -20 0 20 40 60 80 100 5% Chlorpyrifos Ethyl 5% Fenobucarb 5% HH (Chlor + Feno) a b b b a a a a b a a a b b b b a a a ab ab ab a * * * * * * * * * a a a * a Thôøi gian sau khi phôi nhieãm (giôø) 0 1 12 24 36 48 60 72 96 T y û l e ä ö ùc c h e á h o a ït tí n h C h o li n e st e ra se ( % ) -20 0 20 40 60 80 100 10% Chlorpyrifos Ethyl 10% Fenobucarb 10% HH (Chlor + Feno) b a a a b a a a a b a a a a a b b b b a a a a a a a a * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * là 57,8%, 53,8%, 35,8%, 45,6%, 34,9% và khác biệt so với đối chứng (p<0,05); các thời điểm còn lại (60,72 và 96 giờ), tỷ lệ ức chế ChE tiếp tục giảm và không còn khác biệt so với đối chứng (p>0,05). Ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE tăng dần và bắt đầu sai khác so với đối chứng (p<0,05) từ 24 giờ và đạt cao nhất lúc 48 giờ; sau đó giảm dần nhưng vẫn khác biệt so với đối chứng (p<0,05). Cụ thể, ở các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72 và 96 giờ thì tỷ lệ ức chế ChE lần lượt đạt 48,9%, 49,1%, 58,9%, 52,1%, 48,8% và 44,6% (Hình 3.3B). Ở nghiệm thức hỗn hợp, tỷ lệ ức chế ChE giai đoạn từ 1 – 36 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Fenobucarb nhưng giai đoạn 48 – 96 giờ có xu hướng giống sự tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl. Cụ thể ở thời điểm 1, 12, 24 và 36 giờ, tỷ lệ ức chế ChE lần lượt đạt 51,0%, 56,6%, 52,5%, 54,7% và đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05) (Hình 3.3B). Giai đoạn từ 48 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ChE vẫn tiếp tục suy giảm nhưng có xu hướng giống tác động của đơn chất Chlorpyrifos ethyl, tỷ lệ ức chế ChE ở các thời điểm 48, 60, 72 và 96 giờ lần lượt là 53,5%, 44,7%, 43,8% và 41,8% và đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (p<0,05). Như vậy ở nghiệm thức hỗn hợp, ChE bị ức chế kéo dài hơn so với với từng đơn chất. (Hình 3.3A) (Hình 3.3B) Hình 3.3: Tỷ lệ ức chế hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE) sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp theo thời gian ở mức nồng độ 5% LC50 - 96 giờ (Hình 3.3A), 10% LC50 - 96 giờ (Hình 3.3B). Trong cùng thời điểm phơi nhiễm, các số liệu có cùng chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05, Duncan test). Trong cùng đường số liệu có dấu * thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng. Fenobucarb thuộc gốc Carbamate có cơ chế gây ức chế enzyme ChE nhanh nhưng không lâu dài (Stenersen, 2004). Nhóm Alkyl hoặc Aryl của gốc Carbamate sẽ gắn vào nhóm hoạt động Hydroxyl (-OH) của ChE làm cho ChE bị carbamyl hóa không thể thủy phân Acetylcholine để truyền tín hiệu thần kinh (Gupta, 2006). Cơ chế tác động này của nhóm Carbamate xảy ra nhanh dẫn đến thời gian ức chế ChE nhanh trong vài giờ sau khi phơi 17 nhiễm (Williams et al., 2000). Nghiên cứu của Cong et al., (2006) đã cho thấy Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá Lóc cao nhất ở 6 giờ sau khi phơi nhiễm. Trong nghiên cứu này, Fenobucarb gây ức chế ChE ở cá lóc cao trong khoảng 1 – 12 giờ sau phơi nhiễm. Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, trong cấu tạo có gốc P=S (thiono); gốc này không gây ức chế trực tiếp ChE mà khi thâm nhập vào sinh vật sẽ bị chuyển hóa sinh học thành P=O (oxon) mới gây ức chế ChE (Stenerson, 2004). Quá trình chuyển hóa sinh học này diễn ra nhờ hệ thống enzyme cytochrome P450 (Keizer et al., 1991) nên thường hiệu ứng tác động chậm. Trong luận án này cho thấy tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl tăng dần theo thời gian và đạt cao trong khoảng 48 - 60 giờ sau khi phơi nhiễm. Ở nghiệm thức hỗn hợp, hoạt tính ChE ở cá Lóc chịu tác động của cả Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl. Giai đoạn 1 -12 giờ, tỷ lệ ức chế ChE ở nghiệm thức hỗn hợp có xu hướng giống nghiệm thức Fenobucarb (p>0,05) ở tất cả 4 mức nồng độ. Qua đó có thể kết luận, sự ức chế ChE trong thời gian 1-12 giờ đầu phơi nhiễm chủ yếu do Fenobucarb gây nên. Sau đó, tỷ lệ ức chế có xu hướng giống nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl (p>0,05). Kết quả thể hiện rõ ở 2 mức nồng độ 5% và 10% LC50 – 96 giờ. Như vậy, nghiên cứu này đã cho thấy khi hỗn hợp hai hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fenobucarb thì không làm tăng hay giảm giảm tỷ lệ ức chế ChE cá Lóc so với từng đơn chất nhưng thời gian ChE bị ức chế ở mức cao kéo dài hơn thay vì chỉ bị ảnh hưởng của Fenobucarb Chlorpyrifos ethyl. Qua đó cho thấy có thể hỗn hợp Fenobucarb và Chlorpyrifos ethyl lại với nhau mà không làm tăng hay giảm độc tính của từng hoạt chất. 3.2.4 Phục hồi ChE trong nước máy sau khi phơi nhiễm với Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp hai hoạt chất này Như đã trình bày và thảo luận mục 3.2.3, ở cả 2 mức nồng độ 1 và 2% LC50 – 96 giờ, tỷ lệ ức chế ở tất cả các trường hợp sau 96 giờ phơi nhiễm đều không khác biệt so với đối chứng và giữa các nghiệm thức với nhau (Hình 4.5A,B), nghĩa là ChE ở các nghiệm thức đã hoàn toàn phục hồi. Do đó theo dõi phục hồi ChE trong nước máy chỉ thực hiện ở nghiệm thức 5% và 10% LC50 – 96 giờ.  Ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ Trước khi ra môi trường nước máy, hoạt tính ChE ở các nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp lần lượt đạt 88,8%, 101,2% và 86,5% so với đối chứng. Khi cho ra môi trường nước máy, ChE ở tất cả các nghiệm thức đều tăng và khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng (p>0,05) ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày (Hình 3.4A). Như vậy, ở nồng độ 5% LC50 – 96 giờ, ChE đã phục hồi hoàn toàn và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức so với đối chứng. 18  Ở nồng độ 10% LC50 – 96 giờ Hoạt tính ChE ở các nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl, Fenobucarb và hỗn hợp ở thời điểm 96 giờ sau khi phơi nhiễm lần lượt đạt 70,8%, 89,5% và 56,5% so với đối chứng và ở 2 nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp khác biệt so với đối chứng (p<0,05). Sau khi ra môi trường nước máy, hoạt tính ChE ở các nghiệm thức phục hồi dần nhưng tỷ lệ phục hồi kéo dài và ở nghiệm thức đơn Chlorpyrifos ethyl và hỗn hợp; tỷ lệ ức chế vẫn còn khác biệt so với đối chứng sau 7 ngày. Cụ thể, ở nghiệm thức Fenobucarb, hoạt tính ChE ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày sau khi ra môi trường nước máy lần lượt đạt 102,5%, 114,9%, 109,3% và 105,2% so với đối chứng (Hình 3.4B). Như vậy, cá lóc sau khi phơi nhiễm Fenobucarb ở nồng độ 10%LC50 – 96 giờ đã phục hồi hoàn toàn sau 1 ngày cho ra môi trường nước máy. (Hình 3.4A) (Hình 3.4B) Hình 3.4: Hoạt tính ChE (% so với đối chứng) trong não cá lóc đồng (TB ± SE) sau khi phơi nhiễm với Fenobucarb, Chlorpyrifos Ethyl hay kết hợp hai hoạt chất theo thời gian ở mức nồng độ 5% (Hình 3.4A) và 10%LC50 - 96 giờ (Hình 3.4B) được cho ra môi trường nước máy. Trong cùng thời điểm phơi nhiễm, dấu * chỉ khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05; Dunnet test) so với đối chứng. Hoạt tính ChE ở nghiệm thức Chlorpyrifos ethyl ở các thời điểm 1, 3, 5 và 7 ngày sau khi ra môi trường nước máy lần lượt đạt 62,3%, 82,9%, 78,6% và 82,9% so với đối chứng. Ở tất cả các thời điểm, hoạt tính ChE đều thấp hơn so với đối chứng (p<0,05) (Hình 3.4B). Qua đó cho thấy khi phơi nhiễm với Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 10% LC50 - 96 giờ thì ChE khó phục hồi hoàn toàn dù sau 1 tuần sống trong môi trường nước máy. Thuốc BVTV nhóm Carbamate gây chất ức chế ChE không lâu dài, quá trình carbamyl hóa enzyme ChE kết thúc nhanh (Stenersen, 2004). Hơn nữa liên kết ester giữa gốc hoạt động nhóm Carbamate và nhóm Hydroxyl (- OH) của ChE tương đối yếu nên một số ChE có thể được phóng thích từ liên kết với gốc Carbamate để trở thành enzyme ChE bình thường mà không cần trải qua quá trình tổng hợp enzyme ChE mới (Post, 1987). Do đó, enzyme ChE bị ức chế bởi thuốc BVTV gốc Carbamate có khả năng phục hồi nhanh. 0 1 3 5 7 H o a ït tí n h C h E ( % ñ o ái ch ö ùn g ) 0 20 40 60 80 100 120 140 5% Chlorpyrifos ethyl 5% Fenobucarb 5% HH (Chlor + Feno) b Thôøi gian soáng trong moâi tröôøng nöôùc saïch (ngaøy) 0 1 3 5 7 H o a ït tí n h C h E ( % ñ o ái ch ö ùn g ) 0 20 40 60 80 100 120 140 10% Chlorpyrifos ethyl 10% Fenobucarb 10% HH (Chlor + Feno) * * * * Thôøi gian soáng trong moâi tröôøng nöôùc saïch (ngaøy) * * * * * * 19 Trường hợp Chlorpyrifos ethyl có gốc P=S (thiono) không trực tiếp gây ức chế ChE mà cần thời gian để chuyển thành P=O (oxon) còn gọi là Chlorpyrifos-oxon và khi kết hợp với enzyme ChE sẽ tạo thành phức hợp Phosphorylated enzyme và Trychlorpyridinol. Phức hợp Phosphorylated enzyme thủy phân rất chậm để trở thành Diethylphosphate và enzyem ChE như ban đầu và một phần Phosphorylated enzyme tạo liên kết vĩnh viễn giữa Chlorpyrifos-oxon với enzyme ChE và trở nên bất hoạt, không thể phục hồi hay gọi là sự lão hóa (aging) (Timchalk, 2006). Quá trình này xảy ra khi một nhóm hữu cơ trong hợp chất lân hữu cơ