Tóm tắt Luận án Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l.) vùng đồng bằng sông Cửu Long trên đối tượng cá tra

á tra. Toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái vào cuối tháng 2 năm 2016 tại thành phố Cần Thơ. Tên khoa học được TS. Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ giám định và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại đây. 4 2.1.2 Hóa chất và thiết bị  Hóa chất Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254 và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck). Silica gel pha thường và silica gel pha đảo RP-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 (GE Healthcare). Dung môi triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, MeOH được chưng cất lại trước khi sử dụng.  Thiết bị  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AV-600, Bruker BioSpin Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.  Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy: SCIEX X500 QTOF tại Viện Hóa học TPHCM và Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản.  Phổ UV-Vis được đo trên máy Jasco V-730; Độ quay cực được đo trên thiết bị ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy Stuart Scientific SMP3. Các phân tích này đều được thực hiện tại Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô đã nghiền nhỏ của mỗi loại, thực hiện quá trình ngâm dầm trực tiếp 5 trong dung môi ethanol (5 lần × 24 giờ mỗi lần). Dịch chiết ethanol được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết ethanol tổng tương ứng. 2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC). 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc và định danh Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đồng thời kết hợp phân tích, so sánh tài liệu tham khảo. 2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.4.1 Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± 5 gram/con) được chuyển về phòng thí nghiệm từ trại giống ở Vĩnh Long. Cá khi đem về trại thực nghiệm được trữ trong bể composite có sục khí liên tục, cho ăn bằng thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá và thuần hóa hai tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được kiểm tra ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn. Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) thu từ thận và máu ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp của Boyum (1968) và Pierrard et al. (2012). Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng để phân lập tế bào bạch cầu. Tế bào thu được đuợc nuôi trong môi trường L-15 (pH 7.4, 6 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thanh thai bò (fetal bovine serum-FBS, Invitrogen), 1% Hepes 20 mM và 1% kháng sinh streptomycin/penicillin 10 000 UI (Invitrogen) và nuôi ở 28ºC. Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức được bổ sung cao chiết (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung các loại cao chiết tại 2 nồng độ 10 và 100 μg/mL) và 2 nghiệm thức đối chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung DMSO 1%), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết, tiến hành phân tích các chỉ tiêu miễn dịch: xác định hoạt tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể. 2.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử (cao chiết và các chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn) được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn thể hiện qua sự hình thành vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch tạo ra trên đĩa petri và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử và kháng sinh (Vancomycin HCl và Cefixim) được tiến hành đối với năm chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio parahaemolyticus đươc̣ cung cấp từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS•+ đã được chọn sử dụng 7 để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và các chất sạch phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn. Ngoài ra, phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 cũng đã được tiến hành. 2.2.4.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress Thapsigargin (TG) 2 µM được dùng để gây chết tế bào. Tác dụng của các cao chiết hay chất phân lập bảo vệ tế bào khỏi sự chết được đánh giá bằng cách so sánh thống kê tỷ lệ sống của nhóm tế bào được xử lý với TG sau đó xử lý thêm với cao chiết hay chất phân lập so với nhóm chỉ được xử lý với TG. Tỷ lệ sống của tế bào được đánh giá bằng phương pháp so màu dựa trên hoạt tính của enzyme dehydrogenase. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ nông dân nuôi trồng thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật đã được thu hái từ các tỉnh khác nhau của vùng ĐBSCL và được tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra. Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được STT Tên thực vật Tên khoa học của mẫu thực vật Địa điểm thu mẫu Bộ phận nghiên cứu Hiệu suất điều chế cao (%) 1 Dây vác Cayratia trifolia (L.) Domin Sóc Trăng Phần trên mặt đất 7.51 2 Rau sam Portulaca oleracea L. Vĩnh Long Toàn cây 5.73 3 Tỏi Allium sativum L. Cần Thơ Củ 6.87 8 4 Húng quế Ocimum basilicum L. Cần Thơ Phần trên mặt đất 5.15 5 Bình bát nước Annona reticulata L. Sóc Trăng Lá 13.71 6 Cỏ sữa lá lớn Euphorbia hirta L. Cần Thơ Toàn cây 8.38 7 Gừng Zingiber officinale Rosc. Cần Thơ Củ 5.65 8 Rau má Centella asiatica (L.) Urb Hậu Giang Toàn cây 5.41 9 Sài đất Wedelia chinensis (Osbeck) Merr. Cần Thơ Toàn cây 5.76 10 Diệp hạ châu Phyllanthus amarus L. Sóc Trăng Phần trên mặt đất 6.29 11 Sầu đâu Azadirachta indica A. Juss Cần Thơ Lá 8.84 12 Ổi Psidium guajava L. Vĩnh Long Lá 10.41 13 Trầu không Piper betle L. Hậu Giang Lá 5.47 14 Mướp đắng Momordica charantia L. Vĩnh Long Lá 5.98 15 Giấp cá Houttuynia cordata Thunb. Vĩnh Long Phần trên mặt đất 8.93 16 Mắc cỡ Mimosa pudica L. Cần Thơ Phần trên mặt đất 6.28 17 Tía tô Perilla frutescen (L.) Britt Cần Thơ Phần trên mặt đất 5.42 18 Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides L. Hậu Giang Phần trên mặt đất 8.40 19 Rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A. DC Cần Thơ Phần trên mặt đất 6.10 20 Cỏ mực Eclipta prostrata (L.) L. Cần Thơ Phần trên mặt đất 5.07 9 Dựa vào kết quả sàng lọc đạt được, loài cây Cỏ sữa lá lớn hứa hẹn nhiều tiềm năng sẽ phân lập được các hợp chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, bổ sung dữ liệu về các loài dược liệu có tác dụng hỗ trợ phòng và trị bệnh cho đối tượng nuôi trồng thủy sản. Vì vậy, đề tài đã chọn Cỏ sữa lá lớn là đối tượng nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, đồng thời cũng khảo sát thêm hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này. 3.2 Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn 3.2.1 Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn 3.2.2 Phân lập các hợp chất Từ các cao phân đoạn được phân lập trên cột sắc ký với các hệ dung môi thích hợp thu được 22 hợp chất. Phần này trình bày chi tiết quá trình phân lập các hợp chất từ cao chiết n-hexan, ethyl acetate, n-butanol và methanol của Cỏ sữa lá lớn. 3.2.3 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn Phần này trình bày chi tiết các đặc trưng vật lý, các dữ kiện phổ của 22 hợp chất được phân lập từ Cỏ sữa lá lớn. 3.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra của 20 cao chiết Từ kết quả sàng lọc của 20 cao chiết trên tế bào bạch cầu thu từ máu và từ thận cá tra đã cho thấy các cao chiết Cỏ sữa lá lớn, Diệp hạ châu thân xanh, Gừng, Sầu đâu, Tỏi có nhiều tiềm năng cải thiện đáng kể hệ miễn dịch trên cá tra khi so sánh với đối chứng. Tế 10 bào bạch cầu thu từ máu và từ thận đều tăng đồng thời cả ba chỉ tiêu miễn dịch với thời gian tối ưu của thí nghiệm được chọn là 24 giờ, ở hai loại nồng độ 10 và 100 µg/mL. Kết quả sàng lọc đã hứa hẹn nhiều tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra đặc biệt là tế bào bạch cầu thu từ thận. Ngoài ra, Cỏ sữa lá lớn đã được nghiên cứu ở một số nước trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam loài cây này chủ yếu mọc hoang, chưa được sử dụng nhiều trong ngành dược phẩm nước ta. Mặc dù loài Cỏ sữa lá lớn có nhiều tác dụng chữa bệnh trong dân gian, nhiều hoạt tính sinh học đáng quý lại dễ tìm kiếm nhưng còn rất ít công trình nghiên cứu ở Việt Nam. Với những lý do trên, đề tài đã lựa chọn Cỏ sữa lá lớn để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, đồng thời đánh giá thêm một số hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này. 3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập Từ loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất sạch (Bảng 4.24), trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài cây này. Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm hiện đại. 11 Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn Chất mới Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid 12 13 Các hợp chất thuộc nhóm phenol Hợp chất diterpenoid Các hợp chất thuộc nhóm triterpenoid 14 Hợp chất steroid 15 Hợp chất khác 6' O OH OH HO O O OH HO HO H3C 1" 6" O 1 2 3 4 5 6 7 Eup18: 1'-O-benzyl-rutinoside 1' 3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra Tế bào bạch cầu phân lập từ thận cá tra, được nuôi trong môi trường L-15 có bổ sung cao chiết Cỏ sữa lá lớn ở 2 nồng độ 10 µg/mL và 100 µg/mL và bổ sung các hợp chất sạch phân lập được ở 2 nồng độ 10 µg/mL và 50 µg/mL. Sau 24 giờ bổ sung mẫu thử, tiến hành phân tích các chỉ tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể để đánh giá ảnh hưởng của Cỏ sữa lá lớn lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra. Kết quả phân tích cho thấy các nghiệm thức sau 24 giờ bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao n-hexane Cỏ sữa lá lớn tại nồng độ 100 µg/mL có hoạt tính lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng. Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung cao MeOH (tăng khoảng hơn 2 lần so với đối chứng) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0.01). Ngoài ra, cao EtOAc và cao BuOH cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp (10 µg/mL) trên tế bào bạch cầu thận cá tra. Tại nồng độ 10 µg/mL, quercitrin đã làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme; trong khi 16 taraxerol và rutin tuy cũng có làm gia tăng hoạt tính này nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu thận tăng rõ rệt khi bổ sung cao EtOAc, cao BuOH và rutin ở nồng độ 10 µg/mL (p<0.01). Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết hay hợp chất sạch phân lập được, hàm lượng tổng kháng thể của các nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao BuOH của Cỏ sữa lá lớn đều khác biệt rõ rệt và có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, hàm lượng tổng kháng thể ở nghiệm thức bổ sung 10 µg/mL cao BuOH đã tăng 2.0 lần so với đối chứng. Hàm lượng tổng kháng thể đã tăng đáng kể ở nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao n- hexane ở nồng độ 100 µg/mL. Tuy nhiên, các chất phân lập khảo nghiệm đều không có tác dụng tăng cường nhiều hoạt tính tổng kháng thể sau 24 giờ bổ sung vào tế bào bạch cầu thận cá tra. Như vậy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể cũng như cho thấy hàm lượng tổng kháng thể cũng tăng cao khi có sự tác động của cao chiết Cỏ sữa lá lớn. Điều này chứng minh tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra. 3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết và chất phân lập từ Cỏ sữa lá lớn được khảo sát trên năm chủng vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio parahaemolyticus. 17 Qua kết quả đánh giá cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có khả năng kháng khuẩn đối với năm chủng vi khuẩn ở các nồng độ khảo nghiệm ngoại trừ cao n-hexane (0.3125 mg/mL) đối với khuẩn Aeromonas dhakensis-W (MIC = 625 µg/mL). Trong đó, cao chiết EtOAc cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas dhakensis-D. và V.parahaemolyticus cao nhất (MIC = 18 µg/mL) và rutin, taraxerol lại cho hiệu quả ức chế khuẩn Aeromonas hydrophila -N mạnh nhất (MIC = 1.5 µg/mL), tạo được vòng vô khuẩn lớn nhất ở tất cả các nồng độ so với các chủng vi khuẩn khác. Cao EtOAc có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn A. hydrophila - D với đường kính vòng vô khuẩn 22.80 mm ở nồng độ 5 mg/mL và có giá trị MIC = 39 µg/mL. Rutin cũng thể hiện khả năng kháng khuẩn A. hydrophila-D mạnh với đường kính vòng vô khuẩn tăng nhanh từ 13.60 đến 29.33 trong khoảng nồng độ khảo sát. Cao tổng, các cao phân đoạn và chất phân lập khảo sát đều có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila-N. Cao EtOAc có khả năng kháng A. hydrophila-N mạnh hơn cao MeOH thể hiện qua đường kính vòng vô khuẩn của cao EtOAc tăng đáng kể từ 13.73 lên 23.20 mm với giá trị MIC = 78 µg/mL Cao n-butanol có khả năng kháng Aeromonas dhakensis-W cao nhất trong tất cả các loại cao chiết được khảo sát với giá trị MIC = 18 µg/mL. Hiệu quả kháng A. dhakensis-W của các loại cao chiết tăng dần theo thứ tự: n-hexane, MeOH, BuOH và EtOAc tại nồng độ 5 mg/mL. Cao BuOH và MeOH đều có khả năng ức chế Aeromonas dhakensis-D gần như là tương đương nhau và khác biệt có ý nghĩa về 18 mặt thống kê. Cao EtOAc có khả năng kháng A. dhakensis-D mạnh hơn cả với giá trị MIC = 18 µg/mL. Đối với khuẩn Vibrio parahaemolyticus: cao EtOAc, taraxerol và kháng sinh thương mại Vancomycin HCl ức chế hiệu quả chủng vi khuẩn này với giá trị MIC lần lượt là 18.0; 2.0 và 3.0 µg/mL. Trong trường hợp này, chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus không nhạy cảm với kháng sinh cefixim. 3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa 3.7.1 Hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH và ABTS•+ Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của Cỏ sữa lá lớn được so sánh với chất chuẩn là vitmin C. Kết quả cho thấy, quercitrin và rutin (IC50 = 5.32 và 6.43 µg/mL) trung hòa gốc tự do DPPH tương đương Vitamin C (IC50 = 4.39 µg/mL). Cao BuOH và MeOH có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH cao với IC50 lần lượt là 11.43 và 12.69 µg/mL; chỉ kém vitamin C 2.6 và 2.9 lần. Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ của quercitrin và rutin cao (IC50 = 6.92 và 7.57 µg/mL) tuy vẫn thấp hơn so với chất chuẩn trolox (IC50 = 2.90 µg/mL). Cao BuOH có khả năng trung hòa gốc tự do ABTS•+ kém chất chuẩn trolox khoảng 4 lần. 3.7.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 3.7.2.1 Khảo sát độc tính của các cao chiết trên dòng tế bào MIN6 Ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy có cao chiết với những nồng độ khác nhau đều có mật độ tế bào sống khác biệt không 19 có ý nghĩa về mặt thống kê đối với nghiệm thức đối chứng chỉ có môi trường DMEM. Kết quả này cho thấy các mẫu cao chiết ở các nồng độ khảo sát (0.01-10.00 mg/ml) không có độc tính đối với tế bào MIN6. 3.7.2.2 Khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 + Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng tồn tại của tế bào MIN6 Kết quả cho thấy khi xử lý với 0.1-0.5 mM H2O2 trong hai giờ đã gây chết tế bào đáng kể so với đối chứng và số tế bào sống phụ thuộc vào nồng độ H2O2. Trên cơ sở kết quả đã đạt được và một số báo cáo trước đây, nồng độ H2O2 0.4 mM (gây chết 51% tế bào) đã được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. + Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các cao chiết Việc bổ sung các cao chiết đã cải thiện đáng kể số lượng tế bào sống so với các mẫu môi trường nuôi cấy chỉ có H2O2, ngoại trừ cao n-hexane ở nồng độ 0.01 mg/mL. Ở nghiệm thức môi trường có chứa cao EtOAc hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất và kết quả cho thấy khả năng tồn tại của tế bào là 81% ở nồng độ 0.1 mg/mL so với đối chứng dương vitamin E (84% ở 0.2 mg/mL). Cao tổng cho hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất là 78% ở nồng độ 1.0 mg/mL, trong khi nghiệm thức xử lý với cao MeOH và cao BuOH cho thấy khả năng bảo vệ tế bào tương đối tốt và cao n-hexane kém hiệu quả nhất. + Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 của các chất phân lập Các hợp chất khảo sát đều có khả năng bảo vệ các tế bào MIN6 khỏi sự chết do H2O2 gây ra trong khoảng nồng độ khảo sát từ 20 1.0 đến 1000 µg/mL. Quercitrin (10 µg/mL) và rutin (100 µg/mL) có khả năng bảo vệ tế bào khá mạnh, tương ứng với 65% và 70% tế bào tồn tại (so với 49% tế bào sống sót khi không được xử lý với các mẫu thử). Taraxerol không có hiệu quả bảo vệ tế bào đáng kể tại nồng độ 100 µg/mL và chỉ có tác động tại nồng độ 1000 µg/mL với khả năng bảo vệ tế bào là 61%. Quercetin và luteolin ở nồng độ 100 µg/mL có tác dụng bảo vệ tế bào mạnh nhất khi so sánh với vitamin E (0.2 mg/mL, 84%). Quercetin và luteolin có tác dụng tốt nhất ở 100 µg/ml (tương ứng với 82% và 78% tế bào sống sót), trong khi các hợp chất khác cũng thể hiện khả năng bảo vệ tế bào nhưng kém hiệu quả hơn. 3.8 Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress Ở nghiệm thức tế bào được nuôi cấy trong môi trường có thapsigargin (TG) và các cao chiết hay các chất phân lập được, phần trăm tế bào sống cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức môi trường nuôi cấy chỉ có TG. Cụ thể ở nghiệm thức môi trường có chứa cao chiết MeOH Cỏ sữa lá lớn (0.1 mg/mL) số tế bào sống đạt 69%, cao hơn so với môi trường chỉ có TG (40%). Kết quả cho thấy các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn (1.0 – 1000 µg/mL) được thử nghiệm đều có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khi bị TG gây ER stress dẫn đến chết tế bào. Hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất được quan sát đối với quercitrin (78%, 10 µg/mL). Đối với rutin và taraxerol, hiệu quả bảo vệ tế bào đạt được cao nhất là 70% và 64% tại nồng độ 100 µg/mL. Tùy thuộc vào nồng độ (1.0–1000 µg/mL), phần trăm tế bào sống sót của nhóm được bổ sung luteolin và quercetin dao động tương ứng từ 66% đến 69%, và từ 62% đến 70%. Như vậy, quercetin và luteolin đã chứng minh được tác dụng bảo vệ 21 tế bào MIN6 và cho thấy hiệu quả tối đa của chúng ở nồng độ 10 µg/mL và caffeic acid cũng cho thấy sự bảo vệ tế bào cao nhất (68%) ở nồng độ này. Các kết quả thí nghiệm này chứng minh Cỏ sữa lá lớn có khả năng bảo vệ các tế bào MIN6 chống lại sự chết do TG gây ra, là ứng viên tiềm năng trong việc nghiên cứu thảo dược trong việc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. * Nhận xét chung: Các kết quả phân tích về hóa học cho thấy Cỏ sữa lá lớn thu hái tại Cần Thơ cũng thừa hưởng các đặc điểm hóa thực vật của các loài thuộc chi Euphorbia với các lớp chất chính là flavonoid, triterpenoid; trong đó rutin, quercitrin, taraxerol chiếm hàm lượng cao. Từ các kết quả đánh giá hoạt tính cho thấy: các cao chiết và một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ sữa lá lớn thể hiện tốt các hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa và hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi ER stress ở các mức độ khác nhau. Việt Nam với nguồn hệ thực vật rất phong phú và là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ. Đây là nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất ứng dụng trong đời sống. Nuôi trồng thủy sản đang từng bước trở thành ngành kinh tế quan trọng của nước ta. Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được xem là một trong những đối tượng nuôi chủ 22 lực ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nghề nuôi cá tra phát triển quá nhanh, không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều và phức tạp, gây thiệt hại đáng kể. Kháng sinh và hóa chất đã được sử dụng để phòng và trị bệnh, nhưng lại đưa đến hiện tượng kháng thuốc. Nghiêm trọng hơn, sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây độc, ảnh hưởng sức khỏe cho người và cũng là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản. Do đó, khuynh hướng chung hiện nay là nghiên cứu tìm ra những thảo dược thân thiện thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho cá. Với cách tiếp cận như trên, kết quả của các nghiên cứu trên đã mở ra tiềm năng cho Cỏ sữa lá lớn Việt Nam nhằm có thể tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, sử dụng thảo dược nhằm thay thế kháng sinh, tăng cường miễn dịch trên thủy sản từ đó nâng cao chất lượng nuôi trồng thủy sản ở nước ta. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ toàn cây của Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại thành phố Cần Thơ đề tài đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học một hợp chất mới là sodium β-D-glucopyranosyl 12-hydroxy jasmonate (Eup16) cùng 21 hợp chất đã biết bao gồm: 11 flavonoid: quercitrin (Eup01), rutin (Eup02), avicularin (Eup04), astragalin (Eup05), luteolin (Eup08), quercetin (Eup09), (+)-catechin (Eup11), afzelin (Eup14), myricitrin (Eup15), hymenoxin (Eup19) và cynaroside (Eup21); ba hợp chất phenol: caffeic acid (Eup10), protocatechuic acid (Eup12) và gallic acid (Eup13); năm hợp chất 23 triterpen: taraxerol (Eup06), taraxerone (Eup07), 3β,7β,25- trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03), cycloart-23-ene- 3β,25-dioltrifolin (Eup17) và campesterol (Eup20); một hợp chất diterpen: 2β,16α,19-trihydroxy-ent-kaurane (Eup23) cùng với một hợp chất khác: 1-O-benzyl-rutinoside (Eup18). Trong đó, có bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài này, đó là: avicularin (Eup04), (+)-catechin (Eup11), hymenoxin (Eup19), cynaroside (Eup21), 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (Eup03), cycloart-23-ene-3β,25-dioltrifolin (Eup17) và 1-O-benzyl rutinoside (Eup18). Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy:  Cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra thông qua việc gia tăng hoạt tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể.  Hợp chất Eup02 (rutin) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A. hydrophila-D tốt với giá trị đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 29.33 ±0.35 mm tại nồng độ 64 µg/mL và hợp chất Eup06 (taraxerol) đạt 24.50±0.44 mm đối với khuẩn A. hydrophila-N cũng tại nồng độ 64 µg/mL.  Hợp chất Eup01 (quercitrin) và Eup02 (rutin) và thể hiện hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS•+ cao với giá trị IC50 tương ứng là 5.32; 6.43 và 6.92; 7.57 µg/mL khi so với chất đối chứng dương vitamin C (3.66 µg/mL) và trolox (2.90 µg/mL). Khả năng kháng oxi hóa còn được khảo nghiệm qua khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng MIN6 trên mô hình sử dụng H2O2 gây chết tế bào và so sánh với đối chứng dương là vitamin E (0.2 mg/mL), kết quả cho thấy cao EtOAc (0.1 mg/mL) và hợp chất Eup09 (quercetin) với 24 nồng độ 100 µg/mL cho hiệu quả bảo vệ tế bào mạnh nhất với % tế bào sống sót lần lượt là 81% và 82% đối chiếu với 49% tế bào sống sót khi không có mẫu thử.  Cỏ sữa lá lớn đã thể hiện khả năng bảo vệ tế bào MIN6 chống lại sự chết do thapsigargin gây ra, trong đó hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất là cao MeOH và hợp chất Eup01 (quercitrin) với tỉ lệ tế bào sống sót đạt lần lượt là 69% và 78%; cao hơn so với môi trường chỉ có thapsigargin (40% tế bào sống sót). 2. Kiến nghị Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Cỏ sữa lá lớn đã cho thấy có nhiều hợp chất flavonoid (11/22 chất) được phân lập cùng với sự ứng dụng sinh học đa dạng, tiềm năng của loài cây này. Tuy nhiên hiện nay Cỏ sữa lá lớn vẫn chưa được ứng dụng và khai thác nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sinh học và dược học để khẳng định thêm giá trị khoa học của loài cây này, góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm phục vụ cuộc sống, đặc biệt là trong thủy sản. 3