Tóm tắt Luận án Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

.5 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 95oC 5 phút 1 95oC 30 giây 30 55oC 30 giây 72oC 1 phút 45 giây 72oC 5 phút 1 3.3.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn - Leptospira được nuôi cấy theo qui trình của WHO (2003) trên môi trường EMJH, được quan sát dưới KHV nền đen và được định danh đến mức loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự. - Kỹ thuật PCR được thực hiện như mục 3.3.1 5 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn Leptospira - Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và được giải trình tự nucleotide tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). - Mẫu được giải trình tự gene 16S rRNA tự động trên máy ABI 3130 Sequencer, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R. - Nếu mức độ đồng nhất của trình tự nucleotide trong đoạn gene 16S rRNA đạt ≥ 95% thì có thể xác định tới chi (genus) và ≥ 99% thì có thể xác định tới loài (species) (dựa theo mô tả mức độ tương đồng của La Scola et al., 2006). - Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide bằng cách sử dụng phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016). Tra cứu kết quả trên BLAST SEARCH và so sánh các vi khuẩn sẵn có từ GenBank, cơ sở dữ liệu trên NCBI để xác định các loài phân lập được và hai loài xoắn khuẩn Leptospira tham chiếu được dùng để so sánh trong phân tích phát sinh loài: >Icterohaemorrhagiae NR_116542.1 Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. >Hurstbridge NR_043049.1 Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT 6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. 3.3 Nội dung 3: Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó - Những biến đổi bệnh lý ở chó bệnh được khảo sát dựa trên chỉ số sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên 13 chó dương tính với Leptospira bằng PCR và có MAT≥ 1: 400. a. Xét nghiệm máu Các chỉ tiêu sinh lý máu được khảo sát bằng máy huyết học (Cell Dyn 3200, Mỹ) bao gồm: bạch cầu, neutrophile%, lymphocytes%, hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, tiểu cầu và các chỉ tiêu sinh hóa máu được khảo sát bằng máy phân tích sinh hóa máu (AU604, Nhật): ure, creatinin, AST, ALT và bilirubin và so sánh với tiêu chuẩn của The Merck (2010). b. Xét nghiệm nước tiểu - Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu được khảo sát bằng máy phân tích nước tiểu (U120, Mỹ) bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, protein và bilirubin và so sánh với tiêu chuẩn của Merck (2010) và Khorami et al. (2010). 6 c. Chỉ tiêu khảo sát - Sự thay đổi các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên chó bệnh Leptospirosis. - Những dấu hiệu lâm sàng trên chó nghi bệnh Leptospirosis: sốt, bỏ ăn, nôn mửa, xuất huyết da,... 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó Đối tượng nghiên cứu: chó khỏe và chó bệnh được mang đến khám và điều trị ở 3 phòng khám thú y tại thành phố Cần Thơ. - Bố trí phác đồ điều trị có sự hợp tác tham gia nghiên cứu với chủ nuôi. - Sáu mươi ba chó trong nội dung 2 có hiệu giá kháng thể kháng Leptospira ≥ 1: 400, có sự hiện diện của xoắn khuẩn Leptospira trong nước tiểu khi soi bằng KHV nền đen (được phân bố ngẫu nhiên gồm 32 chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng (TCLS) và 31 chó có một số biểu hiện TCLS nghi nhiễm bệnh Leptospirosis: ói, ăn ít, buồn, lười vận động, suy thận, suy gan, báng bụng, xuất huyết da và vàng da). Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm Thuốc sử dụng Số chó điều trị (con) Liều lượng Đường cấp Liệu trình Phác đồ 1: Shoptapen (Penicillin G+Streptomycin) 20 0,2 mg/kgP, cách 3 ngày Tiêm dưới da/ bắp 7–14 ngày Phác đồ 2: Amoxicillin 22 22 mg/kgP, ngày 2 lần Uống 7–14 ngày Phác đồ 3: Doxycycline 21 5 mg/kgP, ngày 2 lần Uống 7–14 ngày Chỉ tiêu theo dõi để đánh giá hiệu quả điều trị dựa theo Goldstein, (2010); Sykes et al. (2011); Francey and Schweighauser, (2012) và Schuller et al. (2015). 3.5 Phân tích và xử lý số liệu - Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013. - Các chỉ tiêu sinh lý máu, sinh hóa máu, sinh lý, sinh hóa nước tiểu được trình bày dưới dạng ± SE. - Khảo sát các yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm Leptospira bao gồm 7 nhóm giống, nhóm tuổi, giới tính và phương thức nuôi bằng phép trắc nghiệm χ2 trong phần mềm Minitab 16.0 - Phương pháp hồi qui (regression) dùng phân tích mối tương quan về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột và chó với phương trình có dạng: y=a+ bx, trong đó a và b là hằng số, y và x là tỷ lệ dương tính trên chó và chuột. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó ở một số tỉnh ĐBSCL Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó Tỉnh Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ dương tính (%) Cần Thơ 650 159 24,46a Vĩnh Long 256 69 26,95a An Giang 263 53 20,15a Cà Mau 264 50 18,94b Tổng 1.433 331 23,10 Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Tổng số 1.433 mẫu huyết thanh (HT) chó có 331 mẫu dương tính với Leptospira chiếm tỷ lệ là 23,10%. Trong đó, tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó cao nhất ở tỉnh Vĩnh Long (26,95%), kế đến là Cần Thơ (24,46%), An Giang (20,15%) và Cà Mau (18,94%). So sánh nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995), khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở các tỉnh miền Nam: Long An, Cần Thơ, Đồng Nai và các vùng phụ cận thành phố Hồ Chí Minh là 44,44%. Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) khảo sát tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam với tỷ lệ nhiễm Leptospira trung bình trên chó 25,27%; ở Đắk Lắk tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 19,15% (Hoàng Mạnh Lâm, 2002) và kết quả nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai (2012) tại Công ty cổ phần thủy sản Sông Hậu Cần Thơ tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 40,47%. Điều này cho thấy những kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa các quốc gia có khác nhau có thể do khác nhau về khí hậu, thời tiết, điều kiện địa lý của mỗi quốc gia nên tỷ lệ nhiễm khác nhau và do tính thích nghi của mỗi chó khác nhau cho nên tình hình dịch tễ ở mỗi 8 địa phương khảo sát sẽ khác nhau (Levett, 2001; Ellis, 2010). Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó Tổng 1.433 mẫu HT khảo sát Các serogroup Leptospira Số lượt nhiễm Tỷ lệ (%) L. australis 19 5,74 L. autumnalis 12 3,63 L. bataviae 40 12,08 L. canicola 61 18,43 L. ballum 7 2,11 L. icterohaemorrhagiae 116 35,05 L. pyrogenes 30 9,06 L. cynopterie 9 2,72 L. gryppotyphosa 40 12,08 L. hebdomadis 12 3,63 L. javanica 22 6,65 L. panama 29 8,76 L. semaranga 3 0,91 L. pomona 9 2,72 L. tarassovi 1 0,30 L. sejroe 31 9,37 L. louisiana 9 2,72 L. hurstbridge 42 12,69 Tổng số mẫu dương tính 331 Qua Bảng 4.2 chứng minh có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chó ở các tỉnh ĐBSCL. Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L. icterohaemorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,43%), L. hurstbridge (12,69%), L. bataviae (12,08%) và L. gryppotyphosa (12,08%). So với nghiên cứu của Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh Phương (1999) đã chứng minh được trên chó ở vùng phụ cận Hà Nội cũng có nhiễm các serogroup L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa và L. icterohaemorrhagiae. Như 9 vậy tùy vào tình hình dịch tễ của mỗi địa phương có sự khác nhau về các serogroup Leptospira đang lưu hành. Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Serogroup Leptospira Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % australis 15 78,95 4 21,05 0 0,00 0 0,00 0 0,00 autumnalis 11 91,67 1 8,33 0 0,00 0 0,00 0 0,00 bataviae 31 77,50 9 22,50 0 0,00 0 0,00 0 0,00 canicola 41 67,21 14 22,95 3 4,92 2 3,28 1 1,64 ballum 6 85,71 1 14,29 0 0,00 0 0,00 0 0,00 icterohaemorrh agiae 86 74,14 22 18,97 6 5,17 2 1,72 0 0,00 pyrogenes 22 73,33 7 23,33 1 3,33 0 0,00 0 0,00 cynopterie 6 66,67 2 22,22 1 11,11 0 0,00 0 0,00 gryppotyphosa 30 75,00 7 17,50 2 5,00 1 2,50 0 0,00 hebdomadis 7 58,33 5 41,67 0 0,00 0 0,00 0 0,00 javanica 15 68,18 6 27,27 1 4,55 0 0,00 0 0,00 panama 17 58,62 9 31,03 3 10,34 0 0,00 0 0,00 semaranga 3 100,0 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 pomona 7 77,78 2 22,22 0 0,00 0 0,00 0 0,00 tarassovi 1 100,0 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 sejroe 26 83,87 5 16,13 0 0,00 0 0,00 0 0,00 louisiana 6 66,67 3 33,33 0 0,00 0 0,00 0 0,00 hurstbridge 33 78,57 9 21,43 0 0,00 0 0,00 0 0,00 Tổng lượt 492 363 73,78 106 21,54 17 3,46 5 1,02 1 0,2 10 Cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở mức hiệu giá ngưng kết kháng nguyên kháng thể thấp từ 1: 200 đến 1: 800, chỉ có hai serogroup L. canicola và L. icterohaemorrhagiae ở mức cao từ 1: 1600 đến 1: 3200. So với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995), cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết 1: 800 và nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết từ 1: 800 đến 1: 1600. Nếu hiệu giá kháng thể kháng Leptospira càng cao chứng tỏ mức độ nhiễm càng cao vì hiệu giá kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chó. Tùy vào mỗi vùng, mỗi khu vực, mỗi quốc gia có thể nhiễm các serogroup Leptospira với cường độ khác nhau và còn tùy thuộc vào thời điểm lấy mẫu, tình trạng sức khỏe của con vật lúc lấy huyết thanh và điều kiện nuôi dưỡng của chó. Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó Giống chó Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Chó nội 835 198 23,71a Chó ngoại 598 133 22,24a Tỷ lệ nhiễm Leptospira ở giống chó nội 23,71% và giống chó ngoại 22,24% khác nhau không ý nghĩa thống kê. Điều này có thể do trong cùng một môi trường sống nên khả năng chó tiếp xúc với mầm bệnh là như nhau nên tỷ lệ nhiễm Leptospira không khác biệt giữa hai nhóm giống chó giống như nhận định của Harland et al. (2013) và Maele et al. (2008), yếu tố giống không ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm Leptospira. Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó Độ tuổi Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) 4 tháng < 12 tháng tuổi 358 77 21,51 a ≤ 1-6 năm tuổi 737 166 22,52 a ≥ 6 năm tuổi 338 88 26,04 a Tỷ lệ dương tính với Leptospira cao nhất ở chó lớn hơn 6 năm tuổi (26,04%), kế đến chó từ ≤ 1 tuổi đến 6 năm tuổi (22,52%) và chó từ 4 tháng đến dưới 12 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (21,51%), tuy nhiên qua phân tích thống kê khác nhau không có ý nghĩa. Điều này nói lên rằng Leptospira có thể gây bệnh cho chó ở mọi lứa tuổi và chó càng lớn tuổi thì có tỷ lệ nhiễm càng cao (Harland et al., 2013). 11 Bảng 4.6 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính Giới tính Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Chó đực 715 173 24,20a Chó cái 718 158 22,01a Bảng 4.6 cho thấy ở ĐBSCL chó đực dương tính với Leptospira 24,20% và chó cái 22,01% và khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Điều này nói lên rằng chó đực và cái đều có thể nhiễm Leptospira như nhau. Theo kết quả khảo sát của Senthil et al. (2013), tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó đực (20,9%) và chó cái (21%) là tương đương nhau và nghiên cứu của Dhliwayo et al. (2012) và Anabel et al. (2013) nhận xét tỷ lệ chó dương tính với Leptospira không phụ thuộc theo giới tính. Bảng 4.7 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi Phương thức nuôi Số mẫu HT kiểm tra Số mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Nuôi thả 949 246 25,92a Nuôi nhốt 484 85 17,56b Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Kết quả Bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ dương tính với Leptospira đối với chó nuôi thả rong là 25,92% cao hơn chó nuôi nhốt 17,56% và sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,01). Điều này có thể giải thích do chó nuôi thả rong ít được quan tâm chăm sóc, điều kiện vệ sinh kém có nhiều cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh thông qua hoạt động tìm kiếm thức ăn hằng ngày, tiếp xúc với nước tiểu chuột hoặc uống nước bẩn, ăn thức ăn có nhiễm Leptospira hơn chó nuôi nhốt nên chó nuôi thả rong có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn (Garde, 2013). 12 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột và mối tương quan về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và chó. 4.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột Bảng 4.8 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL Loại chuột Mẫu HT kiểm tra Mẫu HT dương tính Tỷ lệ (%) Chuột cống (Rattus norvegicus) 285 132 46,32 a Chuột xạ (Suncus murinus) 152 40 26,32b Chuột nhắt (Mus musculus) 210 57 27,14b Tổng 647 229 35,40 Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Qua Bảng 4.8 cho thấy chuột dương tính với Leptospira 35,40%, trong đó chuột cống (Rattus norvegicus) nhiễm cao nhất (46,32%), kế đến là chuột nhắt (Mus musculus) (27,14%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất là chuột xạ (Suncus murinus) (26,32%) và sai khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). So với khảo sát về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột của các tác giả khác nhau sẽ có tỷ lệ nhiễm Leptospira khác nhau như nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995) tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở Hà Nội 34,01%, Nguyễn Thị Ngân (2000) và Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam liên tục 2 năm (2000-2001) có tỷ lệ nhiễm là 63%, và Lý Thị Liên Khai (2012) tại Cần Thơ là 55,55%. Sư khác nhau có thể do khác nhau về vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên và chuột là loài gặm nhấm thường sống trong cống rãnh, các khu vực rác thải nên tỷ lệ dương tính với Leptospira trên chuột giữa các nghiên cứu cũng khác nhau (Suepaul et al., 2014). Bảng 4.9 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột Tổng 647 mẫu HT khảo sát Các serogroup Leptospira Số lượt nhiễm Tỷ lệ (%) L. australis 12 5,24 L. autumnalis 9 3,93 L. bataviae 32 13,97 L. canicola 47 20,52 L. ballum 4 1,75 13 Tổng 647 mẫu HT khảo sát Các serogroup Leptospira Số lượt nhiễm Tỷ lệ (%) L. icterohaemorrhagiae 93 40,61 L. pyrogenes 19 8,30 L. cynopterie 10 4,37 L. gryppotyphosa 18 7,86 L. hebdomadis 6 2,62 L. javanica 13 5,68 L. panama 25 10,92 L. semaranga 1 0,44 L. pomona 17 7,42 L. tarassovi 7 3,06 L. sejroe 22 9,61 L. louisiana 10 4,37 L. hurstbridge 25 10,92 Tổng số mẫu dương tính 229 Kết quả ở Bảng 4.9 chứng minh gián tiếp có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chuột ở 4 tỉnh ĐBSCL. Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L. icterohaemorrhagiae (40,61%), L. canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%) và serogroup L. hurstbridge (10,92%). So với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995) chuột nhiễm chủ yếu là L. bataviae và L. pomona hay nghiên cứu của Hoàng Kim Loan et al. (2013) về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên các loài gặm nhấm ở miền Nam Việt Nam có 2 serogroups chiếm tỷ lệ cao trên chuột gồm L. bataviae và L. hurstbridge. Bảng 4.10 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Serogroup Leptospira Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % Lượt % australis 9 75,00 2 16,67 1 8,33 0 0,00 0 0,00 autumnalis 6 66,67 2 22,22 0 0,00 1 11,11 0 0,00 bataviae 18 56,25 8 25,00 4 12,50 2 6,25 0 0,00 14 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 canicola 36 76,60 6 12,77 4 8,51 1 2,13 0 0,00 ballum 4 100 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 icterohaemorrh agiae 54 58,06 23 24,73 13 13,98 2 2,15 1 1,08 pyrogenes 11 57,89 5 26,32 2 10,53 1 5,26 0 0,00 cynopterie 9 90,00 1 10,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 gryppotyphosa 13 72,22 4 22,22 1 5,56 0 0,00 0 0,00 hebdomadis 4 66,67 3 50,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 javanica 10 76,92 2 15,38 0 0,00 0 0,00 0 0,00 panama 17 68,00 6 24,00 1 4,00 1 4,00 0 0,00 semaranga 1 100,0 0 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 pomona 10 58,82 5 29,41 2 11,76 0 0,00 0 0,00 tarassovi 7 100 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 sejroe 16 72,73 4 18,18 2 9,09 0 0,00 0 0,00 louisiana 8 80,00 2 20,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 hurstbridge 14 56,00 6 24,00 3 12,00 2 8,00 0 0,00 Tổng lượt 370 247 66,76 79 21,35 33 8,92 10 2,70 1 0,27 Kết quả trình bày ở Bảng 4.10 cho thấy cường độ nhiễm Leptospira trên chuột ở 4 tỉnh khảo sát tập trung ở hiệu giá ngưng kết kháng nguyên kháng thể thấp từ 1: 20 đến 1: 40. Điều này cho thấy chuột ở các địa điểm khảo sát chỉ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira ở mức độ thấp, chuột vẫn còn đang trong giai đoạn mang trùng chưa bọc phát thành dịch nhưng có thể truyền mầm bệnh cho các loài vật khác, kể cả người (Levett, 2001). 4.1.2.2. Mối tương quan về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và chó Bảng 4.11 Tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó Các serogroup Tỷ lệ dương tính trên chuột Tỷ lệ dương tính trên chó STT Leptospira (%) (%) 1 L. australis 5,24 5,74 2 L. autumnalis 3,93 3,63 3 L. bataviae 13,97 12,08 15 Các serogroup Tỷ lệ dương tính trên chuột Tỷ lệ dương tính trên chó STT Leptospira (%) (%) 4 L. canicola 20,52 18,43 5 L. ballum 1,75 2,11 6 L. icterohaemorrhagiae 40,61 35,05 7 L. pyrogenes 8,30 9,06 8 L. cynopterie 4,37 2,72 9 L. gryppotyphosa 7,86 12,08 10 L. hebdomadis 2,62 3,63 11 L. javanica 5,68 6,65 12 L. panama 10,92 8,76 13 L. semaranga 0,44 0,91 14 L. pomona 7,42 2,72 15 L. tarassovi 3,06 0,30 16 L. sejroe 9,61 9,37 17 L. louisiana 4,37 2,72 18 L. hurstbridge 10,92 12,69 R2 = 0,90; P<0,01 Qua Bảng 4.11 cho thấy có 18/18 serogoup Leptospira được phát hiện đồng thời trên chuột và chó tại khu vực ĐBSCL. Trong đó có 4 serogoup nhiễm với tỷ lệ cao trên cả chuột và chó gồm serogoup L. bataviae (13,97% và 12,08%), serogoup L. canicola (20,52% và 18,43%), serogoup L. icterohaemorrhagiae (40,61% và 35,05%) và serogoup L. hurstbridge (10,92% và 12,69%). So với kết quả nghiên cứu của Hoàng Mạnh Lâm (2002) khi nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira trên gia súc và người ở tỉnh Đaklak, các serogoup cùng được phát hiện trên chuột và chó là serogroup L. icterohaemorrhagiae hay Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), các chủng huyết thanh gây nhiễm cao ở chuột và chó gồm serogroup L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa, L. icterohaemorrhagiae và L. pomona. 16 Phân tích phương trình hồi qui cho thấy tỷ lệ dương tính giữa các serogroup Leptospira trên chuột và trên chó là khá chặt chẽ, với hệ số tương quan R2=0,90 thể hiện mức độ tương quan cao và phương trình hồi qui: y= 0,466 + 0,868x. y = 0,466 + 0,868x R² =0,90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 P re v a le n ce o f p o si ti v e L ep to sp ir a in d o g s (% ) Hình 4.1 Quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ dương tính Leptospira trên chuột (x) và chó (y) 4.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu 4.2.1 Kết quả phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR Bảng 4.12 Tỷ lệ phát hiện Leptospira trực tiếp từ nước tiểu Triệu chứng lâm sàng Số mẫu nước tiểu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Số chó không biểu hiện TCLS 32 6 18,75a Số chó có biểu hiện TCLS nghi nhiễm Leptospira 31 7 22,58a Tổng 63 13 20,63 Trong 63 mẩu nước tiểu kiểm tra có xoắn khuẩn Leptospira bằng KHV thì có 13 (20,63%) mẫu dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR. Trong đó 18,75% (6/32) mẫu dương tính từ những chó không biểu hiện TCLS và 22,58% (7/31) mẫu dương tính từ những chó có biểu hiện TCLS nghi ngờ nhiễm Leptospira và sai khác không có ý nghĩa thống kê. Leptospira sau khi nhiễm vào máu và khu trú trong thận, có thể thải Leptospira ra môi trường bên ngoài qua nước tiểu trong một thời gian dài, 17 có thể chó bệnh có biểu hiện TCLS hoặc không biểu hiện TCLS của bệnh và một khi TCLS rõ ràng thì rất khó điều trị (Levvet, 2001). 4.2.2 Kết quả phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy Bảng 4.13 Tỷ lệ Leptospira phát hiện được theo các địa điểm lấy mẫu Địa điểm Số mẫu nước tiểu kiểm tra Số mẫu nghi nhiễm Leptospira Số xoắn khuẩn phân lập được Bệnh xá Thú y, ĐHCT. 28 14 (50%) 0 (0%) Phòng mạch Thú y Liên Quận Ninh Kiều - Bình Thủy, TPCT. 11 2 (18,18%) 0 (0%) Phòng mạch Thú y, 50 đường Võ Văn Kiệt, TPCT. 72 47 (65,27%) 3 (6,38%) Tổng 111 63 (56,76%) 3 (4,76%) Tổng số 111 mẫu nước tiểu chó từ những chó có hiệu giá kháng thể kháng 18 serogroup Leptospira MAT ≥ 1: 400, kết quả có 63 (56,76%) mẫu nước tiểu nghi có nhiễm Leptospira khi soi dưới KHV nền đen. Sáu mươi ba mẫu này được cấy vào môi trường EMJH và được theo dõi đến 3 tháng, kết quả có 3 mẫu (4,76%) có xoắn khuẩn phát triển vào thời điểm 17 ngày. Do Leptospira có đặc tính là khó nuôi cấy và thời gian nuôi cấy dài, đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm và kỹ năng và dễ tạp nhiễm các vi khuẩn khác. Hình 4.2 Leptospira soi dưới KHV nền đen (X40) lúc nuôi cấy 17 ngày Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, 90V, 45 phút. Mẫu 1, 2 âm tính. Các mẫu 3, 4 và 5 dương tính. 18 1400bp Kết hợp kết quả định danh loài xoắn khuẩn với kết quả giám định huyết thanh học bằng phương pháp vi ngưng kết đã được thực hiện đồng thời trên cùng mẫu chó cho thấy mẫu số 3 với tổng số nucleotide (nt) là 1374nt và mẫu số 5 với tổng số nucleotide là 1369nt tương đồng với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA có mã số trên GeneBank là NR 116542.1 ở mức ≥ 99%. Mẫu số 4 với tổng số nucleotide được giải trình tự là 1393nt, khi so sánh với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT6 có mã số trên GeneBank là NR 043049.1 với mức độ tương đồng ≥ 99% và có thể xác định thuộc loài gây bệnh cơ hội Leptospira fainei (intermediate pathogenic Leptospira). Bảng 4.14 Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira dựa vào mức độ tương đồng của gene 16S rRNA STT Ký hiệu mẫu Số nt và mã gene Mức độ tương đồng Loài xoắn khuẩn Leptospira phân lập được 1 3 1374 nt, NR 116542.1 99% Leptospira interrogans 2 5 1369 nt, NR 116542.1 99% 3 97 1385 nt, NR 116542.1 93% 4 181 1392 nt, NR 116542.1 99% 5 204 1412 nt, NR 116542.1 98% 6 307 1391 nt, NR 116542.1 99% 7 308 1408 nt, NR 116542.1 99% 8 310 1390 nt, NR 116542.1 99% 9 312 1394 nt, NR 116542.1 99% 10 313 1390 nt, NR 116542.1 99% 11 490 1393 nt, NR 116542.1 99% 12 493 1390 nt, NR 116542.1 99% 13 494 1396 nt, NR 116542.1 98% 14 4 1393 nt, NR 043049.1 99% Leptospira fainei 15 328 1391 nt, NR 043049.1 99% 16 330 1413 nt, NR 043049.1 99% Tổng số 16 mẫu có DNA Leptospira trong Bảng 4.14 được giải trình tự, 13 mẫu thuộc về nhóm Leptospira interrogans (3, 5, 97, 181, 204, 307, 308, 310, 312, 313, 490, 493 và 494) và 3 mẫu thuộc về nhóm Leptospira 19 fainei (4, 328 và 330). Các kết quả thu được trong nghiên cứu này chứng minh có DNA của Leptospira hiện diện trong nước tiểu chó thuộc nhóm gây bệnh Leptospira interrogans tương tự như nghiên cứu của Lofflera et al. (2014) ở Argentina và một nghiên cứu ở Thái Lan, Alongkorn et al. (2017) và serogroup Leptospira fainei (serovar hurstbridge) phát hiện trên người hội chứng Weil’s (Petersen et al., 2001). Qua sơ đồ cây phả hệ (hình 4.4) cho thấy có 13 mẫu phát hiện được thuộc nhánh thứ nhất L. interrogans, mẫu số 308 có mối quan hệ gần với Leptospira interrogans, kế đến là mẫu 307, 5, 313 và xa nhất là mẫu 97 và 3 mẫu thuộc nhánh thứ hai Leptospira fainei, mẫu số 4 có quan hệ gần với Leptospira fainei, kế đến là mẫu 330 và 328. Phân tích mức độ tương đồng đã xác định Leptospira interrogans thuộc nhóm Leptospira gây bệnh và Leptospira fainei thuộc nhóm xoắn khuẩn trung gian gây bệnh cơ hội hiện diện trong nước tiểu chó tại thành phố Cần Thơ. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng phát sinh loài dựa trên gene 16S rRNA để phát hiện Leptospira trên chó ở ĐBSCL. Hình 4.4 Cây phả hệ phát sinh loài các serogroup Leptospira 20 4.3 Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó 4.3.1 Sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học trên chó nhiễm Leptospira Bảng 4.15 Các chỉ tiêu sinh lý máu trên chó nhiễm Leptospira Chỉ số theo dõi Tổng số mẫu sinh lý máu (n=13)( ±SE) Số mẫu có chỉ số sinh lý máu bất thường (%) Bạch cầu (109 /L) (6-17) 33,50±3,29 13/13 (100) Neutrophil % (60-70) 74,52 ±2,34 10/13 (76,92) Lymphocyte % (8-21) 36,43±6,78 7/13 (53,85) Hồng cầu (1012/L) (5,5-8,5) 5,44±0,82 9/13 (69,23) Hemoglobin (g/dL) (12-18) 11,98±1,34 7/13 (53,85) Hematocrit % (35-57) 35,75±3,92 7/13 (53,85) Tiểu cầu (109/L) (170-400) 106,4±19,2 9/13 (69,23) Những chó dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR có giá trị trung bình của bạch cầu, phần trăm neutrophil và lymphocyte cao hơn thông số bình thường. Giá trị trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit và tiểu cầu trong nghiên cứu này thấp hơn thông số bình thường. Điều này chứng tỏ những chó khảo sát có hiện tượng nhiễm trùng và có xảy ra thiếu máu, có thể do độc tố làm phá vỡ hồng cầu, gây ra tình trạng thiế