Tóm tắt Luận án Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng

47 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng quan): 27 trang; chương 2 (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng và phương pháp nghiên cứu): 23 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu): 66 trang; chương 4 (bàn luận): 26 trang; kết luận và kiến nghị: 3 trang. * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 107 tài liệu, trong đó có 84 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề: - Về ĐĐR: Đặc điểm thực vật và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và dược lý đã được công bố, công dụng-liều dùng dùng theo dân gian. - Cao thuốc: khái niệm; phân loại theo DĐVN V và DĐ Châu Âu. 2 giai đoạn chính trong kỹ thuật điều chế cao thuốc: chiết xuất và làm khô. Trong đó có trình bày về chiết xuất bằng siêu âm và làm khô bằng phun sấy là các kỹ thuật sử dụng trong luận án - Mô hình đánh giá tác dụng TCMD: in vitro và invivo: tổng quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu Lá cây ĐĐR được thu hái vào tháng 5/2015, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô (40oC) trong tủ sấy có quạt gió đến độ ẩm dưới 12%, rồi được làm nhỏ đến kích thước mong muốn và bảo quản trong túi nilon kín, để nơi thoáng mát, khô ráo. Để xây dựng TCCS mẫu được thu hái tại 5 tỉnh của Việt Nam. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, bào chế sử dụng mẫu được thu hái ở Hà Giang. 4 2.1.2. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng trưởng thành dòng Swiss, không phân biệt giống, cân nặng 18 - 22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp; Chuột cống trắng trưởng thành, dòng Wistar, không phân biệt giống, cân nặng mỗi con tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm là 160 - 180 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do ban chăn nuôi Học viện Quân Y cung cấp. 2.1.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi Các thuốc thử, hóa chất, dung môi, trang thiết bị đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất; xây dựng tiêu chuẩn; bào chế; đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính. 2.1.4. Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu Các thiết bị đặc thù: thiết bị chiết siêu âm (SONY MEDI SM30- CEP, Hàn Quốc), thiết bị phun sấy PG-5 (Trung Quốc), máy đo quang phổ UV-VIS, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, máy phân tích huyết học, máy xét nghiệm sinh hóa... và một số thuốc thử, hóa chất, thiết bị dụng cụ thông thường khác. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 2.2.1.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu Khảo sát các nhóm thành phần hoá học bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Lá cây ĐĐR (5kg) được chiết siêu âm với methanol; chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần. Phân lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký. Phát hiện chất bằng đèn tử 5 ngoại hoặc dùng thuốc thử, kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng các phương pháp kết hợp như: TLC, HPLC và NMR. Xác định cấu trúc hóa học dựa trên các thông số lý hóa và so sánh với các số liệu đã công bố. 2.2.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng * Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SPN bằng UV-Vis - Nguyên tắc: Saponin toàn phần trong lá ĐĐR được định lượng bằng đo quang phổ UV-Vis sau khi thực hiện phản ứng tạo màu Rosenthaler. Hàm lượng SPN được tính theo AO. - Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn AO trong MeOH nồng độ từ 100 - 300 µg/ml; dung dịch thử: 5,0 g lá ĐĐR, sau khi loại chlorophyl, chiết siêu âm 2 lần với MeOH x 2 h ở 50◦C, gom dịch chiết, thêm dung môi vừa đủ 200 ml, pha loãng 2,5 lần; lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi làm phản ứng; mẫu trắng: MeOH. - Tiến hành phản ứng tạo màu Rosenthaler: Hút chính xác 0,2 ml dung dịch thử (hoặc chuẩn hoặc trắng), cho vào ống nghiệm, rồi thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% trong acid acetic băng và 1,2 ml acid percloric. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ cách thủy ở 70oC±1oC trong khoảng thời gian thích hợp. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi chuyển vào bình định mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl acetat và bổ sung ethyl acetat vừa đủ đến vạch. - Xây dựng phương pháp: + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét phổ từ 400 tới 800 nm, chọn λmax. + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: Thực hiện phản ứng tạo màu với dãy dung dịch chuẩn làm việc AO có nồng độ: 92,50; 138,75; 185,0; 231,25; 277,50 µg/ml với thời gian ủ lần lượt là 10, 20, 6 30, 40 và 60 phút; lặp lại 6 lần, lựa chọn được thời gian phản ứng thích hợp nhất. - Thẩm định phương pháp: Xác định khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH. *Thẩm định phương pháp định lượng AO bằng HPLC - Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm); tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; thể tích tiêm: 10 µl; Detector UV: Bước sóng 215 nm; Pha động: H2O/MeOH (5/95, v/v). - Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn: AO trong MeOH nồng độ từ 10-100 µg/ml; mẫu thử: ĐĐRchiết siêu âm 5,0 g lá với MeOH x 2 lần x 2 h thu được 250 ml, lọc dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký; mẫu trắng: MeOH. - Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu của phương pháp, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): theo hướng dẫn của ICH. *Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá ĐĐR Mô tả dược liệu (hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột), mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As, Pb) theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid oleanolic bằng TLC; Định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis, định lượng AO bằng HPLC đã được thẩm định. 2.2.1.3. Phương pháp xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng * Qui trình bào chế dịch chiết - Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất: chiết siêu âm, ngấm kiệt, chiết hồi lưu, sắc truyền thống. 7 - Khảo sát các thông số qui trình chiết xuất: KTTP dược liệu, loại dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL và số lần chiết, thời gian chiết. - Sau khi cô cao, loại tạp; tiến hành kiểm nghiệm và điều chỉnh cao lỏng đựa trên chỉ tiêu tỷ lệ chất rắn trong cao và hàm lượng SPN. * Qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy - Các yếu tố / thông số khảo sát: Loại tá dược phun sấy (Mal, Aer, lactose monohydrat, Starch 1500), tỷ lệ TD/CR (10 - 30 %), nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch (120 - 150ºC, 20 - 40 ml/ phút), tỷ lệ CR/DP (10 - 20 %) - Căn cứ để lựa chọn: cảm quan hình thái bột, khối lượng riêng biểu kiến và chỉ số nén CI, mất khối lượng do làm khô, tính hút ẩm, hiệu suất thu hồi hoạt chất và hiệu suất phun sấy. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 2.2.2.1. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô lá Đu đủ rừng Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan; mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As, Pb), giới hạn nhiễm khuẩn theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid oleanolic bằng TLC; định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis, định lượng AO bằng HPLC đã được thẩm định. 2.2.2.2. Sơ bộ đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng - Điều kiện bảo quản: Thử nghiệm dài hạn (nhiệt độ 30 ± 2ºC, độ ẩm 75 ± 5%); lão hóa cấp tốc (Nhiệt độ 40 ± 2ºC, độ ẩm 75 ± 5%). Thời gian lấy mẫu: 0, 3, 6, 9, 12 tháng với thử nghiệm dài hạn và 0, 3, 6 tháng với lão hóa cấp tốc. Tiêu chuẩn đánh giá: Theo TCCS. 8 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm 2.2.3.1. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng * Mô hình đánh giá: Sử dụng mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid (cyc) trên chuột nhắt: - Chuột thí nghiệm được chia thành 5 lô, mỗi lô 8 con: Lô 1 - Chứng sinh học: chuột uống nước cất; Lô 2 - Mô hình: Chuột được tiêm Cyc + uống nước cất; Lô 3 - Chứng dương: Chuột được tiêm Cyc + uống levamisol liều 100 mg/kg; Lô 4: Chuột được tiêm Cyc + uống cao khô ĐĐR liều 1 (400 mg/kg); Lô 5: Chuột được tiêm Cyc + uống cao khô ĐĐR liều 2 (800 mg/kg). Sau khi tiêm Cyc liều 200 mg/kg ở các lô 2, 3, 4, 5, vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống nước cất và các thuốc liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột, lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm. * Xét nghiệm chức năng miễn dịch: Các chỉ số chung: khối lượng lách tương đối (KLLTĐ), khối lượng tuyến ức tương đối (KLTƯTĐ); Số lượng BC chung, BC lympho và BCTT, làm giải phẫu vi thể lách và tuyến ức. Các thông số đánh giá miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào: đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA qua bề dày bàn chân chuột, định lượng IgG, cytokin IL-2 và TNF-α. 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng * Độc tính cấp: tiến hành tên chuột nhắt trắng (10 lô, mỗi lô 10 con), cho uống Cao khô ĐĐR (hòa tan với nước) với các mức liều tăng dần, xác định tỷ lệ chuột chết trong 72 h, theo dõi cho đến hết 9 thời gian 7 ngày. LD50 được tính bằng phương pháp dùng Excel, sau đó có kiểm chứng lại bằng phương pháp Litchfield-Wilcoxon. * Độc tính bán trường diễn: Tiến hành trên chuột cống trắng (3 lô, mỗi lô 10 con: lô chứng - sinh lý: uống nước cất; lô trị 1: uống cao khô lá ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày; lô trị 2: uống cao khô lá ĐĐR liều 720 mg/kg/ngày). Các chỉ tiêu đánh giá: tình trạng chung của chuột, các chỉ số huyết học, sinh hóa, quan sát hình ảnh đại thể gan, lách, thận ngày thứ 90. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính làm chất đánh dấu Thực hiện khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ cho thấy saponin là thành phần chính của lá ĐĐR. Chiết xuất, phân lập đã xác định được 6 hợp chất saponin triterpenoid thuộc dẫn xuất của acid oleanolic và acid ursolic; trong đó có 4 hợp chất saponin đã biết là acid oleanolic, ilekudinosid C, kalopanaxsaponin H, và davisianosid B và 2 hợp chất mới được đặt tên là acetyltrevesiasaponin A và acetyltrevesiasaponin B . 3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng làm nguyên liệu chiết xuất 3.1.2.1. Kết quả xấy dựng và thẩm định các phương pháp định lượng chất đánh dấu trong lá Đu đủ rừng * Phương pháp định lượng SPN trong lá ĐĐR bằng UV-Vis - Xây dựng phương pháp 10 + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét bước sóng từ 400 -800 nm, có cực đại hấp thụ ở 550 nm. + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: kết quả cho thấy trong các mẫu có hệ số tương quan cao thì ở mẫu có thời gian phản ứng là 40 phút có độ hấp thụ quang cao nhất. Do vậy, đề tài lựa chọn thời gian để làm phản ứng màu là 40 phút để khảo sát tiếp. - Thẩm định phương pháp + Xác định khoảng tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ AO khảo sát, độ hấp thụ và lượng AO có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan r2 = 0,9986 và phương trình hồi qui tuyến tính là Y = 0,0742 X – 0,0364. + Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy các giá trị RSD trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn 2,21%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại trong ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 92,67% - 97,11%, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích. * Phương pháp định lượng AO bằng HPLC - Kết quả thẩm định + Tính tương thích hệ thống: Kết quả cho thấy: RSD về thời gian lưu và diện tích pic của acid oleanolic đều nhỏ hơn 2%. Giá trị số đĩa lý thuyết cao N>20.000 và hệ số bất đối xứng píc khoảng 1,15. Như vậy, phương pháp phân tích này là tương thích với hệ thống sắc ký. + Tính đặc hiệu của phương pháp: sắc đồ của mẫu thử có píc trùng với thời gian lưu của chuẩn AO; trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện píc nào tại thời gian lưu của AO. So sánh phổ của píc chất AO trên sắc đồ chuẩn và píc có cùng thời gian lưu trong mẫu thử cho 11 thấy 2 phổ này chồng khít với mức tương quan 99%, chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao. + Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát (từ 11,13 đến 111,25 µg/ml) có mối liên quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Đường hồi qui y = 11333 x – 9726,9 với r2 =0,9972. + Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với các giá trị RSD trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn 3,3%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ % tìm lại trong ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 96,30 - 99,05%, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích. + Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): kết quả thu được LOD = 0,0122 µg/ml và LOQ = 0,04 µg/ml. 3.1.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng TCCS dược liệu được đề xuất có các chỉ tiêu như sau: Mô tả dược liệu: hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột; mất khối lượng do làm khô (≤12%); tro toàn phần (10%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); định tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 15 mg/g tính theo AO bằng UV – Vis, hàm lượng AO ≥ 750 µg/g bằng HPLC. 3.1.3. Kết quả xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 3.1.3.1. Kết quả xây dựng qui trình bào chế dịch chiết lá Đu đủ rừng Từ kết quả khảo sát đã lựa chọn được các thông số của qui trình chiết xuất dịch chiết lá ĐĐR bằng phương pháp chiết siêu âm như sau: 12 Bảng 3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương pháp chiết siêu âm STT Phương pháp/ thông số Thiết bị/ thông số 1 Chiết siêu âm Thiết bị SM30-CEP 2 Bột khô lá ĐĐR Kích thước 0,5 - 1mm 3 Dung môi chiết Ethanol 50º 4 Nhiệt độ chiết 70ºC 5 Số lần chiết 2 lần 6 Tỷ lệ DM/ DL 15ml/1g/ lần x 2 lần 7 Thời gian chiết 90 phút/ lần x 2 lần Tiến hành chiết xuất qui mô 2 kg/mẻ x 3 mẻ chiết khác nhau. Tiến hành cô cao, loại tạp (lọc qua vải dày, cô thu hồi dung môi (70ºC, áp suất giảm, cô tới cao 3:1, để lắng 24h, gạn. Cắn được thêm EtOH gấp 5 lần, lắng, gạn, lọc điều chỉnh về cao 3:1) kết quả thu được như sau: Bảng 3.20. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1 Nội dung Lá ĐĐR Dịch chiết Cao 3:1 chưa loại tạp Cao 3:1 đã loại tạp Khối lượng, thể tích 5,48 kg 170,0 lít 1,83 kg 1,83 kg SPN(1) 22390 µg/g 683,98 µg/ml 156,00 ± 4,61 mg/g 205,67 ± 4,45 mg/g Khối lượng SPN 123,28 g 116,28 g 102,33 g 94,77 g Tỷ lệ cắn khô trong cao 35,93% 25,24% Hiệu suất chiết, cô cao tính theo SPN 83,44% - Hiệu suất chiết, cô và loại tạp tính theo SPN 77,27% Tỷ lệ làm giàu SPN 131,84% (1): hàm lượng SPN trong 1 g chất rắn trong cao tính theo khô kiệt. 13 Kết quả cho thấy: Hàm lượng SPN trong cao 3:1 chưa loại tạp là 156,00 ± 4,61 mg/g. Sau khi loại tạp, cô đặc và điều chỉnh về cao 3:1 cho hàm lượng saponin toàn phần là 205,67 ± 4,45 mg/g. Tỷ lệ làm giàu SPN là 131,84%. 3.1.3.2. Kết quả bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy Từ kết quả khảo sát, đã lựa chọn được công thức và thông số của qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy như sau: Bảng 3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy STT Tên thông số Thông số 1 Dịch phun sấy Cao lá ĐĐR (3:1) phối hợp thêm tá dược 2 Tá dược phun sấy Aerosil 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% 4 Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ CR/DP 14% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar 14 Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR như sau: Hình 3.12. Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lá đu đủ rừng 3:1 Dịch chiết ĐĐR 1+2 Chiết siêu âm lần 1 Dịch chiết ĐĐR 1 Dịch chiết ĐĐR 2 Bã ĐĐR 2 Bã ĐĐR 1 Chiết siêu âm lần 2 DM/DL = 15ml/1g 700C, 90 phút Cô thu hồi dung môi DM/DL = 15ml/1g 700C, 90 phút EtOH thu hồi Cao ĐĐR 3:1 Phần dịch lỏng 1 Phần cắn 1 EtOH 96º Phần dịch lỏng 2 Phần cắn 2 Để lắng, gạn Để lắng, gạn Cao ĐĐR 3:1 Cô thu hồi dung môi EtOH 50º Gạn, lọc Kiểm nghiệm: - Hàm lượng SPN: 165 - 245 mg/g - Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% Bột lá ĐĐR Đạt TCCS Gạn, lọc 15 Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy 3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ rừng Tiến hành trên 3 lô cao khô (mỗi lô 2 mẻ chiết, mỗi mẻ 2 kg dược liệu); kết quả đề xuất TCCS của cao khô lá ĐĐR gồm các chỉ Dịch phun sấy Cao khô lá ĐĐR Đóng gói Cao ĐĐR 3:1 Phun sấy Nhiệt độ đầu vào 130 ± 20C Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar. - Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; - Khuấy đều đồng nhất Cấp dịch phun (30ml/phút) Kiểm nghiệm theo TCCS 16 tiêu sau: tính chất (khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng); mất khối lượng do làm khô (≤5%); tro toàn phần (15%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); độ nhiễm khuẩn (đạt mức 4, phương pháp đĩa thạch DĐVN V); định tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 100 mg/g và ≤ 200 mg/g tính theo AO bằng UV – Vis; hàm lượng AO ≥ 7,5 mg/g và ≤ 12,5 mg/g bằng HPLC tính theo chế phẩm khô kiệt. 3.2.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng Kết quả cho thấy, tất cả các tiêu chí đánh giá sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 12 tháng ở điều kiện dài hạn ít có sự thay đổi, đều đạt TCCS của chế phẩm. 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng - Trên các chỉ số miễn dịch chung: Cao khô lá ĐĐR cả hai liều 400 và 800 mg/kg đều không có tác dụng gây tăng khối lượng các cơ quan lympho, đều gây tăng tế bào BC lympho. ĐĐR liều 1 làm tăng số lượng bạch cầu ngoại vi, tăng số lượng tế bào BCTT. Trong khi liều 2 lại làm giảm số lượng bạch cầu chung, làm giảm BCTT. - Trên các chỉ số miễn dịch dịch thể: Cao khô lá ĐĐR hai liều đều có tác dụng làm tăng nồng độ IgG trong máu ngoại vi. - Trên các chỉ số miễn dịch qua trung gian tế bào: Cao khô lá ĐĐR cả hai liều đều có tác dụng tăng khả năng chế tiết các cytokin 17 IL-2, liều 1 có tác dụng giảm tiết TNF-α, tuy nhiên ở liều 2 lại gây tăng tiết TNF-α. 3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng 3.3.2.1. Độc tính cấp Kết quả cho thấy giữa tỷ lệ % chuột chết và mức liều dùng cao khô lá ĐĐR theo hàm số mũ có tương quan chặt chẽ với hệ số tương quan r² = 0,9707 theo phương trình y = 4,738e0,016x. Từ đó tính được LD50 = 10,54 (8,79 – 12,65) g cao khô lá ĐĐR/kg, lớn gấp 26,35 lần so với liều dự kiến có tác dụng. 3.3.2.2. Độc tính bán trường diễn Trên các lô chuột dùng cao khô lá ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày và liều 720mg/kg/ngày, theo dõi trong 90 ngày liên tục, cho thấy: chuột khỏe mạnh, tăng trọng tốt, đều; không làm thay đổi các chỉ số huyết học; không làm thay đổi các chỉ tiêu sinh hóa đánh giá chức năng gan, thận; không gây tổn thương mô bệnh học gan, lách, thận. Chương 4: BÀN LUẬN 4.1. Về xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 4.1.1. Về xác định nhóm chất đánh dấu Xác định được nhóm chất chính trong lá ĐĐR là saponin. Luận án đã phân lập được 6 hợp chất saponin triterpenoid; trong đó có 4 hợp chất saponin đã biết và 2 hợp chất mới; góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về hóa học cho loài này. SPN là nhóm chất có nhiều tác dụng liên quan đến miễn dịch đã được nghiên cứu. Trong số các hợp chất đã biết, thì kalopanaxsaponin H đã được nghiên cứu về một số hoạt tính như kháng khối u và gây độc tế bào ung thư. Acid oleanolic đã được chứng minh rất nhiều về các tác dụng dược lý có liên quan đến miễn dịch như chống ung thư, tiểu đường, chống viêm, bảo vệ 18 gan, chống oxy hóa, kháng khuẩn, ... Vì vậy luận án đã sử dụng SPN toàn phần và AO làm chất đánh dấu. 4.1.2. Về lựa chọn 2 phương pháp định lượng Luận án sử dụng hai phương pháp định lượng: SPN được định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, còn AO được định lượng bằng phương pháp HPLC. Việc này là cần thiết vì sẽ góp phần làm tăng sự chặt chẽ và chính xác trong đánh giá chất lượng sản phẩm. Xây dựng và thẩm định của cả 2 phuong pháp định lượng được thực hiện theo đúng hướng dẫn của ICH, kết quả cho thấy qui trình định lượng đảm bảo được yêu cầu của phương pháp phân tích. 4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng Hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nhiều công bố nghiên cứu về ĐĐR, chưa có chuyên luận về ĐĐR trong các Dược Điển. Trong nghiên cứu này, từ mẫu thu hái tại 5 tỉnh, chúng tôi đã đề xuất TCCS để đánh giá chất lượng nguyên liệu lá ĐĐR. 4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đủ rừng Chiết siêu âm đã và đang được ứng dụng ngày càng nhiều ở qui mô phòng thí nghiệm đến công nghiệp. Kết quả so sánh giữa các phương pháp chiết xuất cho thấy phương pháp chiết siêu âm đã làm tăng rõ rệt hiệu suất chiết nhưng ở nhiệt độ thấp hơn và thời gian ngắn hơn. Trong nghiên cứu này, đã sử dụng chiết siêu âm để khảo sát với các thông số khảo sát là: KTTP dược liệu, loại dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL, nhiệt độ và thời gian chiết. Trong khuôn khổ luận án, thiết bị chiết siêu âm đã cố định về tần số sóng siêu âm là 60 kHz, nên sự ảnh hưởng của tần số sóng siêu âm (là một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết) thì chưa được khảo sát. 19 4.1.5. Về thiết bị chiết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1 Sau khi lựa chọn được thông số qui trình bào chế dịch chiết. Tiến hành chiết xuất 3 mẻ liên tục, mỗi mẻ 2kg trên thiết bị chiết xuất SM30 dung tích 30 lít, tần số siêu âm 60kHz, 8 đầu phát siêu âm, lực siêu âm 400W. Các thiết bị siêu âm thường đặc trưng bởi tần số siêu âm (thường trong khoảng 20 - 100kHz) và công suất siêu âm, nhưng cấu trúc của thiết bị cũng ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất. Trong nghiên cứu này sử dụng thiết bị siêu âm với các đầu siêu âm được gắn cố định với tần số siêu âm 60kHz nên không khảo sát được ảnh hưởng của tần số siêu âm. Do đó, khi nâng cấp qui mô với thiết bị có tần số siêu âm khác cần tính toán và đánh giá lại các thông số qui trình để đạt được mục đích chiết xuất mong muốn. 4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy Trong luận án này, phương pháp phun sấy được lựa chọn để bào chế cao khô lá ĐĐR vì đây là kỹ thuật làm khô có nhiều ưu điểm, hiện đang được áp dụng rộng rãi cả ở qui mô công nghiệp trong nước. Để xây dựng qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy, cần phải khảo sát các thông số của thiết bị (nhiệt độ khí đầu vào, tốc độ cấp dịch) và thông số thuộc về dịch phun (tỷ lệ chất rắn, loại và tỷ lệ tá dược). Các thông số của sản phẩm cần đánh giá là: Mất khối lượng do làm khô, tính hút ẩm, khối lượng riêng biểu kiến, khả năng trơn chảy, hiệu suất phun sấy, hàm lượng và hiệu suất thu hồi hoạt chất. - Các tá dược lựa chọn khảo sát là Mal, Aer, hỗn hợp Mal, Aer, Starch 1500, lactose. Aer được lựa chọn vì nó có tác dụng bảo vệ hoạt chất, điều hòa độ trơn chảy, cải thiện độ hút ẩm 20 - Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng tỷ lệ Aer đã cải thiện được cả về hiệu suất phun sấy và các chỉ số lý hóa khác của sản phẩm, hiệu suất thu hồi hoạt chất cũng tăng nhẹ, chứng tỏ Aer thể hiện khả năng bảo vệ hoạt chất nhất định, nhưng hàm lượng saponin toàn phần là có xu hướng giảm dần, điều này là do hiện tượng pha loãng nồng độ. Trong đề tài này, lựa chọn tỷ lệ tá dược là 30% là phù hợp. - Kết quả khảo sát cho thấy, các công thức phun sấy ở nhiệt độ và tốc độ cấp dịch khác nhau có ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất và các tính chất hóa lý của sản phẩm. Nhiệt độ sấy cao quá cũng có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của hoạt chất, kết quả khảo sát của đề tài cho thấy hàm lượng và hiệu suất thu hồi hoạt chất có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng đến 150°C. - Dịch chiết lá ĐĐR thu được sau chiết xuất được cô về cao 3:1 có tỷ lệ chất rắn khoảng 25%, nhưng khi phun sấy được chỉnh về tỷ lệ chất rắn từ 10 - 16%. Vì khi tỷ lệ chất rắn cao quá sẽ làm tăng độ nhớt của dịch phun nên khi phun sấy sẽ khó hình thành các giọt, làm giảm hiệu suất phun sấy. Kết quả cho thấy, khi tăng tỷ lệ CR/DP hầu như không ảnh hưởng đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi SPN, nhưng lại có xu hướng cải thiện về độ ẩm, tính hút ẩm, khả năng trơn chảy. Trong đó, tỷ lệ chất rắn 14 - 16% là thích hợp nhất. 4.2. Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 4.2.1. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Sau khi nghiên cứu bào chế được cao khô lá ĐĐR luận án đã xây dựng được TCCS để chuẩn hóa chất lượng sản phẩm. Chỉ tiêu gi