Tóm tắt Luận án Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium - Nguyễn Thị Minh Hằng

độ vi khuẩn OD600 đạt 0,5 - 1,0. Vi khuẩn được thu nhận sau khi ly tâm dịch nuôi ở tốc độ 5.000 v/ph trong 15 phút. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể dùng riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm. 2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá Quá trình biến nạp được tiến hành với cây thuốc lá trồng từ 3 - 8 tuần. Cây được úp ngược và nhấn chìm toàn bộ phần lá vào bình chứa dịch khuẩn đã được chuẩn bị ở trên, tiếp theo chuyển hệ thống này vào bình hút chân không. Áp suất bình hút chân không được chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó giảm áp suất bình về áp suất không khí và mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng sinh trưởng. 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá 2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen Để đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến mức độ biểu hiện của các gen m, gp5opt và gp5ecto-m trong lá thuốc lá, dịch A. tumefaciens mang vector pCB301 chứa gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m được lây nhiễm vào lá hoặc dịch vi khuẩn này kết hợp với dịch A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV/ pIBT-35S-HC-Pro PVY, với lệ dịch (1:1) (xâm nhiễm kép). Mẫu lá được thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển. Mức độ biểu hiện gen chuyển được đánh giá bằng phương pháp lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone Thí nghiệm được bố trí với dịch A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và A. tumefaciens chứa vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, không được bổ sung AS và bổ sung AS với nồng độ 450 µM và 600 µM. 2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn được tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD600 từ 0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY, lượng dịch 2 lít với tỷ lệ 1:1) và bổ sung AS ở nồng độ 450 µM). 2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm Thí nghiệm: Lá non gồm các lá thứ 1, 2, 3 từ ngọn xuống; lá bánh tẻ gồm những lá tại vị trí chính giữa của thân cây; lá già gồm những lá 1, 2, 3 từ gốc lên. 2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây Cây thuốc lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi; các lá non và lá bánh tẻ được cho xâm nhiễm với dịch khuẩn (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A. tumefaciens mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, OD600 = 0,5) với nồng độ AS 450 µM. 2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số Protein tổng số từ mẫu lá được tách chiết bằng dịch chiết PBS và bảo quản ở -20oC. Hàm lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford (1976) với đường chuẩn được xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn đã biết trước nồng độ. 2.2.6. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot Protein hòa tan tổng số được phân tách trên gel polyacrylamide (10%) theo phương pháp của Laemmli (1970). Sau khi điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE, sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng ở 25V, 1.3A trong 20 phút. Màng chứa kháng nguyên được phủ bằng sữa tách bơ 5% (pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween) trong 5h; màng được ủ với kháng thể kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng được ủ với kháng thể 2 anti-mouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết thanh chuột) hoặc anti-pig IgG gắn peroxidase (đối với các mẫu huyết thanh lợn). Phát hiện sự có mặt của kháng nguyên tái tổ hợp bằng cách ngâm màng lai trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB trong 15 phút (Phan, 2012). 2.2.7. Tinh sạch protein M, GP5 và GP5ectoM 2.2.7. 1. Tối ưu nồng độ PEG trong quá trình thu nhận protein đích Thí nghiệm: PEG 8000 được bổ sung ở dải nồng độ (2% - 10%) vào 2 ml dịch chiết lá thực vật chuyển gen. Dịch chiết lá sau đó được ly tâm ở 13.000 v/p, trong 30 phút, ở 4oC. Protein dịch được biến tính và kiểm tra mức độ thu nhận protein đích bằng lai Western blot. 2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp mITC Protein tái tổ hợp gắn ELP được tinh sạch bằng phương pháp mITC theo phương pháp của Phan, 2012. 2.2.7.2. Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFv-cmyc) đã biết trước hàm lượng và đo bằng phương pháp Bradford. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 2.2.8.1. Gây miễn dịch trên chuột Kháng nguyên tái tổ hợp sau khi tinh sạch được sử dụng để gây miễn dịch trên chuột bạch 6 tuần tuổi với hàm lượng 5 µg/con chuột. Kháng nguyên được trộn đều, đồng nhất với chất bổ trợ với tỷ lệ 1:1. Chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc (đối chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3: Tiêm kháng nguyên M-ELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5-ELP; nhóm 5: Tiêm kháng nguyên GP5ectoM-ELP. Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3, 4, 5 được tiêm nhắc lại 3 lần. Mẫu máu được lấy để chiết huyết thanh tại ba thời điểm: Ngày 0 (Trước khi tiêm), 21 và 35. Phân tích huyết thanh chuột sau 2 lần tiêm và sau 3 lần tiêm bằng ELISA và Western blot. 2.2.8.2. Gây miễn dịch trên lợn Lợn con 3 tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng PRRSV được chia thành bốn nhóm, mỗi nhóm 3 con lợn. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết lá thuốc lá không chuyển gen (WT); nhóm 3: Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5-ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5ectoM-ELP (150 µg/ml). Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3 và 4 được tiêm nhắc lại 3 lần: ngày 0, 14 và 28. 2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong huyết thanh lợn Mẫu máu của lợn được lấy để chiết huyết thanh tại bốn thời điểm: Ngày 0, 14, 28, 35 và 49. Các huyết thanh chiết từ các mẫu máu của lợn thí nghiệm được sử dụng với vai trò là kháng thể 1 cho việc xác định kháng thể IgG đặc hiệu bằng ELISA, Western blot và phản ứng IPMA. Tất cả các huyết thanh lợn đã được pha loãng 20 lần. Khả năng sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu của từng loại kháng nguyên tương ứng được tính toán sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3. Phương pháp ELISA: Để kiểm tra các kháng thể có mặt trong huyết thanh chuột/lợn, sử dụng các phiến ELISA giám sát dịch tễ huyết thanh học của PRRS đã được gắn sẵn các kháng nguyên của PRRSV tự nhiên. Tiếp theo đĩa được phủ với huyết thanh (đã được pha loãng 100 lần), trong 2 giờ; rửa đĩa 5 lần với PBS 1X; phủ đĩa với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (kháng thể 2) với độ pha loãng 500 lần, trong 2 giờ; rửa lại bằng dung dịch PBS 1X 5 lần. Đĩa được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất TMB, 15 phút, sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau đó cố định màu bằng HCl 1N, màu của phản ứng được đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp Western blot: Phản ứng lai Western được thực hiện như mục 2.2.6.2 với thay đổi kháng thể thứ nhất được dùng trong trường hợp này là kháng thể trong huyết thanh của chuột/lợn. Lai miễn dịch chéo: Phản ứng Western blot được thực hiện với kháng nguyên tái tổ hợp; kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm chuột/lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; kháng thể thứ cấp là anti-mouse IgG gắn HRP (Đối với huyết thanh chuột)/ anti-pig IgG gắn peroxidase (Đối với huyết thanh lợn). Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp (IPMA): Phương pháp thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-21:2014 về Bệnh động vật. Xử lý và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm: Phân tích thống kê được thực hiện trên chương trình Ecxel sử dụng phương pháp Student’ t-test p ≤ 0,05 là có ý nghĩa thống kê. 2.3. Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Trung tâm chẩn đoán thú y TƯ. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng Agrobacterium mang vector 3.1.1. Vector pCB301 mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp Elastin like -polypeptide (M-ELP) 3.1.1.1. Tạo vector pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP Gen m (528 bp) được khuếch bằng PCR và ghép nối thành công vào vector pRTRA tạo thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP; sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli. Kết quả đã được kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới hạn (Hình 3.1). Vector pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP và vector chuyển gen pCB301 được xử lý bằng cùng HindIII; sản phẩm thu được là: Đoạn DNA gồm cấu trúc 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP có kích thước khoảng 3,0 kb và khung vector pCB301 mở vòng có kích thước khoảng 5,5 kb. Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. (A): Sản phẩm PCR nhân gen m; (B): Sản phẩm colony-PCR chọn dòng vi khuẩn; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI.3.1.1.2. Thiết kế vector pCB301 35S- m-Histag-Cmyc-100xELP Khung vector pCB301 được ghép nối với cấu trúc cassette 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP tạo vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. Kết quả kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới hạn (3.2) cho thấy đã thiết kế thành công vector pCB301 mang cassette 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều với cassete gen chọn lọc (Nos pro-nptIII-Nos ter). Vector chuyển gen có cassette đảo chiều này được dùng để biến nạp vào A. tumefacines phục vụ cho thí nghiệm biểu hiện tạm thời. XXXb XXX﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽hoá protein M g) aXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX i.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXi.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHình 3.2. Kết quả thiết kế vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều với cassete Nos pro-nptIII-Nos ter. Vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1. Kết quả đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP. 3.1.2. Vector chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5-ELP 3.1.2.1. Tạo vector pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP Gen gp5opt (510 bp) được khuếch đại bằng PCR và ghép nối vào vector pRTRA; sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli. Hình 3.3. Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP. (A): PCR nhân gen gp5opt; (B): Sản phẩm colony-PCR chọn dòng vi khuẩn mang pRTRA tái tổ hợp; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR và bằng cắt enzyme giới hạn cho thấy đã tạo thành công pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP (Hình 3.3). 3.1.2.2. Thiết kế vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP Kết quả đã thiết kế thành công vector pCB301có cassette gen 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pro-nptIII-NOS ter (Hình 3.4). Hình 3.4. Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP. (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều. Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. 3.1.3. Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoM-ELP 3.1.3.1. Tạo vector pRTRA 35S- gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho một đoạn protein GP5 vùng ngoại bào (GP5 ectodomain) và gen m (528 bp) mã hóa protein M được khuếch đại đơn lẻ bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng. Sản phẩm PCR nhân gen gp5ecto được cắt bằng NcoI và pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen m được cắt bằng pspOMI và BamHI và đồng thời cắt vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP bằng NcoI và BamHI; sau đó, ghép nối 3 sản phẩm cắt này với nhau đã tạo được vector tái tổ hợp pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP (Hình 3.5). Hình 3.5. Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. 3.1.3.2. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m -Histag-Cmyc-100xELP Kết quả cắt vector pRTRA-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và vector pCB301 bằng HindIII, sau đó ghép nối cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP với khung vector pCB301 mở vòng đã tạo được vector pCB301 mang cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng kháng sinh (NOS pro-nptIII-NOS ter) (Hình 3.6). Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp ELP. 3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5, GP5ectoM dung hợp ELP trong cây thuốc lá 3.2.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Kết quả cho thấy, vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY mang gen mã hóa protein Hc-Pro PVY hỗ trợ tăng cường biểu hiện kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ecto-M tốt hơn so vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV mang gen mã hóa protein 2b CMV (Hình 3.7). Vì vậy, Hc-Pro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV và pIBT-35S-HC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Thí nghiệm với 2 nồng độ AS là 450 µM và 600 µM; kết quả cho thấy sử dụng nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8). Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 3.2.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được xác định bằng lai Western. Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5 và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELPở lá thuốc lá (Hình 3.9). 3.2.4. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp. Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot. 3.2.5. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 - 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu. Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot. 3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá các protein tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong điều kiện đã được tối ưuu kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXu kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXu kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXu kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn đã được định lượng H5-pII. Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP, tương ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12). Tinh sạch protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch Nồng độ 6% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên M-ELP là tốt nhất (Hình 3.13). Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M-ELP. Kết quả cho thấy, nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5-ELP là tốt nhất (Hình 3.14). Hình 3.14. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5-ELP. Nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM-ELP là tốt nhất (Hình 3.15). Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM-ELP. 3.3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp mITC 3.3.2.1. Tinh sạch protein M-ELP Hình 3.16. Đánh giá sự tinh sạch của protein M-ELP bằng SDS-PAGE và lai miễn dịch. A, B: 1: Dịch chiết thô trước xử lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M-ELP tách rửa khỏi màng; (C): Protein M-ELP thu nhận được sau khi tinh sạch. Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein M-ELP tái tổ hợp (66 kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16). Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein M-ELP (hình 3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1%. 1 2 3 4 5 6 Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp M-ELP bằng lai miễn dịch. ScFV-Cmyc (đối chứng dương) được đưa vào giếng với các nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng. 3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5-ELP Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5-ELP tái tổ hợp bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5-ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1%. Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5-ELP bằng lai Western blot và điện di SDS-PAGE. Hình 3.19. Định lượng protein tái tổ hợp GP5-ELP bằng lai Western blot và hàm lượng ScFV-Cmyc. 3.4.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5ectoM-ELP tái tổ hợp bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.20). Hiệu suất thu hồi protein GP5-ELP là 95%, mức độ tinh sạch là 98%. Hình 3.20. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ectoM-ELP bằng lai Western blot và điện di SDS-PAGE. Hình 3.21. Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoM-ELP bằng lai Western blot và ScFV. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 3.5.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 3.5.1.1. Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu của kháng M-ELP Hình 3.22. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột được tiêm M-ELP bằng ELISA; Giá trị ELISA trung bình của huyết thanh chuột có độ lệch chuẩn được thể hiện ở từng chấm đen. Một chấm đen là giá trị ELISA của một con chuột. Thanh ngang là giá trị trung bình của nhóm chuột (3 con chuột/nhóm) (*: P≤0.05). Kết quả cho thấy, kháng nguyên M-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.22) và sau 3 lần tiêm phát hiện bằng lai Western blot (Hình 3.23). Hình 3.23. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng M-ELP trong huyết thanh chuột. A: Lai miễn dịch chéo, kháng nguyên là M-ELP, kháng thể sơ cấp là huyết thanh thu từ nhóm được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là anti-mouse IgG gắn HRP, B và C: Sau 2, 3 lần tiêm M-ELP và PBS. 3.5.1.2. Khả năng tạo kháng thể đặc hiệu IgG của kháng nguyên GP5-ELP Kết quả cho thấy, kháng nguyên GP5-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.24) và lai Western blot (Hình 3.25). Hình 3.24. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột được tiêm GP5-ELP bằng kỹ thuật ELISA. Hình 3.25. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5-ELP trong huyết thanh chuột. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng nguyên GP5ectoM-ELP Kết quả cho thấy, kháng nguyên GP5ectoM-ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.25) và lai Western blot (Hình 3.27). Hình 3.26. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột được tiêm GP5ectoM-ELP bằng kỹ thuật ELISA. Từ kết quả phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng ELISA và Western blot trong huyết thanh chuột, cho thấy 3 loại kháng nguyên có khả năng kích thích hình thành kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột. Hình 3.27. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM-ELP trong huyết thanh chuột. Gây miễn dịch trên lợn Dựa trên các kết quả đạt được trên chuột, hai loại kháng nguyên là GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được lựa chọn để tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch trên lợn. Kháng nguyên GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được định lượng bằng lai Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5-pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc (Hình 3.28). Từ kết quả định lượng này, hai loại kháng nguyên được chuẩn về nồng độ 150 µg/ml mỗi loại và gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm. u kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX u kháng , 400 ng, 800, 1000 ng XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX Hình 3.28. Kết quả định lượng các protein GP5-ELP, GP5ectoM-ELP bằng lai Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5-pII)3 bằng kháng thể kháng Cmyc. 3.5.2.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5-ELP Hình 3.29. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn được tiêm GP5-ELP bằng phản ứng ELISA. Kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được phân tích ở ngày thứ 28 (sau 2 lần tiêm kháng nguyên) và ngày thứ 35 (sau 3 lần tiêm kháng nguyên) được xác định bằng phản ứng ELISA (Hình 3.32) và lai West