Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam

thành phần đường chính là fucose và galactose cùng một lượng lớn sulfat được gọi là các galactofucan sulfat hóa. Trong khi đó fucoidan của một số loài rong nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sống ở vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus vesiculosus trong thành phần của chúng chỉ chứa fucose và sulfat được gọi là các fucan sulfat hóa [68,35]. Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi được trình bày trên Hình 4.4. Phổ có nhiều tín hiệu mạnh ở vùng anomeric (99.7 - 103.18 ppm) và ở vùng từ trường cao (15.40 ppm và 16.16 ppm) là tín hiệu điển hình của gốc α-L-fucopyranoside. Các tín hiệu trong vùng 67 -84 ppm là của các nguyên tử C2 - C5 của vòng pyranoid. Các tín hiệu ở 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH của gốc β-D- galactopyranose và tín hiệu ở 65.0 ppm là của nhóm CH2OR được cho là của gốc O-6-β-D-galactopyranose. Một số tín hiệu mạnh ở 173.7 - 174.6 ppm và 20.92 ppm khẳng định sự hiện diện của nhóm O-acetyl. Phổ 1H-NMR của F2 bao gồm một vài tín hiệu mạnh trong vùng α-anomeric (5.09 - 5.23 ppm) và vùng trường cao (1-1.5 ppm). Trong khi đó tín hiệu trong vùng 2.0 - 2.2 ppm xác định sự hiện diện của nhóm O- acetyl. 8 Cấu trúc của fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi của Malaysia đã được nghiên cứu và công bố vào năm 2016 [84]. 4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum Kết quả xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy 2 phân đoạn SDAuF1 và SDAuF2 đều có đường fucose và galactose là các thành phần đường trung tính chính. Fucose của phân đoạn SDAuF2 cao hơn (59,5 %) phân đoạn SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 không có sự xuất hiện của đường mannose. Cả 2 phân đoạn không có sự xuất hiện đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm lượng xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ. Fucoidan tổng FSDu được phân lập từ rong nâu S. duplicatum với hiệu suất 2,28% theo phươn pháp của Bilan và cs.. Trên phổ hồng ngoại IR chỉ ra ở hình 4.6 của FSDu xuất hiện tín hiệu hấp thụ ở 1.244 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên kết S=O). Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S ở 800-845 cm-1 không được thể hiện rõ. Giống như nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác trên thế giới, fucoidan FSDu từ rong nâu S. duplicatum cũng có phổ 1H-NMR rất phức tạp do có rất nhiều pic chồng chất lên nhau (Hình 4.7.). Tuy nhiên trên phổ 1H-NMR cũng có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan. Đó là các tín hiệu xuất hiện trong vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) và các tín hiệu ở vùng trường cao (1,2 - 1,5 ppm) của nhóm CH3 của vòng α-L-Fucopyranose. Trên phổ 1H-NMR của fucoidan từ rong nâu S. duplicatum cũng xuất hiện những tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết fucoidan. Đó là các tín hiệu ở vùng 1,2 - 1,4 ppm (nhóm methyl của fucose) và 5,1-5,3 ppm (H-anomer của gốc →3)-α-L-Fucp(1). Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 và H-6 của gốc β-D-galactose. Ngoài ra tín hiệu ở 2,1 - 2,3 ppm còn xác nhận sự có mặt của nhóm O-acetyl trong phân tử của fucoidan này. Trong một công trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc chính xác của fucoidan FSDu đã được xác định bới Usoltseva và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nga ở Viễn đông [113]. Theo đó fucoidan này là một galactofucan sulfat hóa và acetyl hóa. FSDu có cấu trúc phân nhánh rất phức tạp làm cho các phổ NMR của nó rất khó giải thích. Mạch chính của nó được cấu tạo chủ yếu bởi các gốc 4)-α-L- Fuc-(1 và β-D-Gal luân phiên liên kết với nhau. Mạch nhánh liên kết với O-6 của galactose và cấu tạo bởi các gốc fucose có liên kết mạch ở O-3 và có các nhóm thế sulfat ở các vị trí O-2 và O-4. Mạch nhánh có đến 5 gốc đường hoặc có thể nhiều hơn nữa. Kết luận chung cho các nội dung nghiên cứu 4.2. và 4.3. nhằm lựa chọn đối tượng rong nâu để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính:  Kết quả phân tích fucoidan và các thành phần polysaccharid tan trong nước khác chỉ ra rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfat hóa. Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan 9 sulfat hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút,... [95].  Các fucoidan tách chiết và phân lập từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticarpum và Sargassum binderi là các fucogalactan sulfat hóa chứa nhóm este sulfat và nhóm axít uronic, cùng các thành phần đường chính là fucose và galactose, với một lượng nhỏ các đường đơn mannose, xylose và glucose. Cấu trúc của các fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum và Sargassum binderi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng [84,113].  Sau khi nghiên cứu thành phần hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu chúng tôi chọn các đại diện của mỗi chi Sargassum, Turbinaria mỗi loài đại diện để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Các loài đó bao gồm Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens. Các loài này cũng là loài rong nâu tương đối phổ biến ở biển Việt Nam nói chung và vịnh Nha Trang nói riêng.  Đại diện cho chi rong nâu Turbinaria chúng tôi chọn loài rong nâu Turbinaria decurrens vì loài này chưa có nhà khoa học nào nghiên cứu ra cấu trúc hoàn thiện của chúng.  Đại diện cho chi Sargassum chúng tôi chọn loài rong nâu Sargassum aquifolium vì loài rong nâu này chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Mặt khác fucoidan này có thêm một thành phần cấu tạo là axít uronic. Điều này hứa hẹn khả năng tìm ra một dạng cấu trúc fucoidan có tính mới cao. 4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium. 4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan Tương tự như các fucoidan khác, FSA là một hỗn hợp của nhiều polysaccharid anionic khác nhau về thành phần cấu tạo và mật độ điện tích, vì thế chúng có thể được tách ra thành các phân đoạn có tính chất đồng nhất hơn bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Cụ thể FSA đã được tách thành các phân đoạn có hàm lượng sulfate tăng dần trên cột sắc ký trao đổi anion như sau:  FSA là một hỗn hợp không đồng nhất của các polysaccharide có các đặc trưng về thành phần cấu tạo khác nhau.  Hàm lượng sulfat của các phân đoạn tăng dần lên cùng với nồng độ của dung dịch muối rửa giải, trong khi hàm lượng của axít uronic giảm dần đi.  Phân đoạn FSA-0.5M (4,7% tính theo FSA) có hàm lượng axít uronic và glucose cao có thể được giải thích bởi sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu là alginat và laminaran.  Phân đoạn chính là FSA-1.0M (21,9% tính theo FSA) có các thành phần đường đơn đặc biệt phức tạp với sự có mặt đáng kể của fucose, galactose, xylose và mannose, ngoài ra còn thêm lượng lớn các nhóm sulfat và axit uronic.  Phân đoạn FSA-1.5M (9,8% tính theo FSA) cấu tạo chủ yếu từ các thành phần chính là fucose, galactose và sulfat. Các thành phần khác chỉ có hàm lượng nhỏ. 10  Phân đoạn FSA-2M (2,3% tính theo FSA) có thành phần cấu tạo đơn giản nhất, gần như chỉ gồm fucose, galactose và sulfat. Tuy nhiên hàm lượng của nó trong FSA lại quá nhỏ. 4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan 4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation) Kết quả xác định thành phần của các sản phẩm (Bảng 4.6) cho thấy 1,0M-deS tuy còn chứa một lượng vết sulfat, các thành phần đường đơn của nó đã tăng lên như mong đợi, tuy nhiên hàm lượng tương đối của fucose lại giảm đi rõ rệt. Nguyên nhân có thể là do đã xảy ra phản ứng chia cắt một phần các liên kết glycosid yếu của fucose. Bảng 4.6. Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M). Fucoidan H% Fuc Xyl Man Glc Gal Axít Uronic SO3Na FSA-1.0M 21.9b 15.9 5.9 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 1.0MdeS 8.1 4.0 7.8 4.3 14.0 30.6 2.8 FSA-1.5M 9.8b 19.2 4.6 2.2 1.7 25.5 5.3 29.2 1.5MdeS 12.8 5.3 2.7 1.8 31.6 10.4 4.1 b % của FSA 4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA Phổ NMR cung cấp các thông tin quí giá về cấu trúc của các polysaccharid, nhưng việc áp dụng các phương pháp của CHTHN trên các fucoidan chiết xuất từ tảo biển bị hạn chế bởi sự đa dạng của các thành phần phân tử của chúng [7]. Thực tế chỉ có một số rất ít công bố về kết quả giải trực tiếp cấu trúc của fucoidan tự nhiên chưa bị biến đổi bằng các kỹ thuật NMR [31]. Cách tiếp cận thực tế hơn là kết hợp các phép phân tích CHTHN và hóa học để xác định các yếu tố cấu trúc của cả polysaccharid tự nhiên và polysaccharid đã tách loại sulfat. Riêng trong trường hợp FSA và các phân đoạn sắc ký trao đổi anion của nó, các phổ NMR quá phức tạp (Hình 4.11, 4.12, 4.13 và phụ lục), không thể sử dụng trực tiếp để giải cấu trúc được. Ngay cả phân đoạn FSA-2.0M (một galactofucan sulfat hóa) có thành phần đơn giản nhất, phổ 13C-NMR của nó cũng chỉ ra tối thiểu là sáu tín hiệu trong vùng C-anomer 105-95 ppm cũng như cùng một số lượng các tín hiệu C-methyl của các gốc fucose trong vùng 20-17 ppm (Hình 4.11). Kết hợp với việc các tín hiệu ứng với các nhóm CH2OH tự do của galactose vắng mặt, các dữ kiện này cho thấy FSA-2.0M có cấu trúc phân nhánh không có qui luật, mức độ phân nhánh rất cao, các nhóm sulfat gắn với nhiều vị trí khác nhau, các đường đơn gắn kết với nhau theo nhiều kiểu khác nhau. Phù hợp với dự đoán từ thành phần cấu tạo đa dạng, phổ 13C-NMR của phân đoạn FSA-1.5M còn phức tạp hơn (Hình 4.12). Cụ thể trên phổ xuất hiện nhiều tín hiệu hơn ở vùng C-anomer. Một số tín hiệu xuất hiện trong vùng CH2OH không thế ở 63-61 ppm. 11 Trên phổ NMR của phân đoạn FSA-1.0M (Hình 4.13) xuất hiện cụm tín hiệu ở vùng 17 ppm ứng với nhóm methyl của các gốc fucose. Tại vùng C-anomer (110 - 95 ppm) xuất hiện rất nhiều tín hiệu với cường độ gần tương đương nhau chứng tỏ sự có mặt của nhiều loại đường cũng như của nhiều kiểu liên kết glycosid trong mẫu nghiên cứu. Trong phổ cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm CH2OH của galatose không thế trong vùng 63-61 ppm và của nhóm cacboxyl của axit uronic tại 175,6 ppm. Phổ 1H-NMR của FSA và của tất cả các phân đoạn sắc ký đều không tách bạch, vì thế không thể áp dụng kỹ thuật HMBC để gán đặc điểm cấu trúc cho các tín hiệu. 4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis) Kết quả phân tích cho thấy có 3 dẫn xuất của xylose, 9 dẫn xuất của fucose và 16 dẫn xuất của hexose (manose và galactose) đã được phát hiện. Thành phần của chúng trong các đối tượng nghiên cứu được trình bày trên Bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa Vị trí nhóm О- Me trong: Suy diễn vị trí của nhóm thế FSA-1.0M , mol% 1.0MdeS, mol% FSA- 1.5M , mol% 1.5MdeS, mol% Xyl: 2,3,4 2,4 2,3(3,4) Xylp→ →3Xylp→ 3 2 tr. 10 - 3* 2 tr. 4 4 7 Fuc: 2,3,5 2,3,4 2,3 3,5 2,4 2 3 4 Fuc Fucf→ Fucp→ →4(5)Fucp(f)→ →2Fucf→ →3Fucp→ →3,4(5)Fucp(f)→ →2,4(5)Fucp(f)→ →2,3Fucp→ →2,3,4Fuc→ 1 3 6 - 6 6 9 - 4 1 14 6 - 6 1 1 3 - 2 4 3 3 3** 11 7*** + 9 1 7 4 - 6 2 - - - Hex: 2,3,4,6-Man 2,3,4,6-Gal 3,4,6 Manp→ Galp→ →2Hexp→ tr. 1 - 2 5 5 tr. 2 - 1 12 - 12 2,3,6 2,3,6 2,4,6 2,3,4 2,6 4,6 3,6+4,6 3,6 2,3 2,4 3,4+2,4 2 4 3 3(4) 3(4) Gal →4Hexp→ →4Hexp→ →3Hexp→ →6Hexp→ →3,4Hexp→ →2,3Hexp→ →2,4Hexp→ →4,6Hexp→ →3,6Hexp→ →3,4,6Hexp→ →2,3,6Hexp→ →2,4,6Hexp→ 4 3 4 2 7 8 3 3 2 5 - 5 - - 9 9 1 10 4 6 4 - 9 - 3 2 3 - tr. 1 1 - 2 1 1 8 7 1 tr. tr. 1 10 10 2 2 5 15 2 - 21 2 3 2 2 3 - 2 4 Các kết quả phân tích trình bày trên Bảng 4.7 cho thấy:  Có khá nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ các gốc fucofuranose. Đây là điểm đặc biệt vì trước đây chỉ có một trường hợp tìm thấy sự có mặt một lượng đáng kể của fucofuranose trong loài Chordaria flagelliformis [8].  Các polysaccharid sulfat hóa bao gồm chủ yếu các gốc fucose thế hai, thậm chí đến ba lần. Như vậy, khi nằm trong chuỗi mạch thẳng chúng sẽ phải gắn với một nhóm sulfat hoặc một mạch nhánh.  Các mẫu tách loại sulfat chứa nhiều gốc fucose đầu mạch không khử (terminal nonreducing residues). Có khả năng là chúng liên kết với các đường đơn khác loại nằm trên mạch chính.  Hàm lượng mannose trong 1,5M-deS là không đáng kể. Vì vậy tất cả các hexitol methyl hóa bắt nguồn từ các gốc galactose. Phần lớn các gốc này có gắn kết ở C-4 và C-6.  Phân đoạn fucoidan mẹ FSA-1,5M có một ít gốc galactose chỉ có gắn kết ở C-6, nhưng hầu hết số còn lại có thêm các nhóm thế khác, có khả năng là fucose hoặc sulfat.  Phân đoạn 1,0M-deS có hàm lượng mannose và galactose không khác nhau nhiều. Điều đó làm cho việc phân tích các dữ kiện methyl hóa của FSA-1,0M và 1,0M-deS trở nên phức tạp vì các dẫn xuất methyl hóa của hai hexose này không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng. 13 4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion Bảng 4.8. Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng. Fucoidan H% Fuc Xyl Man Glc Gal Axít Uronic SO3Na FSA-1.0M 21.9 c 15.9 5.9 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 1.0MdeS 8.1 4.0 7.8 4.3 14.0 30.6 2.8 deS-1 3.1 c 5.7 15.9 5.4 8.0 30.1 2.5 n.d. deS-2 13.8 c 15.4 12.1 2.3 3.3 38.8 7.1 2.3 deS-3 15.4 c 16.4 10.1 4.5 5.1 24.1 12.1 1.9 deS-4 34.6 c 6.7 2.4 8.4 2.9 4.2 40.9 n.d. deS-5 13.8 c 11.4 3.7 4.4 3.1 5.3 47.0 1.5 deS-6 7.6c 7.4 2.6 4.0 2.7 3.0 51.1 1.5 c % của 1,0MdeS 4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 Các tín hiệu mạnh nhất trên vùng H-anomer của phổ 1H-NMR của phân đoạn deS-2 được tìm thấy ở δH 5,3 (d, J = 3 Hz), 4,45, 4,47 và 4,49 ppm (d, J = 8 Hz). Các phổ COSY, TOCSY và ROESY chỉ ra rằng các tín hiệu này lần lượt thuộc về α-Galp, β-Xylp, và β-Galp. Phổ HSQC của deS-2 (Hình 4.15) cho phép gán các tín hiệu chính trong phổ 13C của deS-2 như trình bày trên Bảng 4.9. Hình 4.15. Một phần của phổ HSQC của deS-2 14 Hình 4.16. Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều ở dạng pyranose) Bảng 4.9. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6 C-6 deS-2 A 4)-α-D-Gal -(1 B 3)- -D-Gal -(1 C 3,6)- -D-Gal -(1 D - -D-Xyl -(1 E 4)- -D -Xyl -(1 F 6)- -D-Gal -(1 5.31 101.7 4.45 104.4 4.45 104.4 4.49 102.9 4.47 104.6 4.49 104.6 3.88 70.6 3.81 71.7 3.81 71.7 3.30 74.2 3.32 74.0 3.56 72.1 3.96 70.0 3.77 81.6 3.77 81.6 3.48 77.0 3.58 75.0 3.69 74.0 4.25 80.0 4.15 69.6 4.11 69.7 3.65 70.5 3.80 77.5 4.02 70.5 4.18 73.0 3.73 76.3 3.80 74.2 4.00,3.32 66.4 4.12,3.40 64.2 3.98 74.7 3.85,385 61.9 3.77,3.77 62.2 4.06,3.97 70.7 - - - - 4.04,4.04 71.8 Các dữ kiện NMR nêu trên cho phép rút ra các kết luận về một số đặc điểm cấu trúc của deS-2 như sau:  Tất cả các gốc α-Galp có vị trí liên kết ở C-4.  Gốc β-Galp có một vị trí liên kết ở C-3 hoặc C-6, hoặc 2 vị trí liên kết ở C-3 và C-6.  Còn gốc β-Xylp có vị trí liên kết ở C-4 hoặc chiếm giữ vị trí đầu mút không khử của mạch nhánh. 15 ppm 70 72 74 76 78 80 82 1А/3А 1А/ А5 1А/3B 1 /D 6C 1 / АB 4 1 /D 4E 1 /E 4E Hình 4.17. Một phần của phổ HMBC của deS-2 Cấu trúc chuỗi mạch của deS-2 được kết xuất trên cơ sở phân tích phổ HMBC (Hình 4.17). Cụ thể trên phổ HMBC xuất hiện các tín hiệu ứng với các tương tác 1H/13C giữa các gốc đường như sau: H-1(α-Galp, A)/C-3(β-Galp, B và C), H-1(β-Galp, B)/C-4(α-Galp, A), H-1(β-Xylp, D)/C-6(β-Galp, C), H-1(β-Xylp, D)/C-4(β-Xylp, E), và H-1(β-Galp, F)/C-6(β-Galp, F) (thành phần thứ yếu). Các dữ kiện nêu trên gợi ý sự có mặt của một mạch chính có cấu trúc như sau: →4)-α-Galp- (1→3)-β-Galp-(1→ Trong cấu trúc đó, một phần gốc β-Galp được thế chỉ bởi một gốc β-Xylp hoặc bởi một chuỗi ngắn (1→4)-β-Xylp có từ 2 gốc đường trở lên. Hàm lượng fucose và xylose của phân đoạn deS-2 là giống nhau, nhưng những cố gắng xác định vị trí của gốc fucose bằng phương pháp phổ NMR đã không cho ra kết quả. Các phổ NMR hai chiều của deS-2 cũng chỉ ra sự có mặt của một lượng nhỏ homopolymer của (1→6)-β-Galp. Nó có thể là một mạch nhánh nằm bên cạnh mạch xylose và gắn với mạch chính tại C-6 của gốc →3)-β-Galp-(1→. Nó cũng có thể là một polysaccharid riêng rẽ, không liên kết với polymer chính. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa của mẫu deS-2 (Bảng 4.7) xác nhận sự có mặt của một mạch chính với các gốc Galp luân phiên liên kết với nhau tại C-4 và C-3 và mang mạch nhánh tại C-6. Hơn nữa, chúng cũng cho thấy sự có mặt của:  Một lượng nhỏ Galp có liên kết mạch ở C-6.  Các Fuc ở cả hai dạng fucopyranose và fucofuranose và có các liên kết mạch khác nhau.  Các Xyl đầu mạch và Xyl liên kết mạch ở C-4. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa cho thấy mạch polysaccharid của deS-3 cho thấy deS-3 có các đặc điểm cấu trúc tương tự như deS-2. Tuy nhiên nó cũng có những điểm khác biệt như sau:  Chứa nhiều Gal liên kết ở C-4 hơn Gal liên kết ở C-3.  Các gốc Gal liên kết ở C-6 gần như hoàn toàn vắng mặt.  Gốc Xyl đầu mạch chiếm ưu thế vượt trội so với Xyl liên kết ở C-4. 16 Trước đây đã có một số công bố về các fucogalactan, ví dụ từ các loại rong nâu Undaria pinnatifida [115,116,117] và Laminaria japonica [118,119]. Các kết quả nghiên cứu nêu trên đã làm rõ được một phần các đặc điểm cấu trúc của các fucogalactan deS-2 và deS-3 từ S. aquifolium. Tuy nhiên, cấu trúc chính xác của các polysaccharid phân nhánh này còn là câu hỏi cho các nghiên cứu trong tương lai. 4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 Phổ HSQC của deS-4 được trình bày trên Hình 4.18, phổ HMBC trên Hình 4.19. Hình 4.18. Phổ HSQC của deS-4 Hình 4.19. Một phần của phổ HMBC của deS-4 Kết quả phân tích các phổ NMR hai chiều của deS-4 theo cách tương tự như trình bày ở trên cho thấy:  Polysaccharid chính có mạch chủ tạo thành bởi sự gắn kết luân phiên nhau của các gốc 2)-α-D- Manp-(1 và )4-β-D-GlcpA-(.  Khoảng một nửa số các gốc mannose có mạch nhánh ở O-3 là một gốc đường α-L-Fucp hoặc 4-β-D- GlcpA với tỉ lệ 4:1. 17 Trình tự của các gốc đường đơn trong mạch chính được xác định bởi phổ HMBC căn cứ trên các tương tác xa của các proton anomer như sau (ký hiệu xem Hình 4.19): H-1(α-Manp, S)/C-4(β-GlcpA, R), H-1(α-Manp, U)/C-4(β-GlcpA, T), H-1(β-GlcpA, R)/C-2(α- Manp, U), và H-1(β-GlcpA, T)/C-2(α-Manp, S). Vị trí của α-Fucp và β-Xylp ở O-3 của α-Manp được xác nhận bởi các tương tác tương ứng sau: H-1(α-Fucp, V)/C-3(α-Manp, U), và H-1(β-Xylp, G)/C-3(α-Manp, U). Các đặc điểm cấu trúc trên được xác nhận bởi kết quả phân tích các dẫn xuất metyl hóa. Trước đây, các fucoglucuronomannan tương tự như polysaccharid chính của deS-4 đã được tìm thấy trong nhiều loài rong nâu khác nhau. Đặc biệt, một polysaccharid từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia có cấu trúc phân nhánh với mạch chính cấu tạo bởi các đơn vị trisaccharid lặp đi lặp lại (Các polysaccharid tương tự có khả năng có mặt trong các loài Saccharina latissima và Laminaria bongardiana. Gần đây, có nghiên cứu cho thấy cấu trúc gồm các mạch nhánh fucooligosaccharide ngắn nằm kề bên với mạch nhánh chỉ có một nhóm Fucp có mặt trong một fucoglucuronomannan từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia. Còn cấu trúc mà mạch nhánh chỉ có một gốc Xylp duy nhất như trong deS-4 của S. aquifolium là lần đầu tiên được tìm thấy. Hình 4.20. Mảnh cấu trúc của deS-4 Bảng 4.10. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4 deS-4 H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6 C-6 S 2)- -D-Man -(1 Uv - -D-Man -(1 UG 2,3)- -D-Man -(1 T - -D-Gle A-(1 R 4)- -D-Gle A-(1 V -L-Fuc -(1 5.38 100.0 5.36 99.8 5.36 99.8 4.46 102.8 4.46 103.0 5.08 96.4 4.38 4.14 79.0 4.32 74.6 4.34 73.9 3.38 74.2 3.38 74.2 3.79 69.2 3.30 3.81 70.9 3.89 74.7 3.84 76.5 3.65 77.5 3.65 77.5 3.93 70.5 3.44 3.69 68.0 3.83 66.0 3.80 65.9 3.78 78.8 3.78 78.0 3.81 73.1 3.62 3.69 74.0 3.74 74.0 3.74 74.0 3.75 77.6 3.75 77.6 4.22 67.9 4.00,3.29 3.84,3.79 61.5 3.84,3.79 61.5 3.84,3.79 61.5 - 176.0 - 176.0 1.20 16.6 - 18 G -D-Xyl -(1 104.6 74.4 77.0 70.6 66.5 - 4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 Phổ HSQC của deS-6 được trình bày trên Hình 4.21, phổ HMBC trên Hình 4.22. Hình 4.21. Phổ HSQC của deS-6 Hình 4.22. Một phần của phổ HMBC của deS-6 Phân đoạn deS-6 nổi bật ở hàm lượng axít uronic cao. Phổ HSQC (Hình 4.21) cho thấy thành phần chính của nó là một glucuronan. Nó có mạch chính là các β-D-GlcpA thế bởi một gốc β-D-Xylp hoặc α-L- Fucp (thứ yếu) ở vị trí C-4 và liên kết với nhau qua C-3 (Hình 4.21). Cấu trúc của mạch chính được xác định bởi cường độ mạnh của tín hiệu tương tác của β-GlcpA H- 1/C-3 trên phổ HMBC (Hình 4.22). Vị trí của α-Fucp và β-Xylp ở O-4 của β-GlcpA được xác định bởi tín hiệu có cường độ mạnh của các tương tác H-1(β-Xylp, K)/C-4(β-GlcpA, YK) và H-1(α-Fucp, H)/C-4(β- GlcpA,YH) (thứ yếu). Một fucoglucuronan tương tự đã được tìm thấy với vai trò là một thành phần nhỏ trong fucoidan chiết xuất từ rong nâu Saccharina latissima. Bên cạnh fucoglucuronan, deS-6 còn chứa một lượng đáng kể fucoglucuronomannan, thành phần chính của phân đoạn deS-4. 19 Hình 4.23. Mảnh cấu trúc của deS-6 Bảng 4.11. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6 4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 Phân đoạn deS-5 về cơ bản là một hỗn hợp có tỉ lệ gần bằng 1:1 của fuco(xylo)glucuronomannan và xylo(fuco)glucuronan, lần lượt là thành phần chính của deS-4 và deS-6. 4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS Tất cả các dữ kiện thu được cho phép ta rút ra các đặc điểm khái quát về cấu trúc như sau cho fucoidan FSA-1,5M:  Fucoidan FSA-1,5M có hàm lượng sulfat cao (31,5%), cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) và galatose (5,5%). Đường fucose tồn tại dưới cả hai dạng vòng pyranose và furanose. Đường galactose chỉ có dạng pyranose.  Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao. Mạch chính cấu tạo chủ yếu bởi các gốc fucose liên kết luân phiên với nhau ở vị trí O-3 và O-4. Các gốc galactose nằm ở đầu không khử và liên kết với O-3 của fucose tạo thành các mạch nhánh.  Trong cấu trúc lõi, các nhóm sulfat chủ yếu nằm ở vị trí O-2 trên cả gốc fucose và galactose. 4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học 4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào của FSA và các phân đoạn tách sắc ký của nó được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi LU-1 và ung thư mô liên kết RD theo phương pháp hiện hành của Viện nghiên cứu ung thư quốc gia USA [120,121]. Thử nghiệm sơ bộ được thực hiện ở nồng độ 100 g/ml với chứng dương là ellipticin. Hoạt tính gây độc tế bào được biểu diễn bằng tỉ lệ phần trăm các tế bào 20 sống sót khi có mặt chất thử ở nồng độ nhất định (Bảng 4.13). Các kết quả thử nghiệm cho thấy FSA-1,5M thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi LU-1, các giá trị IC50 tương ứng là 60,7 và 80,0 µg/mL. Còn FSA-2,0M thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD, các giá trị IC50 tương ứng là 46,7 và 81,0 µg/mL. Bảng 4.13. Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan từ FSA. TT Chất thử Nồng độ (g/mL) Tỉ lệ tế bào sống sót CS (%) Hep-G2 LU-1 RD 1 FSA-1.5M 100 40,50,8 41,20,3 70,21,3 2 FSA-2.0M 100 29,30,5 78,250,2 40,51,3 3 Ellipticin 5 0,50,5 1,10,2 0,030,0 4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro Các kết quả nêu trên cho phép đưa ra kết luận rằng cả hai mẫu thử nghiệm đều có khả năng ức chế rõ rệt sự hình thành khối u tế bào ung thư dòng Hep-G2 ở nồng độ 100 μg/ml, trong đó mẫu 2,0M thể hiện hoạt tính mạnh hơn mẫu 1,5M. Hoạt tính ức chế này có khả năng là do tác động của các fucoidan tới quá trình apoptosis của tế bào. Bảng 4.14. Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần thể tế bào Mẫu thử Nồng độ mẫu (g/ml) Kích thước của quần thể tế bào