Tóm tắt Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc - Xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)

c định một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú - Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nhóm các phương pháp xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú - Phương pháp thu và xử lý mẫu 51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở vùng biển Quảng Ninh (QN1- QN8), Hải Phòng (HP1- HP11), Nam Định (NĐ1-NĐ11), Khánh Hòa (KH1-KH9), Bình Thuận (BT1-BT12) được thu và bảo quản lạnh. Mẫu bệnh phẩm được thu não và mắt. - Phương pháp mô bệnh học: theo OIE, FAO (2005). 5 - Xác định vi rút bằng nuôi cấy trên tế bào theo phương pháp Q.W.Qin và cs. (2006) - Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào gây nhiễm VNN bằng Kit RNeasy Qiagen của hãng Qiagen. - Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR). - Điện di trên gel agarose: theo phương pháp của Sambrook và cs, 2001. - Phương pháp tách dòng gen: theo Sambrook và cs, 2001. - Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4. + Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn EcoRI, ủ ở 37oC trong vòng 2,5- 3h. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. + Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: . - Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến: với tế bào chủ là E.coli JM109, biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. - Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli: - Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp: - Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose: theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kit của hãng Invitrogen. - Giải trình tự gen T4 bằng máy tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Dùng phần mềm Blast xác định mức tương đồng của trình tự gen T4 với GenBank. 2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh - Xác định độc lực của vi rút trên tế bào: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9 với môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). Giữ khay đã cấy ở 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Độc lực của vi rút đánh giá qua chỉ số TCID50. - Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9, mỗi độ pha loãng tiêm 30 cá mú con (1,5-2 cm), liều 0,1 ml/con. Quan sát biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết và gen mã hóa kháng nguyên T4 sau 5 ngày. Khả năng gây bệnh của vi rút đánh giá bằng chỉ số LD50. - Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1: chọn chủng QN4 có TCID50 cao (10 -6,8 ) để gây nhiễm trên tế bào. Mỗi chủng NNV được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID50 = 10 -6,8 . Theo dõi và đánh giá CPE sau 5 ngày thí nghiệm. - Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú: Chủng QN4 có liều LD50 cao (10 -7,5 ) được gây nhiễm vào cá mú. Lô đối chứng cá được tiêm môi trường Leibovit”z 15. Cá nuôi ở 280C (cả ngày) và 280 (ban ngày)/240C (ban đêm). Sau 15 ngày đánh giá tỷ lệ chết và xác định gen T4. 6 2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp - Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen T4 (pET32a+-T4). Dùng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector pET32a+-T4 vào tế bào E. coliBL21. - Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp - Kiểm tra PCR và enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của gen T4 trong plasmid. - Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 - Phương pháp điện di SDS-PAGE. - Phương pháp Western blot: nhằm nhận biết protein tái tổ hợp T4 thể hiện được tính đặc hiệu với vi rút gây hoại tử thần kinh. - Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp + Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ: Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, không có kháng thể đặc hiệu được ủ với chủng QN2 (liều 104 TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú nhỏ (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 hiệu giá 103 LD50) Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, được gây miễn dịch với E.coliBL21- pET32a + -T4 và protein T4 tái tổ hợp được pha loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm. Lô thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp, pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 liều 104 TCID50 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch vi rút QN2 hiệu giá 103 LD50). + Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú. Đối chứng dương: cá mú bột sạch bệnh được nghiền, xử lý kháng sinh, lọc và pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 với liều 104 TCID50 và gây nhiễm vào tế bào GS1. Đối chứng âm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với kháng nguyên E.coli BL21-pET32a + -T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày. Theo dõi cá trong 90 ngày, định kỳ 15 ngày thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng theo hệ số 10 rồi gây nhiễm vào tế bào GS1 Lô thí nghiệm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày. Theo dõi cá trong 90 ngày, định kỳ thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng rồi ủ với chủng QN2 (10 4 TCID50) và gây nhiễm vào tế bào GS1, đánh giá CPE trong 7 ngày 7 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam 3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây hoại tử thần kinh trên 51 mẫu cá mú được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy có 26 mẫu xuất hiện không bào trong các mô mắt và mô não. Các không bào trong mẫu kiểm tra có dạng hình tròn hoặc hình elip, kích thước không bào từ 5-10µm. Hình 3.1. Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá (a. Cá mú bệnh, b. Không bào trong não, c. Không bào trong mắt) Bảng 3.1. Kiểm tra vi-rút bằng phương pháp mô bệnh học Bệnh tích tế bào trong mô não cá (26 mẫu) Bệnh tích tế bào trong mô mắt cá (17 mẫu) Ký hiệu mẫu Tỷ lệ (%) Ký hiệu mẫu Tỷ lệ (%) QN2, QN4, QN7 37,50 QN2, QN4, QN7 37,50 HP2, HP4, HP5, HP8, HP10 45,45 HP4, HP5, HP8 27,27 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 72,72 NĐ1, NĐ4, NĐ5, NĐ10, NĐ11 45,45 KH4, KH5, KH6, KH9 44,44 KH4, KH5 22,22 BT1, BT2, BT4, BT7, BT9, BT12 50,00 BT2, BT4, BT9, BT12 33,33 Trung bình 50,98 Trung bình 33,33 Vi rút gây bệnh có ở tổ chức thần kinh của 26 mẫu thu thập được. Các mẫu còn lại tuy không thấy không bào xuất hiện nhưng không nằm ngoài khả năng đang ở thời kỳ tiền nhiễm. Do đó chúng tôi tiếp tục việc xác định vi rút bằng phương pháp sinh học phân tử để xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV. 3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR 8 Bảng 3.2. Xác định vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR Số mẫu dương tính với gen T4 của NNV (27 mẫu) Tỷ lệ (%) QN2, QN4 25,00 HP2, HP4, HP6, HP7, HP8, HP10, HP11 63,63 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 72,72 KH4, KH5, KH9 33,33 BT2, BT3, BT4, BT7, BT9, BT10, BT12 58,33 Trung bình 52,94 Kết quả cho thấy có 27/51 mẫu dương tính với gen T4 chiếm tỷ lệ 52,94%. Sản phẩm PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV cụ thể là HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH 5, BT2 và BT3 được thể hiện ở hình 3.2. Mẫu HP2, NĐ3, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3 xuất hiện băng có kích thước khoảng 420 bp tương ứng với kích thước đoạn gen T4. Mẫu HP1, NĐ2 không xuất hiện băng vạch. Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV (Giếng 1-10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3, Giếng 11: marker) 3.1.3. Xác định vi rút trên tế bào Đề tài đã sử dụng dòng tế bào GS1 để đánh giá khả năng gây nhiễm của NNV, với 27 mẫu dương tính với gen T4, chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút (hình 3.3, bảng 3.3). Mẫu HP11 không có biểu hiện bệnh tích ở mô não và mô mắt. Hình 3.3. Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV A: Tế bào sau gây nhiễm NNV 2 ngày, tế bào kết hạt và co tròn, B: Tế bào sau gây nhiễm NNV 7 ngày, C: Không bào trong tế bào GS1 gây nhiễm NNV sau 2 ngày. 9 Từ ngày thứ 2 tế bào có hiện tượng kết hạt, co tròn, hình thành nhiều hạt không bào kích thước đa dạng; sau 5 ngày tế bào chết cục bộ ở khắp bề mặt đĩa nuôi cấy và tới ngày thứ 7, toàn bộ tế bào bị phá hủy hoàn toàn bởi hiện tượng tan bào (hình 3.3). Bảng 3.3. Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh gây nhiễm trên tế bào GS1 STT Ký hiệu mẫu Thời gian xảy ra hiệu ứng CPE (giờ) 24 48 72 96 120 144 168 1 QN2 _ _ + + + ++ +++ 2 QN4 _ + + + ++ +++ ++++ 3 HP2 _ _ + + + ++ +++ 4 HP4 _ + + + ++ +++ ++++ 5 HP6 _ _ + + + ++ +++ 6 HP7 _ + + + ++ +++ ++++ 7 HP8 _ + + + ++ +++ ++++ 8 HP10 _ _ + + + ++ +++ 9 HP11 _ _ _ _ _ _ _ 10 NĐ1 _ + + + ++ +++ ++++ 11 NĐ3 _ _ + + + ++ +++ 12 NĐ4 _ + + + ++ +++ ++++ 13 NĐ5 _ + + + ++ +++ ++++ 14 NĐ7 _ _ + + + ++ +++ 15 NĐ8 _ + + + ++ +++ ++++ 16 NĐ10 _ _ + + + ++ +++ 17 NĐ11 _ _ + + + ++ +++ 18 KH4 _ _ + + + ++ +++ 19 KH 5 _ + + + ++ +++ ++++ 20 KH9 _ _ + + + ++ ++ 21 BT2 _ _ + + + ++ ++++ 22 BT3 _ + + + ++ +++ ++++ 23 BT4 + + + ++ +++ ++++ 24 BT7 _ + + + ++ +++ ++++ 25 BT9 - + + + ++ ++ +++ 26 BT10 - + + + ++ ++ ++ 27 BT12 - - + + + ++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++ : CPE > 50%; +: CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE Các chủng vi rút xác định được có gen T4 và gây bệnh tích trên tế bào. Vì vậy đây là vi rút gây hoại tử thần kinh, để chứng minh cho nhận định trên chúng tôi giải trình tự gen T4 nhằm xác định đến loài. 3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV đã xác định Gen T4 của các chủng NNV đại diện: QN2, HP7, NĐ1, KH5, BT12 được tinh sạch để tách dòng và xác định trình tự. Các kết quả dưới đây thể hiện bước xác định trình tự gen T4 của chủng KH5. 10 Hình 3.5. Thiết kế vector tái tổ hợp pGEMT- T4 A: Điện di sản phẩm tinh sạch gen T4 (giếng1: sản phẩm T4 tinh sạch; giếng M: 1kb Plus Ladder); B: sơ đồ thiết kế vector tách dòng gen T4 Sản phẩm sau tinh sạch có kích thước khoảng 420bp tương đương kích thước gen T4 (Hình 3.5A). Tách dòng bằng vector pGEM-T Easy, vector tái tổ hợp được thiết kế theo Hình 3.5B. Vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 được biến nạp vào E. coli JM109. Lựa chọn các khuẩn lạc trắng và nuôi trong môi trường LB lỏng (bổ sung ampicilin 100µg/ml) để tách plasmid tái tổ hợp và cắt, tinh sạch gen T4. Sản phẩm DNA plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng được kiểm tra trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.6 (A), kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen T4 thể hiện trong Hình 3.6 (B), kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn thể hiện trong Hình 3.6 (C). Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp (A): DNA plasmid tách từ 3 khuẩn lạc trắng (giếng 1,2,3); (B): Kiểm tra sản phẩm PCR của gen T4 từ 3 plasmid tái tổ hợp (giếng 1,2,3) (C): Kiểm tra đoạn DNA gen T4 chèn vào DNA của 3 plasmid tái tổ hợp cắt bằng emzyme EcoRI (giếng 1,2,3) Giếng M: Thang chuẩn1kb Plus Ladder; Kết quả hình 3.6 (C): các giếng 1-3 xuất hiện vạch có kích thước khoảng 420bp tương đương với kích thước gen T4, có khả năng chúng tôi tách dòng thành công gen T4. Sau khi xác định trình tự gen T4, chúng tôi sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen T4. Kết quả cho thấy đoạn gen T4 mã số HM017077.1 có độ tương đồng là 100% so với trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ của NNV. 11 Hình 3.7. So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1 Từ kết quả giải trình tự gen như trên cho phép chúng tôi kết luận rằng chủng vi rút xác định được là Nervous Necrosis Virus thuộc họ Betanodavirus. 3.2. Xác định một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 3.2.1. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút trên tế bào Bảng 3.5. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 STT Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình 1 QN2 10 -6,9 10 -7 10 -6,9 10 -6,8 10 -6,9 2 QN4 10 -6,9 10 -7 10 -6,8 10 -6,8 10 -6,8 3 HP2 10 -4,3 10 -4,4 10 -4,3 10 -4,5 10 -4,3 4 HP4 10 -5 10 -4,9 10 -4,8 10 -4,9 10 -4,9 5 HP6 10 -4,8 10 -4,8 10 -4,7 10 -4,9 10 -4,8 6 HP7 10 -6,8 10 -6,9 10 -6,8 10 -7 10 -6,8 7 HP8 10 -6 10 -5,8 10 -5,7 10 -6,1 10 -5,9 8 HP10 10 -3,9 10 -4 10 -3,9 10 -3,8 10 -3,9 9 NĐ1 10 -6,8 10 -6,8 10 -7 10 -6,9 10 -6,8 10 NĐ3 10 -3 10 -3,1 10 -3 10 -3 10 -3 12 STT Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình 11 NĐ4 10 -4,9 10 -4,9 10 -4,8 10 -4,9 10 -4,9 12 NĐ5 10 -5,9 10 -5,8 10 -6 10 -5,9 10 -5,9 13 NĐ7 10 -4,3 10 -4,3 10 -4,2 10 -4,3 10 -4,3 14 NĐ8 10 -4,8 10 -4,9 10 -4,9 10 -4,9 10 -4,9 15 NĐ10 10 -3 10 -3 10 -3 10 -2,9 10 -3 16 NĐ11 10 -3 10 -3,1 10 -3 10 -3 10 -3 17 KH4 10 -2,7 10 -2,8 10 -2,7 10 -2,6 10 -2,7 18 KH5 10 -6,8 10 -6,8 10 -6,8 10 -6,9 10 -6,8 19 KH9 10 -3 10 -3 10 -3,1 10 -3 10 -3 20 BT2 10 -4,8 10 -4,9 10 -4,9 10 -5 10 -4,9 21 BT3 10 -4,8 10 -4,8 10 -4,7 10 -4,8 10 -4,8 22 BT4 10 -5,9 10 -5,9 10 -5,9 10 -5,8 10 -5,9 23 BT7 10 -6,8 10 -6,9 10 -6,8 10 -6,7 10 -6,8 24 BT9 10 -3,9 10 -4 10 -3,9 10 -3,9 10 -3,9 25 BT10 10 -2,5 10 -2,7 10 -2,9 10 -2,8 10 -2,7 26 BT12 10 -4,8 10 -4,9 10 -4,9 10 -4,9 10 -4,9 Qua thí nghiệm cho thấy có 6/26 chủng vi rút có độc lực cao với TCID50 từ 10 -6,8 đến 10-6,9; 10/26 chủng có liều TCID50 đạt 10 -4,8 - 10 -5,9, ở độ pha loãng vi rút là 10 -8 ; 10 chủng còn lại độc lực yếu có liều TCID50 đạt 10 -2,7 - 10 -4,3 . 3.2.2. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú Đề tài đã chọn 6 chủng độc lực cao (QN2, QN4, HP7, NĐ1, KH5 và BT7) và 2 chủng độc lực thấp (KH4, BT10) để gây nhiễm trên cá mú. Theo dõi cá trong 5 ngày để xác định tỷ lệ chết và gen T4, kết quả trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú STT Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1 QN2 10 -6,2 10 -6,2 10 -6,1 10 -6,2 2 QN4 10 -7,5 10 -7,6 10 -7,5 10 -7,5 3 HP7 10 -7,5 10 -7,5 10 -7,4 10 -7,5 4 NĐ1 10 -5,4 10 -5,6 10 -5,5 10 -5,5 5 KH5 10 -6,3 10 -6,2 10 -6,4 10 -6,2 6 BT7 10 -6,5 10 -6,5 10 -6,4 10 -6,5 7 KH4 10 -3,7 10 -3,6 10 -3,6 10 -3,6 8 BT10 10 -2,5 10 -2,7 10 -2,5 10 -2,6 9 Đối chứng ND ND ND ND (Ghi chú: ND không đánh giá) 13 Kết quả cho thấy: 2 chủng QN4 và HP7 có độc lực cao trên cá với LD50 đạt 10 -7,5 , 2 chủng có LD50 trên cá thấp từ 10 -2,6 -10 -3,6 là KH4, BT10. 3.2.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên tế bào Tế bào GS1 được gây nhiễm NNV chủng QN4 với hiệu giá là 10-6,8 TCID50/ml rồi nuôi trong 5 ngày, theo dõi mật độ tế bào sống. Hình 3.8. Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV Kết quả trình bày ở hình 3.8 cho thấy, 220C là ngưỡng nhiệt độ phù hợp nhất cho sự nhân lên của vi rút và quá trình gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1. 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú Khả năng gây bệnh của NNV ở nhiệt độ 28oC (cả ngày và đêm) được thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy: lô cá mú được gây nhiễm chủng QN4 có tỷ lệ chết tích lũy là 82,1% sau 3 ngày, 100% sau 6 ngày theo dõi. Đối chứng tỷ lệ chết là 10% sau 15 ngày theo dõi. Qua bảng cho thấy tác nhân gây chết cá là NNV chủng QN4 với sự xuất hiện của gen T4. Bảng 3.8. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC cả ngày và đêm Thời gian (ngày) Tỷ lệ chết của cá mú (%) Xác định gen T4 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Đối chứng Lô thí nghiệm Đối chứng 0 0 0 0 0 0 - - 3 86,6 83,3 76,6 82,1 3,3 + - 6 100 100 100 100 6,6 + - 9 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: không có gen T4 14 Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở điều kiện nhiệt độ nước nuôi cá là 28 o C vào ban ngày và 24 oC vào ban đêm được thể hiện ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 24oC ban đêm Thời gian (ngày) Tỷ lệ chết của cá mú (%) Xác định gen T4 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Đối chứng Lô đối chứng Đối chứng 0 0 0 0 0 0 - - 3 80,0 86,6 90,0 85,5 0 + - 6 100 100 100 100 3,3 + - 9 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: không có gen T4 Ở nhiệt độ 28oC (ban ngày) và 24oC (ban đêm), tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày là 85,5% và sau 6 ngày cá chết hoàn toàn. Lô đối chứng sau 15 ngày tỷ lệ chết là 10%. Tác nhân gây bệnh có gen T4, chính là NNV chủng QN4 đã gây nhiễm. 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. 3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4. Đề tài sử dụng pET 32a+ làm vector biểu hiện gen T4, chủng E. coli JM109 kiểm tra vector tái tổ hợp, chủng E. coli BL21(DE3) để biểu hiện gen T4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp mang gen T4 (pET32a+- T4) được thể hiện ở hình 3.9. Phản ứng cắt plasmid vector pGEM-T-T4 và plasmid pET32a + được thực hiện ở 370C trong 4 giờ, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a + - T4 Kết quả phản ứng cắt vector pGEMT-T4 và vector pET32a+ thể hiện ở Hình 3.10. 15 Hình 3.10. Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI Giếng 1,2,3,4 (A): sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4; Giếng 1,2,3 (B): sản phẩm cắt plasmid pET32a+; Giếng M: Marker 1kb plus Kết quả Hình 3.10 (A): các giếng số 1, 2, 3 và 4 đều xuất hiện hai băng, một băng có kích thước khoảng 420bp (kích thước gen T4) và một băng có kích thước khoảng 3015bp (kích thước vector pGEM-T Easy). Hình 3.10 (B) cho thấy các giếng số 1, 2, 3 chỉ xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước tương đương vector pET 32a+ khoảng 5900bp. Như vậy chứng tỏ đã cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 và plasmid pET32a + tạo ra các vị trí tương thích để gắn gen T4 vào vector pET32a+. Băng vạch có vùng gen T4 kích thước 420bp và băng vạch có vector pET32a+ kích thước 5900bp được cắt để tinh sạch. Các sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+ được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector pET32a+ Giếng 1: gen T4 sau khi tinh sạch, Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh sạch M: 1kb Plus Ladder 16 Phản ứng nối gen được thực hiện ở 40C, ủ từ 14 đến 16h. Để kiểm tra sự tạo thành vector tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen được biến nạp vào tế bào E. coli JM 109. Sàng lọc chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi ở 37oC trong 16h, kết quả được thể hiện ở hình 3.12. Sau 16 giờ tiến hành chọn sáu khuẩn lạc sang nuôi cấy trong 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 370C trong 16h. Sau đó tách plasmid, điện di trên gel agarose 1%, kết quả ở hình 3.13. Hình 3.12. Đĩa khuẩn lạc sau khi chuyển gen pET32a+-T4 vào E. coli JM109 Hình 3.13. Kiểm tra sự tạo thành vector pET32a + -T4 trong vi khuẩn E. coli JM109 (Giếng 1-6: Plasmid các dòng từ 1 đến 6; Giếng M: 1kb plus ladder) Tiến hành PCR với cặp mồi P1 và R3 để kiểm tra sáu mẫu plasmid mang vector tái tổ hợp pET32a+- T4 và mẫu vector pET32a + (đối chứng). Kết quả thể hiện ở hình 3.14 cho thấy sáu dòng vi khuẩn được lựa chọn đều có mang gen T4, trong khi đó mẫu đối chứng không mang gen này. Như vậy có thể khẳng định vector tái tổ hợp pET32a+- T4 đã được thiết kế thành công. Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp Giếng 1-6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 các dòng đánh số từ 1 đến 6, Giếng M: 1kb Plus ladder; Giếng ĐC: sản phẩm PCR plasmid pET32a+ 17 3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV. Sau khi tạo được vector tái tổ hợp pET32a+-T4 đề tài đã lựa chọn bốn trong sáu dòng vi khuẩn để biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Vi khuẩn biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB thạch (bổ sung kháng sinh Ampicillin 100µg/ml), nuôi ở 37 oC từ 12 đến 16h, kết quả thể hiện ở hình 3.15 Hình 3.15. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a + -T4 vào E.coli BL21. Để kiểm tra khả năng biến nạp của plasmid pET32a+-T4 vào tế bào E. coli BL21(DE3), chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và kiểm tra PCR. Sản phẩm tách plasmid được điện di trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình 3.16 Hình 3.16. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 Giếng 1-4: Plasmid các dòng từ 1 đến 4; Giếng M:GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Hình 3.17. Kiểm tra khả năng biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng E. coli BL21(DE3). Giếng 1-4: Sản phẩm PCR plasmid các dòng từ 1 đến 4, Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+-T4. Kết quả điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.17 cho thấy các giếng từ 1 đến 4 đều xuất hiện vạch có kích thước tương đương với kích thước gen T4 là 420 bp. Do đó có thể kết luận chủng E. coli BL21(DE3) mang gen T4 của NNV đã được tạo thành công. 18 3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp Nuôi tăng sinh bậc một bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn. Nuôi lắc đến khi OD600nm của dịch nuôi đạt từ 0,5 - 0,6 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG. Lấy canh khuẩn vi khuẩn tái tổ hợp tại các thời điểm chưa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h để phân tích sự biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bằng điện di SDS-PAGE, kết quả được thể hiện ở hình 3.18 và hình 3.19. Hình 3.18. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 1 và 2 Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 1 cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h; Giếng 6,7,8: protein dòng 2 cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h. Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 3, 4 Giếng1,5: protein dòng 3,4 chưa cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 3 cảm ứng IPTG 2h, 4h và 6h; giếng 6,7,8: protein dòng 4 cảm ứng IPTG trong 2h, 4h và 6h. Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker Kết quả hình 3.18: Giếng 1 và 5 không xuất hiện vạch protein lạ. Giếng 2,3,4 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 17 kDa. Giếng số 6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein T4. Như vậy dòng số 2 đã biểu hiện thành công gen T4. Kết quả hình 3.19 cho thấy: Giếng số 1,5 không xuất hiện các vạch protein lạ. Các giếng 2,3,4,6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4. Từ các kết quả trên cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32a+-T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp có kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4 của NNV. 19 Sự biểu hiện protein của gen T4 được khẳng định lại bằng phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng NNV. Kết quả cho thấy vị trí phản ứng giữa protein tái tổ hợp T4 với kháng thể đặc hiệu chuẩn tương ứng tại vạch điện di có kích thước khoảng 25 kDa (hình 2.20). Vì vậy có thể kết luận kháng nguyên protein T4 của NNV đã được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21(DE3). Hình 2.20. Kết quả Western blot của protein T4 tái tổ hợp (M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4; giếng 2: protein T4 chuẩn của Mỹ) 3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Xác định thời gian thu mẫu Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy, thu mẫu tại các thời điểm sau cảm ứng 3, 4 và 12h. Kết quả (hình 3.21) cho thấy, thu mẫu sau 3h và 12h cho lượng protein ít