Tóm tắt Luận án Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội

). Trong khi Zhang Feng-yin và cộng sự (2009) [105] kết luận, sau khi ra cây trên 6 loại giá thể khác nhau lại khẳng ñịnh giá thể tốt nhất cho cây D.nobile cấy mô là xơ dừa. Wen Gang và cộng sự (2009) [106] cho rằng mùn cưa là giá thể tốt hơn cho D.nobile so với vỏ cây, rêu hay ñất mùn. Ngoài ra, trong giai ñoạn vườn ươm, cây lan cấy mô ñược cung cấp dinh dưỡng dưới dạng phun dung dịch phân bón lên toàn bộ bề mặt cây. Theo Ken Leonhardt (1999) [72] cây lan Dendrobium cấy mô sau khi ra cây 2 tuần mới cần cung cấp dinh dưỡng và tỷ lệ phân bón N:P:K phù hợp là 3:1:1 hoặc 3:1:2 với chu kỳ phun là 01lần/tuần, khi cây chuyển sang chậu ñơn thì dùng tỷ lệ phân bón N:P:K là 14:14:14. Fan Min Fu Yulan (2008) [60] cũng nhận ñược kết quả tốt nhất khi dùng tỷ lệ phân bón N:P:K là 1:1:1 với nồng ñộ 0,7% cho cây lan D.nobile một năm tuổi. Bên cạnh phân bón, một số chế phẩm sinh học cũng ñã ñược sử dụng ñể kích thích sinh trưởng, phát triển của lan Dendrobium. Leena Kechacupt (1987) [78] ñã phun Triacontanol cho cây Dendrobium Hepa ở giai ñoạn tám tháng tuổi và kết luận rằng dung dịch Triacontanol nồng ñộ 1mg/l ñã làm tăng số số lượng cành hoa/cây và làm cây ra hoa sớm hơn ñối chứng. Uthairatanakij và cộng sự (2008) [104] ñã sử dụng dung dịch Chitosan với nồng ñộ từ 200 ñến 600mg/l ñể làm tăng khối lượng cành hoa, kích thước cánh hoa của lan Dendrobium “Sonia”. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) ñược thu thập tại: Hòa Bình. + Chồi mầm, quả, cây thu thập của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum + Các nền môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE) + Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín + Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính. + Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus, bình nuôi có thể tích tối ña 10 lít. 8 + Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ. + Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu. 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu theo phương pháp nuôi cấy cải tiến. Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ra cây, giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến tỷ lệ sống và ñộng thái tăng chiều cao, số lá của cây con in vitro hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất. Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến sinh trưởng phát triển trong giai ñoạn nuôi trồng cây thu thập của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Bố trí các thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu Thí nghiệm 1: Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H2O2 2% và HgCl2 0,1% của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 2: Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của chồi lan với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng 9 sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả năng tạo rễ của chồi hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum. Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút bông ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan rừng D.nobile Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút màng lọc thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan rừng D.nobile Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy ñặc có màng lọc thoáng khí ñối với loài lan rừng D.nobile Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy lỏng lắc có màng lọc thoáng khí ñối với loài lan rừng D.nobile Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan rừng D.chrysanthum Các thí nghiệm từ thí nghiệm 1 ñến thí nghiệm 18 ñược bố trí theo phương pháp nuôi cấy mô tiêu chuẩn hiện hành. Thí nghiệm 19: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây ñến tỷ lệ sống cây in vitro vườn ươm của hai loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 20: Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh trưởng của 02 loài lan rừng thu thập D.nobile và D.chrysanthum Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng ñến chiều cao, số lá cây in vitro trên hai loài lan (D.nobile và D.chrysanthum) ngoài vườn ươm. Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng ñến sinh trưởng trên hai loài lan rừng thu thập D.nobile và D.chrysanthum ở vườn sản xuất. Thí nghiệm 23: Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh trưởng của hai loài lan bản ñịa thu thập D.nobile và D.chrysanthum Các thí nghiệm từ 19 ñến 23 ñược bố trí theo phương pháp thí nghiệm ñồng ruộng của Phạm Chí Thành. 2.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp ñánh giá 2.3.2.1 Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy invitro * Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro. Tổng số mẫu nhiễm - Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)= Tổng số mẫu cấy x 100 Tổng số mẫu sống - Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu cấy x 100 Số mẫu hình thành thể sinh chồi (protocorm) - Tỷ lệ mẫu tạo thể sinh chồi (protocorm)(%) = Tổng số mẫu sống x 100 10 - ðường kính cụm thể sinh chồi (protocorm) (mm) = Sử dụng thước ño ñường chéo, lấy giá trị trung bình. - Hệ số nhân thể sinh chồi (protocorm) (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy - Hệ số nhân chồi (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy Tổng số chồi sau 8 tuần nuôi cấy HSN = Tổng số chồi ban ñầu - Chiều cao cây(cm) là khoảng cách từ gốc rễ ñến ñầu mút lá Tổng số lá trên các cây thí nghiệm Số lá TB/cây = Tổng số cây thí nghiệm Tổng số rễ trên các cây thí nghiệm Số rễ TB/cây = Tổng số cây thí nghiệm 2.3.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm, vườn sản xuất Tổng số cây sống - Tỷ lệ cây sống % = Tổng số cây ñưa ra trồng ngoài vườn ươm, vườn sản xuất x 100 - Chiều cao cây (cm) = Từ phần gốc rễ ñến ñầu mút lá. Tổng số lá ñếm ñược - Số lá TB/cây = Tổng số cây thí nghiệm - ðường kính thân (mm): ðược ño bằng thước kẹp palme, tại vị trí phình to nhất Tổng số chồi ñếm ñược - Số chồi TB/cây = Tổng số chậu thí nghiệm 2.3.3 ðiều kiện thí nghiệm 2.3.3.1 Nhóm thí nghiệm trong phòng Các thí nghiệm ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm của Viện Sinh học Nông Nghiệp - Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Gia Lâm - Hà trong các ñiều kiện: cường ñộ ánh sáng: 800 - 3000lux, thời gian chiếu sáng: 16h/ngày, nhiệt ñộ: 25 ± 20C. 2.3.3.2 Nhóm thí nghiệm ở vườn ươm và vườn sản xuất Các thí nghiệm ñược tiến hành trong ñiều kiện nhà nuôi trồng lan của Viện Sinh học Nông Nghiệp - Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội và Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Gia Lâm - Hà Nội 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu theo theo chương trình IRRISTART 5.0 và phần mềm Excel 2003. Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum Tổng số lượng thể sinh chồi (protocorm) sau 8 tuần nuôi cấy HSN = Tổng số lượng thể sinh chồi (protocorm) ban ñầu 11 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và D. chrysanthum 3.1.1. Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H2O2 2% và HgCl2 0,1% Môi trường nuôi cấy = (MS + 100ml nước dừa + 10g sacaroza + 6g agar)/lít, Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum Công thức 3 (sử dụng HgCl2 0,1% kép trong 3 phút, tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài và ngâm tiếp trong HgCl2 0,1% trong 1 phút) ñã cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 8,89% ñối với loài lan rừng D.nobile; 3,48% ñối với loài lan rừng D.chrysanthum (bảng 3.1) Mẫu chồi mầm không có hiệu quả cao trong việc tạo nguồn mẫu sạch in vitro với hai loài lan nghiên cứu. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến khả năng sống của chồi mầm lan D.nobile và D. chrysanthum (Sau 6 tuần, ðơn vị tính: %) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Công thức thí nghiệm Dn Dc Dn Dc Dn Dc H2O2 2% kép, lần 1 trong 5 phút và lần 2 trong 2 phút 23,33 24,56 72,23 72,30 4,44 3,14 Lần 1 trong H2O2 2% 5 phút, lần 2 trong HgCl2 0,1% 1 phút 61,11 57,42 36,67 40,56 2,22 2,02 HgCl2 0,1% kép, lần 1 trong 3 phút và lần 2 trong 1 phút 37,78 40,02 53,33 56,50 8,89 3,48 3.1.2. Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan Bảng 3.2. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến tỷ lệ mẫu sống và nẩy mầm của quả 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 6 tuần, ðơn vị tính:%) Tỷ lệ mẫu sống và phát sinh protocorm (%) Tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi (%) Công thức thí nghiệm Dn Dc Dn Dc Nhúng quả trong cồn 960, ñốt trên ngọc lửa ñèn cồn 97 0 3 100 Nhúng quả bằng cồn 960, ngâm trong H2O2 2% trong 5 phút. 96 0 4 100 Nhúng quả bằng cồn 960, ngâm trong HgCl20,1% trong 5 phút. 97 0 3 100 Môi trường gieo hạt = (MS + 100ml nước dừa + 10g sacaroza + 6g agar)/lít, Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum Công thức 1 khử trùng quả tốt nhất với cả 02 loài lan; loài lan D.nobile có 97% hạt phát sinh thể sinh chồi (protocorm), 3% nẩy cụm chồi; loài lan D.chrysanthum Lindl. 100% hạt nẩy mầm tạo chồi, cụm chồi (bảng 3.2). 12 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum theo phương pháp nuôi cấy mô truyền thống 3.2.1. Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh của loài lan D.nobile và D.chrysanthum Nền môi trường cơ bản KC cho các chỉ tiêu: ñường kính cụm, số lượng protocorm/cụm, hệ số nhân protocorm vượt trội hơn các công thức khác ở mức ñộ tin cậy 95%, cụ thể ñường kính cụm protocorm ñạt 2,26 cm; số lượng protocorm/cụm là 210,06 thể sinh chồi và hệ số nhân 4,2 lần/8 tuần (bảng 3.3). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy) ðường kính cụm (cm) Số lượng protocorm/ cụm Chỉ tiêu CT Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân (lần) Số chồi phát sinh Tỷ lệ tạo chồi (%) VW 0,5 1,85 50 176,32 3,53 22 11,1 KC 0,5 2,26 50 210,06 4,20 18 7,9 MS 0,5 2,10 50 190,53 3,81 20 9,5 RE 0,5 1,84 50 166,48 3,33 25 13,0 LSD0.05 0,1 3,6 0,1 CV (%) 3,8 4,0 4,0 Ghi chú: Các công thức ñều ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g sacaroza + 6g agar)lít. Chỉ tiêu số chồi TB/ cụm, hệ số nhân chồi khác nhau ở các công thức thí nghiệm với các nền môi trường nuôi cấy khác nhau. Sau 8 tuần công thức tốt nhất là nền MS cho hệ số nhân chồi của 02 loài D.nobile và D.chrysanthum lần lượt ñạt 3,08 chồi/8 tuần; 2,89 chồi/8 tuần trong khi công thức thấp nhất chỉ là 2,69 chồi/8 tuần; 2,56 chồi/8 tuần (bảng 3.4). Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 8 tuần nuôi cấy) Số chồi TB/cụm Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân (lần) Chỉ tiêu CT Dn Dc Dn Dc Dn Dc VW 15,00 15,00 43,70 40,55 2,91 2,70 KC 15,00 15,00 45,40 41,05 3,03 2,74 MS 15,00 15,00 47,13 43,40 3,08 2,89 RE 15,00 15,00 40, 38 38,38 2,69 2,56 LSD0,05 2,36 2,56 0,03 0,04 CV (%) 4,0 4,6 4,1 4,7 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít; Dn: D.nobile;Dc: D.chrysanthum 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng sacaroza ñến khả năng nhân nhanh của loài lan D.nobile và loài D.chrysanthum Bổ sung 10 gram sacaroza/lít hơn hẳn các công thức thí nghiệm khác về các chỉ tiêu: ñường kính cụm protocorm, số lượng protocorm trung bình/cụm và hệ số nhân protocorm /8 tuần ở mức ñộ sai số tin cậy 95%, ñạt hệ số nhân là 13 4,22 lần/8 tuần (bảng 3.5). Các công thức thí nghiệm có hàm lượng saccaroza ñược bổ sung vượt quá 30g /lít thì số chồi/cụm lại giảm dần, ñiều này thể hiện trên cả 02 loài lan rừng. Ở ñộ tin cậy 95%, với loài D.nobile công thức CT3 (bổ sung 30g saccaroza/lít môi trường) cho số lượng chồi TB/cụm, hệ số nhân chồi nhiều nhất, ñạt lần lượt 48,42 chồi và 3,23 lần sau 8 tuần nuôi cấy. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh protocorm của loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy) ðường kính cụm (cm) Số lượng protocorm/ cụm Chỉ tiêu CT Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân (lần) Số chồi phát sinh Tỷ lệ tạo chồi (%) ðC+10g saccaroza 0,5 2,28 50 211,16 4,22 19 8,2 ðC+20g saccaroza 0,5 1,58 50 178,12 3,56 14 7,2 ðC+30g saccaroza 0,5 1,26 50 158,08 3,16 27 14,5 ðC+40g saccaroza 0,5 1,14 50 116,68 2,33 8 6,4 ðC+50g saccaroza 0,5 1,02 50 108,32 2,17 7 6,0 LSD0.05 0,3 13,8 0,3 CV (%) 2,8 5,0 5,0 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít Với loài D.chrysanthum công thức CT2 (bổ sung 20g saccaroza/lít môi trường) cho số lượng chồi TB/cụm, hệ số nhân chồi nhiều nhất, ñạt lần lượt 46,63 chồi và 3,11 lần sau 8 tuần nuôi cấy (bảng 3.6) Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 8 tuần nuôi cấy) Số chồi TB/cụm Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân chồi (lần) Chỉ tiêu CT Dn Dc Dn Dc Dn Dc ðC+10g 15,00 15,00 43,96 43,02 2,93 2,87 ðC+20g saccaroza 15,00 15,00 44,57 46,63 2,97 3,11 ðC+30g saccaroza 15,00 15,00 48,42 43,30 3,23 2,89 ðC+40g saccaroza 15,00 15,00 43,43 42,43 2,89 2,83 ðC+50g saccaroza 15,00 15,00 38,03 38,33 2,54 2,56 LSD0,05 1,97 1,99 0,13 0,15 CV (%) 2,5 2,60 2,50 2,7 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (môi trường MS + 100ml nước dừa + 6g agar)/ lít, Dn: D.nobile ; Dc: D.chrysanthum. 3.2.3. Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh của loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum Sau 8 tuần theo dõi, công thức thí nghiệm 2 ñược bổ sung 60g hợp chất khoai tây cho các chỉ tiêu về ñường kính cụm protocorm, số lượng protocorm trung bình/cụm, hệ số nhân protocorm/8 tuần lần lượt là: 2,47cm/cụm, 222,54 protocorm/ cum và hệ số nhân ñạt 4,45 lần hơn hẳn công thức ñối chứng và các công thức thí nghiệm khác ở mức ñộ tin cậy 95% (bảng 3.7). 14 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh protocorm của loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy) ðường kính cụm (cm) Số lượng protocorm/ cụm Chỉ tiêu CT Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân (lần) Số chồi phát sinh Tỷ lệ tạo chồi (%) ðC 0,5 2,28 50 210,67 4,21 19 8,4 ðC + 60g Khoai tây 0,5 2,47 50 222,54 4,45 10 4,3 ðC + 60g Cà rốt 0,5 1,22 50 125,68 2,51 16 11,3 ðC + 60g Táo 0,5 0,88 50 89,67 1,79 27 23,1 ðC + 60g Chuối chín 0,5 0,82 50 80,53 1,61 22 21,6 ðC + 60g Khoai tây + 60g Cà rốt 0,5 1,18 50 112,37 2,25 25 18,3 ðC + 60g Khoai tây + 60g Táo 0,5 0,84 50 80,58 1,61 28 25,7 ðC + 60g Khoai tây + 60g Chuối chín 0,5 0,78 50 71,69 1,45 13 15,3 ðC + 60g Cà rốt + 60g Táo 0,5 0,74 50 69,15 1,38 10 12,5 ðC + 60g Cà rốt + 60g Chuối chín 0,5 0,92 50 89,11 1,78 14 13,5 ðC + 60g Táo + 60g Chuối chín 0,5 0,82 50 81,27 1,63 18 18,0 LSD0.05 0,13 11,31 0,15 CV (%) 1,5 2,7 2,7 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít. Bổ sung 60g khoai tây/lít là công thức tốt nhất về các chỉ tiêu sinh trưởng protocorm, cụ thể hệ số nhân protocorm/sau 8 tuần ñạt 4,47 ở mức tin cậy 95% (kết quả tại bảng 3.8). Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan rừng D.nobile (Sau 8 tuần nuôi cấy) ðường kính cụm (cm) Số lượng protocorm/ cụm Chỉ tiêu CT Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân (lần) Số chồi phát sinh Tỷ lệ tạo chồi (%) ðC 0,5 2,25 50 198,19 3,96 20 9,2 ðC+20g 0,5 2,02 50 201,72 4,03 13 6,1 ðC+40g 0,5 2,11 50 211,17 4,18 21 9,1 ðC+60g 0,5 2,47 50 223,37 4,47 10 4,3 ðC+80g 0,5 1,97 50 197,51 3,95 12 5,7 ðC+ 100g 0,5 1,59 50 160,60 3,21 11 6,4 LSD0.05 0,19 10,18 0,27 CV (%) 3,0 3,8 3,7 Ghi chú: Các công thức ñược bổ sung (Nền môi trường KC + 100ml nước dừa + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít. Ở mức ñộ sai khác tin cậy 95%, số chồi/cụm thu ñược sau 8 tuần nuôi cấy ở công thức 5 cao hơn hẳn so với các công thức khác. ðối với loài D.nobile ñạt 49,76 chồi/cụm và hệ số nhân ñạt 3,32 lần; với loài D.chrysanthum là 48,16 15 chồi/cụm và hệ số nhân ñạt 3,21 lần (bảng 3.9). Bảng 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 8 tuần nuôi cấy) Số chồi TB/cụm Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân chồi (lần) Chỉ tiêu CT Dn Dc Dn Dc Dn Dc ðC 15,00 15,00 43,86 43,22 2,92 2,88 ðC+60g Khoai tây 15,00 15,00 45,31 45,13 3,02 3,01 ðC+ 60g Cà rốt 15,00 15,00 44,47 43,77 2,96 2,92 ðC+ 60g Táo 15,00 15,00 43,32 43,23 2,89 2,88 ðC+60 Chuối chín 15,00 15,00 49,76 48,16 3,32 3,21 ðC+60g Khoai tây+60g Cà rốt 15,00 15,00 45,15 42,25 3,01 2,82 ðC+60g Khoai tây+60g Táo 15,00 15,00 45,41 39,41 3,03 2,63 ðC+60gKhoai tây+60g Chuối chín 15,00 15,00 44,88 37,48 3,00 2,50 ðC+ 60g Cà rốt+60g Táo 15,00 15,00 43,97 35,97 2,93 2,40 ðC+ 60g Cà rốt +60g Chuối chín 15,00 15,00 43,53 35,13 2,90 2,34 ðC+ 60g Táo +60g Chuối chín 15,00 15,00 43,21 35,11 2,88 2,34 LSD0,05 1,81 1,70 0,12 0,11 CV(%) 2,40 2,50 2,6 2,3 Ghi chú: Dn: D.nobile, Dc: D.chrysanthum; ðC = (Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 30g saccaroza + 6g agar)/ lít / loài Dn; ðC = (Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 20g saccaroza + 6g agar)/ lít / loài Dc Việc bổ sung chuối chín vào môi trường nuôi cấy ñã có hiệu quả tác ñộng ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan. Sau 8 tuần nuôi cấy, với 02 loài lan nghiên cứu, ở ñộ tin cậy 95%, số chồi thu ñược ở CT3 bổ sung 60g chuối chín ñều cho hiệu quả cao nhất về hệ số nhân chồi hơn hẳn so với công thức ñối chứng, các công thức thí nghiệm khác và lần lượt ñạt 3,29 lần/sau 8 tuần; 3,20 lần/8 tuần nuôi cấy (bảng 3.10). Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum (Sau 8 tuần nuôi cấy) Số chồi TB/cụm Ngày cấy mẫu Sau cấy 8 tuần Hệ số nhân chồi (lần) Chỉ tiêu CT Dn Dc Dn Dc Dn Dc ðC 15,00 15,00 43,66 43,32 2,91 2,89 ðC+ 30g chuối chín 15,00 15,00 45,90 45,87 3,06 3,06 ðC+ 60g chuối chín 15,00 15,00 49,36 47,93 3,29 3,20 ðC+90g chuối chín 15,00 15,00 45,26 44,46 3,02 2,96 ðC+120g chuối chín 15,00 15,00 44,42 43,83 2,96 2,92 ðC+150g chuối chín 15,00 15,00 44,63 43,85 2,98 2,92 ðC+180g chuối chín 15,00 15,00 43,66 42,95 2,91 2,86 LSD0,05 1,90 1,87 0,13 0,12 CV (%) 2,40 2,60 2,4 2,5 Ghi chú: Dn: Dendrobium nobile Lindl., Dc: Dendrobium chrysanthum Lindl.;ðC = (Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 30g saccaroza + 6g agar)/ lít / loài Dn; ðC = (Nền môi trường MS + 100ml nước dừa + 20g saccaroza + 6g agar)/ lít/ loài Dc 16 3.2.4. Ảnh hưởng các nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của chồi lan với 02 loài D.nobile và D.chrysanthum Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các loại nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của chồi lan của 02 loài lan rừng D.nobile và D. chrysanthum (Sau 6 tuần nuôi cấy) Chiều cao (cm) Số lá/cây (lá) Số rễ /cây (rễ) Chỉ tiêu Công thức Dn Dc Dn Dc Dn Dc CT1: VW 4,47 4,07 4,11 4,06 2,29 4,29 CT2: KC 3,68 3,07 3,29 3,59 2,56 4,50 CT3: MS 3,87 3,27 4,16 3,86 3,37 4,37 CT4: RE 4,88 5,28 4,44 4,34 3,69 4,89 LSD0,05 0,38 0,19 0,29 0,25 0,03 0,37 CV % 4,7 2,6 3,8 3,4 5,3 4,3 Ghi chú: Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum; các công thức ñều ñược bổ sung (10g saccaroza + 6g agar)/lít Kết quả tại bảng 3.11cho thấy: ñối với 02 loài lan thí nghiệm thì CT4 sử dụng nền khoáng RE cho khả năng phát triển về chiều cao cây, số lá, số rễ là cao nhất ñạt chiều cao 4,88 cm/cây; 4,44 lá/cây; 3,69 rễ/cây với D.nobile và với D.chrysanthum là 5,28 cm/cây; 4,34 lá/cây; 4,89 rễ/cây. 3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng sinh trưởng của chồi lan rừng D.nobile và D.chrysanthum Bảng 3.12. Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi của 02 loài lan rừng D.nobile và D. chrysanthum (Sau 30 ngày nuôi cấy) Chiều cao TB/cây (cm) Số lá TB /cây (chiếc) Số rễ TB/cây (chiếc) Chỉ tiêu Công thức Dn Dc Dn Dc Dn Dc ðC + 1 ñèn chiếu sáng = 800lux 3,87 3,97 3,27 3,36 3,09 3,59 ðC + 2 ñèn chiếu sáng = 1300lux 4,18 5,23 3,44 4,49 3,24 5,26 ðC + 3 ñèn chiếu sáng = 1800lux 4,37 3,48 3,67 3,68 3,58 3,97 ðC + 4 ñèn chiếu sáng = 2300lux 4,88 3,09 4,16 3,36 4,08 3,57 LSD0,05 0,27 0,41 0,27 0,19 0,26 0,29 CV % 3,4 5,5 3,9 2,7 3,9 3,8 Ghi chú: Dn: D.nobile ; Dc: D.chrysanthum ; ðC = (Nền môi trường RE + 10g saccaroza + 6g agar)/lít. Chồi của loài D.nobile ñược nuôi cấy ở cường ñộ chiếu sáng 2300 lux cho kết quả chồi phát triển mạnh nhất, lá to dài, mở rộng, lá xanh sẫm, bóng, thân mập, hình thành bộ rễ phát triển mạnh (bảng 3.12). Còn ñối với chồi của loài D.chrysanthum cho chồi phát triển mạnh, tán lá mở rộng, lá dài, màu xanh bóng mượt, bộ rễ mọc khỏe ở cường ñộ chiếu sáng là 1.300 lux. 3.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả năng sinh rễ của chồi loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum ðối với loài D.nobile ở CT2 có bổ sung 0,5g than hoạt tính/lít, giúp chồi 17 cho bộ rễ dài vừa, mập. ðối với loài D.chrysanthum ở CT3 có bổ sung 1g than hoạt tính/lít, giúp hình thành cây có bộ rễ dài, mập (bảng 3.13). Bảng 3.13. Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng tạo rễ của chồi 02 loài lan rừng D.nobile và D. chrysanthum Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ TB/cây (chiếc) Chiều dài rễ TB (cm) Hình thái rễ Sau 15 ngày Sau 30 ngày Sau 30 ngày Sau 30 ngày Sau 30 ngày Chỉ tiêu Công thức Dn Dc Dn Dc Dn Dc Dn Dc Dn Dc ðC 8,89 6,67 80,00 83,33 3,02 3,39 1,27 1,37 Vừa, trắng ngà Vừa, trắng ngà ðC+0,5g THT 66,67 15,56 100,00 100,00 3,46 3,44 2,12 2,20 Mập, tròn, trắng Vừa, trắng ngà ðC+1,0g THT 44,44 72,22 100,00 100,00 3,22 3,76 2,03 2,28 Gầy, có lông tơ Mập, tròn, trắng ðC+1,5g THT 38,89 66,67 100,00 100,00 3,09 3,43 2,30 2,30 Gầy, dẹt, có nhiều lông tơ Vừa, có lông tơ ðC+2,0g THT 15,56 52,22 100,00 100,00 2,91 3,13 2,54 2,65 Gầy, dẹt, có rất nhiều lông tơ Gầy, có nhiều lông tơ LSD0,05 0,25 0,22 0,26 0,2 CV % 3,9 3,5 5,8 5,1 Ghi chú: Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum ; ðC = (nền môi trường RE + 10g saccaroza + 6g agar)/ lít. 3.3. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro cải tiến ñối với hai loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử