Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (Exome) - Nguyễn Thu Hiền

ác đoạn ngắn theo bộ kit; Các đoạn DNA đã cắt được gắn với các adaptors và indexes cho từng mẫu; Lai các đoạn DNA với các trình tự exon được biotin hóa và gắn hạt từ đã được phủ streptavidin; Loại bỏ những phân tử không liên kết, các trình tự exon đã byotin hóa và thu lại các đoạn chứa exon; Khuếch đại các đoạn exon mẫu. 2.3.2. Phân tích dữ liệu Thư viện DNA sau đó được giải trình tự trên máy giải trình tự mới. Dữ liệu trình tự được sắp xếp và so sánh với ngân hàng gen người (hg19) bằng phần mềm BWA phiên bản 0.7.10. (Li, Durbin, 2009). Bản sao phân tử được loại bỏ bằng cách sử dụng Picard v1.118. Dữ liệu sau đó được phân tích bằng Genome Analysis Toolkit v3.4 để tìm tất cả những vị trí có sự thay đổi alen với tần số thống kê cao, bao gồm SNPs, đoạn thêm, mất ngắn và CNVs (McKenna, Hanna et al. 2010). Biến thể được chú giải bằng phần mềm SnpEff v4.1 và các cơ sở dữ liệu dbSNP v142, 1000Genome, ClinVar, ESP nhằm xác định ảnh hưởng của biến thể (Cingolani et al., 2012) . Để chọn lọc được những biến thể tiềm năng, dữ liệu được lọc qua các bước lọc như sau. Đầu tiên, các biến thể có giá trị MQ < 40 bị loại bỏ. Thứ hai, các biến thể có giá trị Sift_Pred được đánh dấu là “Damaging (D)” hoặc “NA (‘.’)” được giữ lại. Thứ ba, chọn lọc các biến thể thay thế. Thứ tư, loại bỏ những biến thể đã được được biết đến trong ngân hàng dữ liệu SNPs 142. 2.3.7. Phân tích các gen trong mối tương tác Để phân tích các gen liên quan đến ASD, dữ liệu các gen chứa biến thể ở từng bệnh nhân được đưa vào hệ thống ASD@Princeton của trường đại học Princeton. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích các mối tương quan của các gen liên quan đến các đặc điểm đặc trưng nhất ở người bệnh tự kỷ bao gồm: biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÁC ĐỊNH BIẾN THỂ DI TRUYỀN Ở BỆNH NHÂN TỰ KỶ 3.1.1. Xác định và chú giải biến thể Sử dụng bộ công cụ GATK để xác định biến thể, phần mềm SnpEff sử dụng để phân chia các biến thể thành các nhóm theo mức độ ảnh hưởng chức năng của biến thể. Từ bảng kết quả 3.1 cho thấy, mẫu số T01 cho tổng số SNP là 103.840, tổng số Indel là 14.843 và % tìm thấy trên dbSNP142 là 97,3%. Tương tự như thế 6 mẫu bệnh nhân còn lại lần lượt có các chỉ số như trên được tổng kết và trình bày trong bảng 3.1. Ngoài ra, kết quả thu được từ 7 nhóm biến thể thì trong đó có đến hơn 97% số biến thể là đã được đăng ký trong ngân hàng dbSNP142 (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Kết quả xác định và chú giải biến thể Tên biến thể Mẫu T01 Mẫu T02 Mẫu T03 Mẫu T06 Mẫu T07 Mẫu T08 Mẫu T09 Tổng SNP 103.840 105.091 103.809 104.497 104.022 103.954 107.192 Biến thể đồng nghĩa 11.488 11.539 11.322 11.417 11.276 11.447 11.664 Biến thể sai nghĩa 10.546 10.734 10.540 10.456 10.423 102.000 10.644 Thêm bộ mã hóa kết thúc 78 80 95 95 84 34 97 Mất bộ ba mã kết thúc 38 31 36 38 39 37 42 Tổng số biến thể thêm mất 14.843 15.581 14.898 15.077 14.943 14.793 16.192 Đột biến lệch khung đọc 284 279 273 283 276 275 306 Thêm bộ ba mã hóa 163 156 148 148 158 155 154 Mất bộ ba mã hóa 207 207 174 178 185 185 198 % tìm thấy trên dbSNP142 97,3 97,2 97,4 97,3 97,3 97,3 97,1 Sau quá trình lọc, những gen/biến thể được giữ lại thỏa mãn các điều kiện: Gen có khả năng gây ra bệnh liên quan thần kinh Có chỉ số MQ>40 (mapping quality) SIFT_Pred=D, PolyPhen 2 _ Pred =D (Damaging) Biến thể không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP 142 Bảng 3. 2. Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh nhân Tên mẫu Dữ liệu gốc Thuộc gen có tiềm năng gây bệnh và MQ>40 SIFT_Pred=D Và PolyPhen 2 _ Pred =D Không có trong dbSNP 142 Thuộc 101 gen ASD T01 118.687 164.980 330 14 16 T02 120.672 164.780 342 16 17 T03 118.707 164.950 309 8 16 T06 119.574 163.250 319 19 17 T07 118.965 161.180 305 11 17 T08 118.774 163.890 319 14 15 T09 123.386 167.470 304 12 22 Ở bảng kết quả 3.2 cho thấy, dữ liệu gốc của mẫu T01 là 118.687 biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh thần kinh thì trải qua bước lọc chỉ số MQ >40 (thuộc các gen có tiềm năng gây bệnh) còn 164.98 biến thể. Tiếp tục lọc qua bước các biến thể bị đánh giá là có ảnh hưởng đến chức năng protein (SIFT_Pred=D và PolyPhen 2 _ Pred =D (Damaging)) được giữ lại còn 330, Trong đó có 14 biến thể quan tâm không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142, 16 biến thể trên các gen đã biết liên quan đến ASD. Tương tự như thế với 6 mẫu còn lại trải qua các bước lọc thì số lượng biến thể còn lại được trình chi tiết trong bảng 3.2. 3.1.2. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01 3.1.2.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T01 Sau quá trình phân tích và chọn lọc bằng các phần mềm tin sinh học, ở bệnh nhân T01, chúng tôi đã thu được bảng dữ liệu các biến thể nằm trên các gen có trong danh sách 101 gen ASD gồm 16 biến thể trên 12 gen: DPP6, GRIN2B, MED12, NEGR1, PDE10A, PTCHD1, PTEN, SMC1A, ST7, TSC2, CACNA1E, SCN8A. Từ kết quả giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa, các gen được phân tích sâu hơn bằng các ứng dụng về dự đoán, tương tác của các gen nhạy cảm với ASD của trường Đại học Princeton (asd.priceton.edu). Các gen và các mối liên kết chức năng trong các biểu hiện bệnh đặc trưng của các bệnh nhân tự kỷ như khiếm khuyết trong các lĩnh vực: Hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội được phân tích. Kết quả phân tích sự tương tác của các gen liên quan đến ba biểu hiện đặc trưng nhất ở bệnh nhân T01 cho thấy, các gen tham gia là tương đối giống nhau, và ở cả 3 biểu hiện nghiên cứu, 2 gen chứa biến thể ở bệnh nhân T01 là DPP6 và CASK đều tham gia (Hình 3.1). Hình 3.1 Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01 Trong đó, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen DPP6 và NTRK3 là 0,65, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen CASK và ATP2B2 là 0,6 3.1.2.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01 Từ kết quả giải trình tự exome của các bệnh nhân qua phân tích và sàng lọc những biến thể tiềm năng này sẽ được phân tích tiếp bằng 2 công cụ là SIFT (sorting intolerant from tolerant) và PolyPhen (polymorphism phenotyping). Kết quả bệnh nhân T01 có 14 biến thể quan tâm không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142 trên các gen: ATP2B3, BCL11A, CDK13, CSMD2, DNAH9, HIP1R, KNDC1, LRRC7, MUC5B, MYCBP2, PITPNM3, SMTN và ZDBF2 . 3.1.3. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02 3.1.3.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T02 Kết quả sau các bước lọc, bệnh nhân T02 có 17 biến thể nằm trên 15 gen đã biết liên quan đến ASD: CASK, CDKL5, FOXP1, KLHL3, MED12, SCN2A, SHANK2, SHANK2, SLC6A4, TCF4, VPS13B, ZEB2, CACNA1I, SCN3A, SCN5A Kết quả phân tích mối tương quan cho thấy trong các gen chứa biến thể của bệnh nhân T02, có 2 gen quan trọng, tham gia vào các biểu hiện đặc trưng trong nghiên cứu này là SHANK 2 và CASK. Trong biểu hiện hành vi, có 3 gen được xác định trong hệ thống ASD@Princeton là CDCY1, ATP2B2, EFNB3 (Hình 3.2). Theo đánh giá của hệ thống, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen SHANK2 và 2 gen OLFM1, LARGE lần lượt là 0,53, 0,58 Hình 3.2. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02 3.1.3.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02 Sau khi loại bỏ các biến thể được đánh giá là an toàn, không gây bệnh và các biến thể nằm trong ngân hàng db142SNP, số lượng các biến thể nằm trên các gen mới ở bệnh nhân T02 là 16 biến thể. Các biến thể này nằm trên 15 gen: RP1L1, MYOM3, PDIA5, ADCY2, DST, PKD2L1, CTBP2, MYO1E, MYH13, SDK2, MUC16, INPP5J, EYS, ATP2B3, GPRASP1. 3.1.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 3.1.4.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T03 Sau khi chọn lọc bằng các phần mềm chuyên dụng, 16 biến thể nằm trên 15 gen liên quan đến ASD được tìm thấy ở bệnh nhân T03. Các gen này gồm có: NTNG1, ZEB2, MBD5, FOXP1, KLHL3, HOXA1, ST7, DPP6, DLGAP2, GRIN2B, TRPM1, SOX5, UBE3A, RBFOX1, CACNA1C. Hình 3.3. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03 Kết quả phân tích mối tương quan của các gen trong các biểu hiện bệnh, cho thấy, đối với bệnh nhân T03, chỉ có gen DPP6 tham gia và mối tương quan với các gen liên quan đến 3 biểu hiện trong nghiên cứu này (Hình 3.3) 3.1.4.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03 Bệnh nhân T03 có 8 biến thể trên 8 gen mới FLNC, ADAMTS9, NIN, ASB16, MUC16, TMPRSS15, KDELR3, ALPI. 3.1.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 3.1.5.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T06 Sau các bước chọn lọc, kết quả thu được ở bệnh nhân T06 bao gồm 17 biến thể trên 15 gen đã biết liên quan đến ASD: ANKRD11, AUTS2, CASK, DOCK4, DPP6, KATNAL2, KLHL3, NIPBL, RBFOX1, RELN, SHANK2, SOX5, TCF4, TSC1, TSC2. Kết quả phân tích các gen ở bệnh nhân T06 cho thấy, bệnh nhân này có 5 gen quan trọng, tham gia vào mối tương tác với các gen liên quan đến các biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội. Đó là TSC1,TSC2, NIPBL, SHANK2, DPP6 (Hình 3.4). Trong đó gen TSC1, TSC2 nằm trong danh sách gen của hệ thống, chứng tỏ sự quan trọng của gen này liên quan đến biểu hiện giao tiếp. Theo tính toán chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa 2 gen TSC1, TSC2 là 0,62. Chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa gen NIPBL với các gen khác đều trên 0,7. Hình 3.4. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06 3. 1.5.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T06 Bệnh nhân T06 có 18 biến thể trên 19 gen: BRF1, ABCA13, ATP2B3, CCNL2, CIT, CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16, MUC5B, RSL1D1, RYR3, SGSM3, TTYH1 và WDFY4. 3.1.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 3.1.6.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 mang 17 biến thể trên 16 gen liên quan đến ASD đã được biết: ATRX, AUTS2, DLGAP2,FOXP1, KDM5C, KIRREL3, MED12, PTEN, SHANK2, SMG6, KCNJ10, SOX5, SPAST, ST7, VPS13B, CACNA1H. 16 gen này được đưa vào hệ thống phân tích dữ liệu của trường Đại học Princeton để phân tích mối tương quan giữa các gen. Kết quả phân tích cho thấy, ở cả 3 biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội, có 4 gen trong số 16 gen này tham gia đó là ATRX, SPAST, KDM5C, SHANK2. Ngoài ra, gen ATRXN1, PCLB1 những gen có vai trò rất quan trọng, thể hiện kích thước và màu xanh của vòng tròn đại diện (Hình 3.5). Chỉ sộ độ tin cậy của mức độ tương tác giữa gen SPAST và PPP1R12A là 0,55. trong khi chỉ số này của sự tương tác giữa gen ATN1 và KDM5C là 0,61. Hình 3.5. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07 3.1.6.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 có 11 biến thể mới nằm 10 gen: HECW2, RYR2, PLCH2, SPEN, ADAMTS9, RBM47, IQCE, MUC5B, MUC16, UMODL1 3.1.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 3.1.7.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T08 Kết quả chọn lọc cho thấy, ở bệnh nhân T08 có 15 biến thể, các biến thể này nằm trên 14 gen liên quan dến ASD: CASK, DLGAP2, DOCK4, FOXP1, GABRB3, RBFOX1, RELN, SCN1A, SHANK2, SHANK3, SOX5, CACNA1D, CACNA1F, KCNMA1. Sau khi đưa dữ liệu các gen này vào hệ thống phân tích mối tương quan, kết quả cho thấy sự quan trọng của 2 gen và CACNA1F khi tham gia vào cả 3 biểu hiện. Gen SHANK2 có mối tương quan với gen PLCB1, EFNB2 là những gen quan trọng trong hệ thống, biểu hiện ở hình tròn đại hiện màu xanh. Gen CACNA1F liên quan đến gen ACRV1 (Hình 3.6), với chỉ số độ tin cậy là 0,63. Hình 3.6. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T08 3.1.7.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08 Đối với kết quả chọn lọc các biến thể trên những gen mới, bệnh nhân T08 có 14 biến thể, trên các gen: KIAA1109, OR52E8, NFRKB, WHSC1L1, FLG, INSRR, IL17RC, MUC5B, BCL9L, ENO2, GGA2, SMTNL2, MUC16, BTAF1. 3.1.8. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09 3.1.8.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T09 Hình 3.7. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09 Sau các bước chọn lọc, kết quả phân tích ở bệnh nhân T09 thu được 22 biến thể trên 19 gen đã biết liên quan đến bệnh tự kỷ: ANKRD11, ARX, ATRX, AVPR1A, CHD7, CNTNAP5, DOCK4, EHMT1, FOXP1, KCNQ5, KLHL3, MED12, MET, NRXN1, OPHN1, RBFOX1, SMC1A, SOX5, CACNA1G. Mối tương quan giữa các gen này với các gen liên quan đến các biểu hiện đặc trưng của bệnh nhân tự kỷ cũng được phân tích. Kết quả cho thấy, trong số 19 gen đưa vào phân tích, gen MET, CACNA1G và AVPR1A tham gia ở cả 3 biểu hiện. AVPR1A được đánh giá là gen quan trọng trong sự hình thành các biểu hiện tương tác xã hội, hành vi, giao tiếp. MET có vai trò quan trọng trong biểu hiện hành vi. Các gen này được đánh dấu màu xanh ở hình tròn đại diện (Hình 3.7).Các mối tương tác trong các gen này đều có chỉ số tin cậy trên 0,6. 3.1.8.1. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09 Ở bệnh nhân T09, số biến thể được tìm thấy trong các gen mới sau các bước chọn lọc là 12 biến thể, bao gồm 11 gen CNTN5, PDE4DIP, KDM3B, ABCA1, CTBP2, MUC5B, TRPM7, CCBE1, MUC16, ZNF208, PGC 3.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER KIỂM CHỨNG CÁC BIẾN THỂ MỚI TRÊN CÁC GEN TIỀM NĂNG 3.2.1. Gen RYR3 Kết quả WES từ 7 bệnh nhân cho thấy, 2 bệnh nhân T06 và T07 mang 2 biến thể mới trên mỗi gen RYR2 ( bệnh nhân T07) và RYR3 (bệnh nhân T06). Như đã trình bày ở phần tổng quan tài liệu, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca2+ trong quá trình phát triển thần kinh (Krey and Dolmetsch 2007). Ngoài ra, RYR3 đã được chứng minh có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Bên cạnh đó, RYRs còn nằm trên nhiễm sắc thể 15q14-q14 khu vực nhạy cảm với bệnh tự kỷ (Sorrentino et al, 1993). Kết quả giải trình tự Sanger biến thể trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06 (Hình 3.8) cho thấy bệnh nhân mang hai biến thể thay thế dạng dị hợp tử. Bệnh nhân thừa hưởng biến thể p.L111P từ bố và biến thể p.R3048C từ mẹ. Biến thể đầu tiên (p.L111P) xảy ra trong exon 4, trong đó T được thay thế bằng C ở vị trí 332 trong cDNA, dẫn đến việc thay thế Leu (L) bởi Pro (P) tại vị trí 111 trên protein RYR3. Biến thể thứ hai (p.R3048C) đã được quan sát thấy trên exon 65, trong đó C đã được thay thế bởi T ở vị trí 9142, dẫn đến sự thay đổi của một amino acid ở vị trí 3048, nơi Arg (R) được thay thế bởi Cys (C) trên protein RYR3. Ngoài ra, biến thể p.L111P còn nằm trên vùng domain MIR1 của protein RYR3. MIR1 nằm tại vị trí amino acid 100 đến 150. Domain MIR được biết đến là vùng chức năng quan trọng của RYRs. Cả 2 biến thể đều nằm trên vùng bảo thủ của RYR3 cho thấy mức độ quan trọng của vị trí độ biến. Hình 3.8. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06 3.2.2.Gen RYR2 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 Tương tự như gen RYR3, RYR2 có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu AT. et al, 2012; Schmunk G. et al. 2015). Jihane Soueid và cộng sự đã tìm những biến thể trùng lặp trên gen RYR2 ở bệnh nhân tự kỷ Lebanese cho thấy sự liên quan đáng kể của gen này đến bệnh tự kỷ (Jihane Soueid et al, 2016). Hình 3.10. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 Các nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng của RYR2 trong việc kiểm soát cân bằng nồng độ ion Ca2+ nội mô, và liên quan đến những vấn đề về stress, nhận thức. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho thấy, bệnh nhân T07 mang một biến thể dị hợp tại vị trí c.2401 C>T, gây biến đổi trên protein tại vị trí 801, amino acid Arg bị biến đổi thành Cys. Biến thể này được di truyền từ người mẹ không mang bệnh. Biến thể xảy ra làm xuất hiện một liên kết Hydro giữa amino acid Cys801 và Leu803. Biến thể thứ 2 là tại vị trí c.2456A thành G, gây biến đổi amino acid Tyr thành Cys trên protein tại vị trí 819. Đây là một biến thể mới phát sinh, không di truyền từ bố hoặc mẹ. Mô hình mô phỏng cấu trúc không gian của biến thể này cho thấy, khi biến thể xảy ra, sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc 1 của protein, làm xuất hiện 1 cầu nối Hydro giữa Cys801 và Leu803. 3.2.3. Gen MUC16 Kết quả WES cho thấy tần suất xuất hiện biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ trong nghiên cứu này là khá nhiều. 6/7 bệnh nhân mang các biến thể trên gen MUC16 (Bảng 3.3).Các biến thể này ở các bệnh nhân và gia đình được kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Trong nội dung tóm tắt này, chỉ kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger ở các bệnh nhân được trình bày. Kết quả giải trình tự cho thấy, các biến thể đều là những biến thể dị hợp tử mới phát sinh, không di truyền từ bố mẹ (Hình 3.11). Bảng 3.3. Tổng hợp các biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ STT Bệnh nhân HGVS.c HGVS.p 1 T02 c.6670G>T p.Ala2224Ser 2 c.40707G>C p.Trp13569Cys 3 T03 c.39687T>A p.Asp13229Glu 4 T06 c.39511C>T p.Leu13171Phe 5 c.38605G>A p.Glu12869Lys 6 T07 c.39499G>C p.Val13167Met 7 T08 c.40707G>C p.Trp13569Cys 8 T09 c.6670G>T p.Ala2224Ser Hình 3.11. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện các biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ 3.2.4. SNP rs7725785 trên gen HTR4 rs7725785 được phát hiện trong 4/7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam. Tuy con số này còn nhỏ, chưa có ý nghĩa thống kê, nhưng kết quả này cũng góp phần làm sáng tỏ hơn nữa vai trò của rs7725785 trong di truyền bệnh tự kỷ nói chung và bệnh tự kỷ ở Việt Nam nói riêng. Hình 3.12. Biến thể c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08, T09 3.3. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Hình 3. 13. Các họ kênh ion và các gen liên quan Gần đây, phương pháp giải trình tự genome, exome đã được áp dụng nhiều trong nghiên cứu sự liên kết đa hình của các biến thể trên các gen nhạy cảm với ASD và liên quan đến các kênh canxi, natri và kali. Từ kết quả WES, chúng tôi thống kê được các biến thể trên các gen phụ trách các kênh vẩn chuyển ion Ca2+, Na+, K+ (hình 3.13). Có thể thấy rằng, các gen chứa biến thể thuộc nhóm gen tham gia vận chuyển ion Ca2+ nhiều nhất. Từ đó cho thấy, vai trò quan trọng của kênh vận chuyển ion Ca2+ đối với bệnh tự kỷ. CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Dẫn truyền tín hiệu thần kinh hầu như là tất cả các khía cạnh của sự phát triển não bộ. Để hiểu rõ hơn về các rối loạn ASD, các nhà khoa học đang tìm kiếm các gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh. Một số các gen mã hóa các kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh. Các biến thể trong các gen liên quan đến các kênh ion có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại, sự khác biệt, di cư, phát triển tự nhiên, và sự hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh. Tế bào thần kinh mã hóa thông tin thông qua các tín hiệu có nguồn gốc từ các kênh ion. Khi một tế bào thần kinh nhận được tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thông qua các khớp thần kinh, tùy thuộc vào các loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh sẽ trở thành tích cực hay tiêu cực. Các đột biến trong các gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến các kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường kích thích não bộ. Những biến đổi trong các gen liên quan đến kênh ion có khả năng ảnh hưởng đến vô số các chức năng não bộ (Naisbitt S, Kim E et al. 1999; Boeckers TM, Bockmann J et al. 2002). Kênh ion thậm chí có thể cung cấp một liên kết giữa di truyền và môi trường bởi vì các yếu tố môi trường như thủy ngân là tín hiệu tăng canxi. Vai trò rộng lớn của các kênh ion có thể giúp giải thích tại sao các bệnh nhân ASD thường kèm theo biến chứng thần kinh khác như vấn đề giấc ngủ và bệnh động kinh. 4.2. CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN BỆNH ĐẶC TRƯNG CỦA ASD Bộ kit TruSight Autism của hãng Illumina được nghiên cứu và phát triển để phát hiện các biến thể trên 101 gen đã được chứng minh có liên quan đến bệnh tự kỷ. Trong khuôn khổ luận án này, danh sách 101 được sử dụng để sàng lọc các biến thể từ kết quả giải trình toàn bộ vùng mã hóa. Bảng 4.1. Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh nhân TT Gen Bệnh nhân T01 T02 T03 T06 T07 T08 T09 1 CASK x x x 3 2 ANKRD11 x x 2 3 ATRX x x 2 4 AUTS2 x x 2 5 AVPR1A x 1 6 CACNA1C x 1 7 CACNA1D x 1 8 CACNA1E x 1 9 CACNA1F x 1 10 CACNA1G x 1 11 CACNA1H x 1 12 CACNA1I x 1 13 CDKL5 x 1 14 CHD7 x 1 15 CNTNAP5 x 1 16 DLGAP2 x x x 3 17 DOCK4 x x x 3 18 DPP6 x x x 3 19 EHMT1 x 1 20 FOXP1 x x x x x 5 21 GABRB3 x 1 22 GRIN2B x x 2 23 HOXA1 x 1 24 KATNAL2 x 1 25 KCNJ10 x 1 26 KCNMA1 x 1 27 KCNQ5 x 1 28 KDM5C x 1 29 KIRREL3 x 1 30 KLHL3 x x x x 4 31 MED12 x x x x 4 32 MET x 1 33 NEGR1 x 1 34 NIPBL x 1 35 NRXN1 x 1 36 OPHN1 x 1 37 PDE10A x 1 38 PTCHD1 x 1 39 PTEN x 1 40 RBFOX1 x x x x 4 41 RELN x x 2 42 SCN1A x 1 43 SCN2A x 1 44 SCN3A x 1 45 SCN5A x 1 46 SCN8A x 1 47 SHANK2 x x x x 4 48 SHANK3 x 1 49 SLC6A4 x 1 50 SMC1A x x 2 51 SMG6 x 1 52 SPAST x 1 53 ST7 x x x 3 54 TCF4 x x 2 55 TRPM1 x 1 56 TSC1 x 1 57 TSC2 x x 2 58 UBE3A x 1 59 VPS13B x x 2 60 ZEB2 x x 2 Tổng 11 14 12 13 14 12 17 Điểm DBC-P 27/17 29/17 29/17 29/17 25/17 29/17 29/17 Điểm CARS 42,5 42,5 41,5 40,5 42,5 40,5 44 Trong 07 bệnh nhân tự kỷ có đến 60 gen trong 101 gen liên quan đến bệnh ASD mang biến thể. Trong các bệnh nhân, bệnh nhân T09 có nhiều gen mang liên quan đến bệnh tự kỷ biến thể nhất. Đây cũng là một trong 5 bệnh nhân này có điểm CBC-P cao đạt 29/17 và điểm CARS cao nhất đạt 44 điểm. Bộ kit này đã được Bock I và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu của họ để chứng minh giải thiết về sự tự phát của bệnh ASD (Bock et al, 2016). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Bock I, các biến thể gen liên quan đến bệnh cũng được sàng lọc dựa trên các công cụ tin sinh. Theo báo cáo, nhóm nghiên cứu đã sàng lọc được 10 biến thể có khả năng liên quan đến bệnh tự kỷ trên các gen SLC9A9, EHMT1, DPP6, DLGAP2, CREBBP, LAMC3, PIP5K1B, NIPBL, ANKRD11, AUTS2. Gần đây nhất, Varga cũng báo cáo một kết quả nghiên cứu sử dụng danh sách 101 gen này trong nghiên cứu về sự liên quan giữa rồi loạn chức năng tỷ thể và bệnh tự kỷ. Kết quả cho thấy, một đột biến denovo trên gen CHD7 gây ra sự xóa mtDNA và hội chứng CHARGE – bệnh nhân mang hội chứng này có đến 30% người mắc bệnh tự kỷ. Ngoài ra, các biến thể trên các gen DHCR7, FOXP2, RAI1 AUTS2, PDE10A, RELN cũng được phát hiện ở các bệnh nhân khác. Tự kỷ được biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại (Butler et al, 2015). Chính vì thế, các gen quy định những biểu hiện này đã được quan tâm và nghiên cứu nhiều. Từ kết quả WES, áp dụng công cụ phân tích sự tương tác giữa các gen của trường Đại học Precenton (Krishnan et al, 2016), các gen đã được phân tích trong từng biểu hiện. Từ đó, ở mỗi bệnh nhân, các gen chung liên quan đến sự biểu hiện ở các đặc điểm điển hình của từng bệnh nhân được tìm thấy. Trong đó, có đến 4 bệnh nhân (T02, T06, T07, T08) mang biến thể trên gen SHANK2, 3 bệnh nhân (T01, T03, T06) mang biến thể trên gen DPP6, 2 bệnh nhân (T01, T02) mang biến thể tren gen CASK. Theo các nghiên cứu trước đây, một biến thể trên gen CASK được xác định từ một nhóm ASD (Simons Simplex Collection) trong nghiên cứu của Iossifov và cộng sự (Iossifov et al, 2014). Gần đây, đã có thêm nhiều bằng chứng, chứng minh nguyên nhân di truyền của bệnh tự kỷ từ các đột biến trên gen này (Huang and YP, 2017; Stessman et al, 2017). Gen DPP6 mã hóa protein DPP - Dipeptidyl-peptidase 6, là một tiểu đơn vị của kênh dẫn truyền ion K+ tuýp A Kv4. Ngoài vai trò làm tăng biểu hiện trên bề mặt kênh dẫn truyền, DPP6 còn có vai trò quan trọng trong sự vận động và bám dính của tế bào, ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của synap vùng đồi thị. Vì vậy, gen DPP6 liên quan đến một số rối loạn hệ thần kinh trung ương ở người gồm tự kỷ và tâm thần phân liệt (Lin et al, 2013). Nhiều biến thể CNV đã được phát hiện trên gen DPP6 ở bệnh nhân tự kỷ (Marshall et al, 2008) Gen SHANK2 thuộc họ gen SHANK bao gồm 3 thành viên (SHANK1, SHANK2 và SHANK3) mã hóa cho các protein giàn giáo cần thiết cho sự hình thành cấu trúc và chức năng thích hợp của các khớp thần kinh. Các protein SHANK đều bao gồm nhiều vùng (domain), là những protein xoắn hình khăn, được sinh ra tại kì sau phân bào. Chúng liên kết trực tiếp điểm thụ cảm hệ thống dẫn truyền thần kinh, các kênh ion và những protein màng khác đến actin cytoskeleton và G-protein. Protein SHANK không những có chức năng kiểm soát tổ chức mật độ khớp thần kinh mà còn có khả năng tạo phức hệ thụ thể khớp thần kinh, phân tử tín hiệu và protein liên quan đến tế bào xương có trong cột sống (Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002). Đã có rất nhiều đột biến được phát hiện trên gen SHAN