Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, trong một chi rong câu

Gracilaria cũng có sự biến dị về thành phần các axit béo. Ví dụ thấy rõ

nhất ở mẫu A22 (loài Gracilaria gigas) xuất hiện 4 axit mạch dài là C21:0,

C22:2n-6, C22:5n-3, C22:6n-3 (DHA) trong khi đó không phát hiện ở 3

loài cùng thuộc chi rong Câu.

• Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong

Đỏ thu tại các tỉnh khác nhau khác nhau

Nghiên cứu được tiến hành trên 8 mẫu của cùng loài rong Câu chỉ

vàng thu ở 8 tỉnh, thành khác nhau (từ Quảng Ninh đến Bình Thuận) và 1

mẫu xuất xứ từ mẫu T28 được nuôi trong PTN của Viện (nhiệt độ phòng

nuôi là 20-220C) để xem xét sự hình thành và tích luỹ axit béo của cùng 1

loài trong các điều kiện sinh thái khác nhau.

pdf28 trang | Chia sẻ: mimhthuy20 | Lượt xem: 556 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
bằng phương pháp đặc hiệu Bligh&Dyer, 1959, sử dụng hệ dung môi CHCl3 : CH3OH với tỉ lệ 1/2 (v/v). 2.2.2.2. Phương pháp phân lập các axit béo, AA, PG Để phân lập các axit béo, axit arachidonic, prostaglandin từ rong đỏ sử dụng các phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lớp mỏng điều chế, sắc kí cột áp xuất thường (CC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). 6   2.2.3. Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng và cấu trúc các axit béo, AA, PG 2.2.3.1. Các phương pháp xác định thành phần, hàm lượng các hợp chất Thành phần và hàm lượng axit béo xác định theo phương pháp ISO/FDIS 659:1998, sử dụng GC-FID và GC-MS. Xác định hàm lượng prostaglandin (dạng đã được methyl và silyl hoá) bằng GC-MS. 2.2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc các hợp chất Sử dụng phương pháp phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử ESI- MS, phổ khối bắn phá điện tử EI-MS, phổ khối phân giải cao LCMS-IT- TOF, các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY. 2.2.4. Phương pháp phân tích cấu tử chính Phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA, Principle Component Analysis) và phân tích chùm (cluster analysis) được sử dụng để xử lý các số liệu đa biến về thành phần các axit béo của các mẫu rong đỏ nhằm tìm ra các mối tương quan của chúng với nhau. Phần mềm Statistica-PCA 69 được sử dụng để thực hiện phép phân tích cấu tử chính và phần mềm Surfer 32 được sử dụng để thực hiện phép phân tích chùm. Các số liệu được xử lý trước khi phân tích bằng phần mềm Microsof Excel. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM Các mẫu được tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ chung như sau: 7   3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipit tổng Cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ bằng máy xay, chiết bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH tỉ lệ 1:2 (100ml CHCl3: 200ml CH3OH), siêu âm trong 6 giờ. Bổ sung 100ml CHCl3, thêm 100ml nước cất, lắc đều, đợi phân lớp lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước cất thêm 2 lần sau đó làm khan bằng Na2SO4. Cô cất loại dung môi thu lipit tổng (phương pháp chiết được lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). 3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axít béo Lấy 10mg lipit tổng được hòa tan với 1ml n-hexan trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% và lắc kĩ trong 1 phút. Thêm vào 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kĩ và đem ly tâm ở chế độ 5000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch trong, sạch ở pha trên được tách riêng, kiểm tra trên sắc kí bản mỏng (TLC). Tiến hành phân tích trên máy sắc kí khí GC, nhận dạng axit béo bằng phần mềm chuyên dụng, tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL (Equivalent Chain Length) có sử dụng hệ chất chuẩn là các axit béo C16:0 và C18:0. Kết quả được tính theo công thức: ECL = ±16 2(lg RTx – log T16:0) lg RT18:0 – lg RT16:0 3.3. Sàng lọc định tính, định lượng prostaglandin 3.3.1. Phân tích định tính prostaglandin Lấy 25g rong tươi, nghiền trong nitơ lỏng, bổ sung 50ml nước cất, khuấy bằng máy khuấy từ trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 5-60C. Nhỏ từ từ axit HCl đặc và kiểm tra cho đến khi pH = 2-3, khuấy tiếp 60 phút. Chiết bằng etyl axetat 50ml (2 lần), để phân lớp thu phần dịch phía trên. Cô cất chân không ở nhiệt độ < 300C thu cặn chiết etyl axetat. Kiểm tra bằng bản mỏng silicagel 60 GF254 với hệ dung môi dioxan:benzen:axit axetic (30:50:2), thuốc thử là dung dịch H2SO4/MeOH 5%, phát hiện định tính PGE2 có màu vàng nhạt, sử dụng chất chuẩn PGE2 có độ tinh khiết 93% cung cấp bởi hãng sigma. 3.3.2. Phân tích định lượng PGE2 trong các mẫu rong Đỏ Dịch chiết etyl axetat được metyl và silyl hoá và xác định hàm lượng PGE2 bằng GC-MS. Nhận dạng prostaglandin bằng phần mềm chuyên dụng, tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ECL, sử dụng hệ chất 8   chuẩn là PGB2 và PGE2. Tính toán hàm lượng PGE2 có trong 1 g rong tươi (µg/g rong tươi). 3.3.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ prostaglandin và axit béo trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla của Nga nuôi trong PTN ở Việt Nam Mô tả chi tiết cách bố trí thí nghiệm theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của loài rong G. vermiculophylla nuôi trong phòng thí nghiệm. Thu mẫu và phân tích đánh giá biến động hàm lượng PG, các axit béo. 3.4. Phân lập prsotaglandin từ rong Đỏ 3.4.1. Phân lập PGE2 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Sơ đồ phân lập PGE2 gồm các bước: Xử lí mẫu; Chiết dịch tổng bằng etyl axetat; Phân lập và tinh chế PGE2 bằng HPLC điều chế. • Các dữ liệu phổ của PGE2 phân lập được: Hợp chất phân lập được dạng bột, màu vàng. Điểm nóng chảy 65,5 – 660C. Rf = 0,5 (TLC, silica-gel, C6H6 : EtOAc 1:1, màu vàng, H2SO4 10%/ MeOH). Phổ khối ESI-MS: m/z = 375 [M+Na]+. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 5,62 (1H, m, H- 14); 5.58 (1H, m, H-13); 5,43 (1H, m, H-5); 5,34 (1H, m, H-6); 4,06 (2H, m, H-11, H-15); 2,70 (1H, ddd, J = 1.5, 7.5, 18.0 Hz, H-10a); 2,42 (1H, m, H-12); 2,35 (2H, m, H-7); 2,29 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 2,18 (1H, m, H-8); 2,17 (1H, m, H-10b); 2,09 (2H, m, H-4); 1,67 (2H, qd, J = 2,0; 7,5 Hz, H- 3); 1,58 (1H, m, H-16a); 1,48 (1H, m, H-16b); 1,30-1,40 (6H, m, H-17, H- 18, H-19) và 0,91 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-20). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & CD3OD), δ ppm: 216,7 (C-9); 177,0 (C-1); 137,4 (C-14); 131,8 (C-13); 131,6 (C-5); 127,3 (C-6); 73,4 (C- 15); 72,5 (C-11); 55,3 (C-8); 53,9 (C-12); 47,1 (C-10); 37,9 (C-16); 34,1 (C-2); 32,5 (C-18); 27,4 (C-4); 26,0 (C-17); 25,6 (C-3); 25,5 (C-7); 23,3 (C-19) và 14,3 (C-20). 3.4.2. Nhận biết PGE3 từ loài rong câu Gracilaria vermiculophylla Dịch chiết etyl axetat của loài rong câu Liên bang Nga Gracilaria tenuistipitata được tách thành các phân đoạn trên cột thường. Phân đoạn 5 giàu PGE3 (phát hiện bằng TLC) được phân tích bằng phương pháp HPLC 9   liên kết với MS/MS phân giải cao trên máy LCMS-IT-TOF của hãng Shimadzu. Chế độ HPLC: cột C18 (100mm x 2,1mm, ID 3 µm, Supelco, USA), hệ dung môi MeOH:AcOH:H2O biến đổi gradient, tốc độ dòng 2ml/phút. Chế độ MS: Mẫu đo được ion hóa bằng phương pháp APCI (positive-ion mode), quá trình phân mảnh của các ion giả phân tử được xác định bằng MS/MS dùng khí Argon để bắn phá. 3.5. Phân lập, tinh chế thu nhận axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria tenuistipitata Sơ đồ phân lập AA gồm 4 bước: Chiết lipit tổng; Thuỷ phân lipit tổng; Làm giàu các axit béo không no bằng phương pháp tạo muối với LiOH; Phân lập và tinh chế AA. • Các dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được (etyl arachidonat) Phổ khối EI-MS: m/z = 332 [M]+ Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 5,37 (8H, m, H-5, H-6, H- 8, H-9, H-11, H-12, H-14, và H-15); 4,12 (2H, q, J = 7,0; 14.0 Hz, H-21); 2,81 (6H, m, H-7, H-10, H-13); 2,30 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2); 2,10 (2H, m, H-4); 2.06 (2H, m, H-16); 1,70 (2H, q, J = 7.5 Hz, H-3); 1.36 (2H, m, H- 19); 1,30 (4H, m, H-17, H-18); 1.27 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-22); 0,90 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-20). Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3,), δ ppm: 173,6 (C-1); 130,4 (C- 15); 129.0 (C-8); 128,8 (C-9); 128,5 (C-11); 128,2 (C-12 và C-14); 127,9 (C-5); 127,5 (C-6); 60,2 (C-21); 33,7 (C-2); 31,5 (C-18); 29,3 (C-17); 27,2 (C-16); 26,5 (C-4); 25,6 (C-3, C-7, và C-10); 24,8 (C-3); 22,5 (C-19); 14,2 (C-22); 14,0 (C-20). CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu sàng lọc lipit và axit béo của rong Đỏ 4.1.1. Khảo sát hàm lượng lipit tổng Kết quả xác định hàm lượng lipit tổng của 69 mẫu rong Đỏ, chúng tôi chia thành 4 nhóm: Nhóm I có hàm lượng lipit ≤0,2% (nhóm có hàm lượng lipit thấp); Nhóm II từ >0,2 đến ≤0,4% (nhóm có hàm lượng lipit trung bình); Nhóm III từ >0,4 đến ≤0,6% (nhóm có hàm lượng lipit cao); 10   Nhóm IV >0,6% (nhóm có hàm lượng lipit rất cao). Hàm lượng lipit tổng của 68 mẫu rong Đỏ ở Việt Nam dao động từ 0,118 đến 0,734% khối lượng tươi trong đó có 14 mẫu thuộc nhóm I, 45 mẫu thuộc nhóm II, 5 mẫu thuộc nhóm III và 4 mẫu ở họ rong Đông thuộc nhóm IV có 4 mẫu có hàm lượng lipit tổng đạt 0,604-0,734%. Riêng mẫu rong câu của LB Nga có hàm lượng lipit cao nhất, đạt 1,39% khối lượng tươi. 4.1.2. Khảo sát thành phần và hàm lượng các axit béo 4.1.2.1. Thành phần và hàm lượng axit béo của rong câu Đã xác định được 55 loại axit béo có mạch cacbon từ C12 đến C25. Axit béo no SFA: hàm lượng SFA trung bình là 69,886%, dao động từ 34,68% (mẫu TAX) đến 84,8% (mẫu N15). 50% số mẫu có hàm lượng SFA trong khoảng từ 66,025% đến 75,455%. PUFA: hàm lượng trung bình là 9,807% dao động từ 1,06 đến 49,41%. 50% số mẫu có hàm lượng PUFA trong khoảng từ 4,9 đến 12,43%. Trong số mẫu có hàm lượng PUFA cao phải kể đến mẫu TAX hàm lượng cao nhất đạt 49,41%, mẫu A3 là 22,52%, mẫu A5 là 21,33%, mẫu A16 là 17,86%. HUFA: hàm lượng trung bình là 7,191%, dao động từ 0 đến 35,53%. Chỉ trừ mẫu N15, tất cả các mẫu đều chứa HUFA, một số mẫu có hàm lượng HUFA rất cao như TAX là 35,53%, T28 là 19,47%, A5 là 18,76%, A16 là 15,51%, A3 là 14,93%. Omega-3: hàm lượng chỉ đạt 1,501%, dao động từ 0 đến 18,44%. Thành phần omega-3 chủ yếu là 2 axit béo C20:5n-3 (eicosapentaenoic axit - EPA) và axit C22:5n-3 (Docosapentaenoic acid, DPA). Tuy nhiên, EPA xuất hiện ở nhiều mẫu hơn và có hàm lượng cao hơn, cá biệt có mẫu T29 hàm lượng EPA là 8,17% tổng axit béo. Omega-6: hàm lượng trung bình là 8,174%, dao động từ 0,61% đến 46,34%. Omega-6 cao nhất là mẫu rong Câu Nga đạt 46,34%, gấp > 2 lần mẫu có hàm lượng cao nhất của Việt Nam (mẫu A5), đạt 21,08%. Thành phần omega-6 chủ yếu là 3 axit: C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n- 6, trong đó axit chiếm hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu là C20:4n-6 (axit arachidonic). 11   Omega-9: Hàm lượng nhóm omega-9 trung bình đạt 10,389%, dao động trong khoảng 3,17 đến 19,79%. Trong đó chủ yếu là axit C18:1n-9 (axit oleic), trung bình đạt 9,39%. Về chỉ số PUFA/SFA: Giá trị trung bình đạt 2,454, dao động từ 0 đến 16,12. Theo khuyến cáo của WHO, yêu cầu cho thực phẩm lành là chỉ số PUFA/SFA >0,4 thì có đến 45/47 mẫu (chiếm 95,7%) đạt yêu cầu. Về chỉ số n3/n6: Giá trị trung bình đạt 0,176, dao động từ 0 đến 4,64. Theo khuyến cáo của WHO, thực phẩm có chỉ số n3/n6 >0,1 là tốt cho sức khoẻ con người. Kết quả phân tích cho thấy có 24 mẫu đạt yêu cầu, trong đó có một số mẫu có chỉ số n3/n6 cao như: T29 (2,17), A3 (2,11), A16 (1,3), T28 (0,93). 4.1.2.2. Thành phần và hàm lượng các axit béo của các loài thuộc chi Hypnea họ rong Đông Axit béo no: chiếm hàm lượng cao, trung bình là 67,53%, dao động từ 53,52% đến 78,44%. PUFA: Hàm lượng PUFA của họ rong Đông tương đương với họ rong Câu. Hàm lượng PUFA trung bình đạt 9,07%, dao động từ 3,88% đến 29,13%. HUFA: Hàm lượng HUFA của họ rong Đông thấp hơn họ rong Câu. Hàm lượng trung bình là 6,02%, doa động từ 1,57% đến 22,35%. Omega-3: Hàm lượng omega-3 của họ rong Đông cao hơn họ rong Câu xong hàm lượng vẫn thấp, đạt trung bình là 3,1%, dao động từ 0 đến 6,78%. Tiếp tục phát hiện 02 mẫu có DHA là N2 và N11 với hàm lượng tương ứng là 1,07% và 2,61%. Omega-6: Hàm lượng omega-6 của họ rong Đông thấp hơn họ rong Câu, đạt giá trị trung bình là 5,87%, dao động từ 1,38% đến 22,35%. Hai axit béo omega-6 xuất hiện phổ biến ở các mẫu là C18:2n-6 (9/10 mẫu), C20:4n-6 ( 8/10 mẫu). Khác với chi Gracilaria, họ rong Câu (Gracilariaceae), thành phần axit béo của các mẫu thuộc chi Hypnea, họ rong Đông (Hypneaceae) có sự khác biệt rõ rệt giữa các loài thậm chí cả trong quần chủng loài như các mẫu N6, N10 và N11 của loài H. flegilliformis hoặc ở các mẫu N12 và T11 12   của loài H. japonica. Ví dụ như đối với AA ở các mẫu N10 và N11 của loài H. flegelliformis hàm lượng chỉ đạt 0,33 và 0,1% thì ở cùng loài là N6 lại lên tới 22,35%. 4.1.2.3. Thành phần và hàm lượng các axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ Ceramiaceae, Bangiaceae, Hylamaniaceae, Bonnemaisoniaceae, Phyllophoraceae, Rhodymeniaceae, Halymeniaceae Biểu đồ 4.2. Hàm lượng các họ axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ Đã xác định được 47 axit béo C12 đến C24. Axit béo no: Hàm lượng SFA trung bình là 65,05%, dao động từ 40,18% đến 76,92%. PUFA: hàm lượng trung bình là 13,47%, dao động từ 3,35% đến 36,12%. 50% số mẫu trong khoảng 7,51% đến 12,78%. HUFA: hàm lượng trung bình là 9,48%, dao động từ 0 đến 30,8%. 50% số mẫu nằm trong khoảng từ 2,88% đến 11,67%. Omega-3: Đã phát hiện 9 axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C22 có hàm lượng trung bình là 3,84%, dao động từ 0 đến 17,67%. Tiếp tục phát hiện 2 mẫu rong Đỏ có chứa DHA là mẫu N4, loài Liagora sp1, hàm lượng đạt 1,82% và mẫu T2, loài Grateloupia lithophila, hàm lượng đạt 0,6% tổng axit béo. Omega-6: Đã phát hiện 10 axit omega-3 mạch cac bon từ C18 đến C23 có hàm lượng trung bình là 9,6%%, dao động từ 2,1% đến 18,89%. Thành phần omega-6 quan trọng nhất là AA (11/12) mẫu, điển hình là mẫu T2, và N9 (loài Grateloupia lithophila) hàm lượng AA đạt lần lượt là 16,1% là 14,45%. 13   Về chỉ số PUFA/SFA: Giá trị của chỉ số này thấp hơn nhiều so với hai họ rong Câu và rong Đông, trung bình là 0,24, dao động từ 0,04 đến 0,9. Về chỉ số n3/n6: Giá trị trung bình là 0,54, dao động từ 0 đến 2,44. Trong 12 mẫu có 50% số mẫu đạt mức >0,1 là: N4 (2,44), CC1 (1,67), N9 (0,97), N7 (0,6), T12 (0,35) và N1 (0,24). 4.1.2.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích luỹ lipit và hình thành các axit béo của rong Đỏ Chúng tôi tìm hiểu sâu về biến động của sự tích luỹ lipit và axit béo cũng như sự hình thành chúng ở các mẫu đặc trưng cho các họ, các chi và các loài rong Đỏ thu ở một số vùng sinh thái trên biển. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại đảo Cồn Cỏ - Quảng Trị. Cồn Cỏ - Quảng Trị đặc trưng của vùng biển miền Trung có khí hậu chủ yếu là nắng, nóng trong năm. Chúng tôi đã nghiên cứu 11 mẫu của 11 loài thuộc 8 họ rong Đỏ (bảng 4.3) là đặc trưng cho các họ rong Đỏ khác nhau trong một vùng sinh thái. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sinh tổng hợp axit béo không chỉ rất khác biệt giữa các mẫu khác họ mà còn ở những cặp mẫu của các loài có quan hệ phát sinh sinh vật gần gũi (cùng chi) như N2/N6, N4/N7 và N5/CC2. Minh chứng qua hàm lượng AA (C20:4n-6) và EPA (C20:5n-3). Chẳng hạn như trong khi ở mẫu N6 hàm lượng AA rất cao (22,35%) thì ở mẫu N2 lại vằng mặt hoạt chất này. Tương tự như vậy ở mẫu N7 không phát hiện được AA và EPA trong khi hàm lượng các hoạt chất này ở N4 lần lượt là 1,7 và 6,24% tổng axit béo. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại khu vực Phù Long - Hải Phòng Khu vực Phù Long – Hải Phòng là khu vực điển hình cho vùng biển Đông Bắc, nơi có một mùa đông lạnh trong năm, tập trung nhiều loài thuộc chi rong Câu. Chúng tôi thu thập được 4 loài thuộc chi rong Câu tại khu vực này. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipit của các mẫu ở mức trung bình và thấp. Về thành phần axit béo, chúng có 3 đặc trưng tương tự như 8 họ rong Đỏ khác thu tại Cồn Cỏ - Quảng Trị là (1) hàm lượng axit 14   béo no rất cao, (2) tỷ lệ về hàm lượng axit béo no thấp thì hàm lượng axit béo không no PUFA và HUFA cao và ngược lại, (3) hàm lượng axit béo họ omega-6 cao hơn omega-3. Các tính chất này phù hợp với các đặc trưng chung của các họ thuộc ngành rong Đỏ công bố trước đây. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, trong một chi rong câu Gracilaria cũng có sự biến dị về thành phần các axit béo. Ví dụ thấy rõ nhất ở mẫu A22 (loài Gracilaria gigas) xuất hiện 4 axit mạch dài là C21:0, C22:2n-6, C22:5n-3, C22:6n-3 (DHA) trong khi đó không phát hiện ở 3 loài cùng thuộc chi rong Câu. • Đúc kết các yếu tố ảnh hưởng trên cơ sở số liệu của các mẫu rong Đỏ thu tại các tỉnh khác nhau khác nhau Nghiên cứu được tiến hành trên 8 mẫu của cùng loài rong Câu chỉ vàng thu ở 8 tỉnh, thành khác nhau (từ Quảng Ninh đến Bình Thuận) và 1 mẫu xuất xứ từ mẫu T28 được nuôi trong PTN của Viện (nhiệt độ phòng nuôi là 20-220C) để xem xét sự hình thành và tích luỹ axit béo của cùng 1 loài trong các điều kiện sinh thái khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù các mẫu rong Câu chỉ vàng thu trải dài trên 8 tỉnh khác nhau nhưng sự tích luỹ lipit và axit béo no không có nhiều biến động. Điều đáng chú ý nhất là axit C20:4n-6 có mặt ở 8/8 mẫu, song hàm lượng rất khác biệt nhau. Điều này cho thấy mặc dù sự hình thành và tích luỹ axit béo nhóm axit béo không no tuy được quyết định vào bản chất sinh học của loài song vẫn chịu tác động không nhỏ của điều kiện tự nhiên. Khi so sánh 2 mẫu rong Câu chỉ vàng (Gracilaria tenuistipitata) thu tự nhiên (mẫu T28) và mẫu nuôi trong PTN, hàm lượng lipit tổng thì không thay đổi đáng kể tuy nhiên thành phần các axit béo thì biến động rất đáng chú ý. Mẫu rong nuôi phát sinh thêm 5 axit là C15:1n-7, C15:1n-5, C16:1n- 9, C17:0 và C20:3n-6. Hàm lượng axit C16:0 đặc trưng cho họ axit béo no của mẫu rong thu tự nhiên giảm 23,2% so với tổng axit béo trong khi đó axit C20:4n-6 tăng 10,03%. Như vậy có thể nhận định điều kiện nhiệt độ trong quá trình sinh trưởng của rong ảnh hưởng lớn đến thành phần và hàm lượng axit béo theo hướng giảm axit béo no và tăng các axit béo không no. 15   4.1.3. Sử dụng phương pháp PCA và phương pháp phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo của các mẫu rong đỏ Từ 69 mẫu rong Đỏ chúng tôi đã xác định được 12 axit béo chính yếu là C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3 và C22:0. Các mẫu rong Đỏ phân bố trên giản đồ 2 chiều như hình 4.1 trong đó thể hiện rõ rệt nhất là các họ Gracilariaceae, Hypneaceae, Ceramiaceae. Hình 4.1. Kết quả phân tích PCA của các loài rong Đỏ Sử dụng phần mềm SURFER 32, chúng tôi biểu diễn biểu đồ phân loại hình đối với 69 mẫu rong đỏ theo các dữ liệu về thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu như hình 4.2 dưới đây. Hình 4.2. Sơ đồ cây phân loại 69 loài rong đỏ dựa vào thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu. Gra1 Gra2 Gra3 Gra4Gra5 Gra6 Gra7 Gra8 Gra9 Gra10 Gra11 Gra12 Gra13 Gra14 Gra15 Gra16 Gra17 Gra18Gra19 Gra20Gra21 Gra22 Gra23Gra24 Gra25 Gra26 Gra27Gra28 Gra29 Gra30 Gra31 Gra32 Gra33 Gra34 Gra35 Gra36 r 37 Gra38 Gra39 Gra40 Gra41 Gra42 Gra43 Gra44 r 5Gra46 GraNga Hyp1 Hyp2 Hyp3 Hyp4 Hyp5 Hyp6 Hyp7 Hyp8 Hyp9 Hyp10 Cer1 Cer2 Cer3 Cer4 Ban1 Ban2 Hyl1 Hyl2 Bon Phy Rho Hal -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 -2.50 -2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 F2 F1 Tree Diagram for Variables Single Linkage Euclidean distances Gr aN ga Hy l2 Gr a15 Ban 2 Ban 1 Gr a11 Phy Hy l1 Ha l Rh o Hy p2 Gr a8 Hy p9 Hy p8 Hy p10 Gr a34 Hy p3 Gr a44 Hy p6 Hy p4 Hy p1 Hy p7 Hy p5 Bon Gr a23 Gr a25 Gr a9 Gr a7 Gr a4 Gr a3 Gr a38 Gr a41 Gr a33 Gr a40 Gr a29 Gr a1 Gr a10 Gr a6 Gr a5 Gr a2 Gr a45 Gr a46 Gr a42 Gr a39 Gr a37 Gr a21 Gr a26 Gr a31 Gr a32 Gr a36 Gr a30 Gr a28 Gr a24 Gr a27 Gr a19 Gr a35 Gr a18 Gr a43 Gr a20 Gr a17 Gr a12 Gr a13 Gr a16 Gr a14 Gr a22 Cer 2 Cer 1 Cer 3 Cer 40 5 10 15 20 25 Lin kag e D ista nce 16   4.2. Kết quả sàng lọc prostaglandin và axit arachidonic từ các loài rong đỏ thu thập được 4.2.1. Kết quả khảo sát định tính PGE2 Chúng tôi đã tiến hành khảo sát định tính PGE2 của các mẫu rong Đỏ bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Hình 4.3. Sắc kí lớp mỏng định tính PGE2 (a). Các mẫu có vết PGE2, (b). Các mẫu không có vết PGE2. Kết quả phân tích cho thấy có tín hiệu về sự xuất hiện PGE2 ở 39 mẫu, trong đó tín hiệu rõ ràng nhất ở mẫu rong Nga (kí hiệu TAX hay M0) và 38 mẫu rong Đỏ Việt Nam. Tuy nhiên, sự xuất hiện các tín hiệu này rất khác nhau, đa phần các mẫu chỉ xuất hiện tín hiệu dạng vết, chỉ có 4 mẫu xuất hiện tín hiệu PGE2 rõ ràng là các mẫu T5, A3, A7, A16. 4.2.2. Kết quả khảo sát định lượng PGE2 Kết quả phân tích định lượng PGE2 đã xác định được 15 mẫu (T5, T22, T28, A3, A4, A5, A6, A7, A16, N3, N6, N9, CC2, T2 và TAX) có hàm lượng PGE2 từ 0,3 – 21,52µg/g rong tươi. Trong đó hàm lượng cao nhất là mẫu rong Câu Nga TAX (loài Gracilaria vermiculophylla), tiếp theo là 2 mẫu rong Câu Việt Nam là mẫu A16 (loài Gracilaria gigas), mẫu T5 (loài Gracilaria tenuistipitata) với hàm lượng lần lượt là 3,6 và 3,4 µg/g rong tươi. So sánh tương quan giữa hàm lượng PGE2 và AA trong 39 mẫu rong Đỏ (bảng 4.6) cho thấy, các mẫu có hàm lượng AA cao thì có khả năng phát hiện PGE2 hàm lượng cao và ngược lại. Tuy nhiên, tỉ lệ tương quan giữa hàm lượng AA và PGE2 ở các họ rong Đỏ là không giống nhau. 17   4.2.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo, prostaglandin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla của Nga nuôi trong PTN ở Việt Nam. 4.2.2.1. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của loài rong câu Gracilaria vermiculophylla trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả nghiên cứu (bảng 4.7 và biểu đồ 4.3). Biểu đồ 4.3. Tốc độ tăng sinh khối của rong Câu G. vermiculophylla Kết quả khảo sát cho thấy rong có khả năng sống khi nuôi trong điều kiện thí nghiệm với thời gian 5 tháng. Đặc biệt là trong 3 tháng đầu, tốc độ tăng trọng đạt 1-3%/ngày, sau đó rong bị chết và ngừng sinh trưởng. 4.2.2.2. Khảo sát sự biến động hàm lượng lipit các axit béo trong quá trình sinh trưởng và phát triển của rong câu G. vermiculophylla Kết quả khảo sát (bảng 4.8) cho thấy, hàm lượng lipit tổng sau 5 tháng nuôi giảm dần từ 1,39% (mẫu M0, M1) xuống còn 0,55% (mẫu M5). Các axit béo no hàm lượng tăng từ 33,68 lên đến 55,76% tổng axit béo (tăng 60,4%). Hàm lượng các axit béo không no PUFA và omega-6 giảm tương ứng từ 49,41% và 46,34% xuống còn 15,91% tổng axit béo ở tháng thứ 5. Trong đó đặc biệt là AA giảm từ 33,3% xuống còn 11,44%. 4.2.2.3. Khảo sát sự biến động PGE2 của rong câu Gracilaria vermiculophylla nuôi trong phòng thí nghiệm Kết quả phân tích hàm lượng PGE2 của các mẫu rong nuôi từ tháng 1-5 lấy mẫu thêm 01 mẫu M6 ở tháng thứ 6 khi rong đã lụi ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Hàm lượng PGE2 của các mẫu rong nuôi (µg/g rong tươi) Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Hàm lượng PGE2 21,52 18,33 - 8,26 5,21 3,16 - 18   Hàm lượng PGE2 giảm dần theo các tháng trong quá trình nuôi từ 21,52 (M0) xuống còn 3,16 (M5). Có 2 mẫu không phát hiện PGE2 là mẫu M2 (khi có sinh vật giáp xác phát triển mạnh) và M6 (sau khi rong đã lụi). 4.3. Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ Phân lập các prostaglandin (PGE2, PGE3) theo sơ đồ hình 4.5. Hình 4.5. Sơ đồ phân lập PG từ rong câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1. Phân lập PGE2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla 4.3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân lập PGE2. Đã xác định điều kiện nghiền mẫu: bằng nitơ lỏng, thêm nước cất và ủ trong các điều kiện tối ưu. Các thông số cho quá trình ủ để phân lập PGE2: nhiệt độ 3-60C, pH 2-3, thời gian: 2h. 4.3.1.2. Tinh chế PGE2 Tách PGE2 trên cột silica gel với hệ dung môi etyl axetat:hexan:axit axetic biến đổi gradient (30:70:2 – 50:50:2 – 70:30:2), thu được các phân đoạn E1-E7. Tiếp tục tinh chế phân đoạn E6 bằng HPLC điều chế thu được PGE2 ở phút thứ 39. Độ tinh sạch >90%. 4.3.1.3. Xác định cấu trúc hoá học của PGE2 19   Từ các kết quả phân tích dữ liệu phổ thu được nêu trên cộng với so sánh với tài liệu tham khảo [89,91] cho phép xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất thu được là prostaglandin E2 (PGE2). Bảng 4.12. Các dữ liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR của PGE2 TT Hợp chất PGE2 1H (δ, J in Hz) 13C (δ, ppm) HMBC COSY 1 177,0 , H-3 2 2,29, t, 7.5 34,1 H-3, H-4 H-3 3 1.67, qd, 3.0, 7.5 25,6 H-4, H-2 H-2, H-4 4 2,09, m 27,4 H-6, H-2, H-3 H-3, H-5 5 5,43, m 131,6 H-7, H-3, H-4 H-4, H-6 6 5,34, m 127,3 H-7, H-8 H-5, H-7 7 2,35, m 25,5 H-5, H-8 H-6, H-8 8 2,18, m 55,3 H-7 H-7, H-12 9 216,7 H-10, H-7 H-10b, H-11 10 2,70, ddd, 1.5, 7.5, 18.0 2,17, m 47,1 H-11 11 4,06, m 72,5 H-13, H-10 H-10, H-12 12 2,42, m 53,9 H-14,H-10 H-11, H-13, H-8 13 5,58, m 131,8 H-11, H-12, H-15 H-12, H-14 14 5,62, m 137,4 H-12, H-15 H-13, H-15 15 4,06, m 73,4 H-13 H-14, H-16 16 1,58, m 1,48, m 37,9 H-15, H-17 17 1,33, m 26,0 H-16 H-16, H-18 18 1,33 m 32,5 H-19, H-20, H-17 H-17, H-19 19 1,35 m 23,3 H-20 H-18, H-20 20 0,91, t, 7.5 14,3 H-19 H-19 Prostaglandin E2 20   4.3.2. Nhận biết prostaglandin E3 Trên phổ khối phân giải cao LCMS-IT-TOF đã xác định hợp chất phân lập được từ phân đoạn E5 là PGE3. Hình 4.16. Phổ LCMS của PGE3 4.3.3. Bàn luận về sự chuyển hoá của axit béo họ eicosanoit thành các prostaglandin bằng enzyme nội sinh từ rong Đỏ Các kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu rong Nga

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdftom_tat_la_thanh_9634_1854850.pdf
Tài liệu liên quan