Tóm tắt Luận án Nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana phòng chống rệp sáp hại cà phê tại Tây Nguyên

cứu về sinh học, sinh thái và các nghiên cứu về tác hại của chúng đối với cà phê (Zurgen Kramez và Heinz Schmutterer, 1978; Anthony và Youdewei, 1983; Coste R., 1955). 1.3. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng Vấn đề nghiên cứu các chủng nấm gây bệnh cho côn trùng đã được các nhà khoa học ở một số trường Đại học và Viện nghiên cứu bắt đầu thực hiện từ những năm 70 của thế kỷ 20. Năm 1975, Tạ Kim Chỉnh và cs đã thu thập mẫu bệnh sâu róm thông Dendrolimus ponctatus và xác định là do loài nấm trắng 6 Beauveria gây ra. Nguyễn Thị Lộc và cs ở Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, 2004 đã sử dụng chế phẩm nấm xanh M. anisopliae để phòng trừ bọ cánh cứng Brontispa longissima hại dừa và rầy nâu hại lúa. Trịnh Văn Hạnh và cs viện Khoa học Thủy lợi đã hoàn thành một dự án sản xuất thử nghiệm nấm Metarhizium để phòng trừ mối hại đê đập (2003- 2005), Phạm Văn Nhạ (2004) đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ châu chấu tại Nam Đàn – Nghệ An và Phủ Cừ - Hưng Yên. Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cs. (1995, 1997, 2000) đã phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng nấm bệnh thuộc 3 loài B. bassiana, M. anisopliae và M. flavoride để phòng trừ cho một số loài sâu hại cây nông, lâm nghiệp. Nguyễn Dương Khuê và cs. (2001) đã nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Metarhzium để thử nghiệm diệt mối C. formosanus trong phòng thí nghiệm. Trường Đại học Nông Lâm thành phố HCM đã nghiên cứu khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisoplie đối với rệp sáp giả (Dysmicoccus sp ) trên cây na, đã xác định 16 mẫu nấm Metarhizium anisopliae và chia làm 2 nhóm Ma-VN1, Ma-VN2 đã được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu GenBank (Võ Thị Thu Oanh và ctv, 2009) 1.3.2. Những nghiên cứu về rệp sáp hại cà phê Các công trình nghiên cứu về cà phê, nhất là về sâu bệnh hại cà phê đều cho biết trong các năm gần đây, rệp sáp là những đối tượng gây hại rất quan trọng trên cà phê cả trên cà phê chè và cà phê vối. Vào những năm đầu của thập niên 1990 rệp sáp đã hủy diệt hàng ngàn ha cà phê thời kỳ kiến thiết cơ bản (Võ Chấp, 1997). Năm 2003-2004 và 2006-2008 dịch rệp sáp đã bùng phát gây hại hàng ngàn ha cà phê cả thời kỳ kiến cơ bản và kinh doanh của một số tỉnh Tây Nguyên. Theo thống kê của Chi Cục Bảo vệ thực vật Đắk Lắk, chỉ tính riêng vùng cà phê Đắk Lắk hàng năm có hàng chục ngàn ha bị hại do rệp sáp, mức hại từ trung bình đến nặng. Rệp sáp hại tất cả các bộ phận trên mặt đất và dưới mặt đất của cây cà phê. Nhiều diện tích cà phê sau khi nở hoa đậu quả bị nhiễm rệp sáp làm rụng 7 hết quả. Các diện tích cà phê bị hại nặng đã giảm năng suất cà phê nghiêm trọng. Rệp sáp gây hại không chỉ làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển, năng suất của cây cà phê trong thời điểm bị hại của năm đó, mà nó còn gây ảnh hưởng cho vườn cà phê vào các năm sau, nếu cà phê không được chăm sóc, hồi phục tốt (Võ Chấp, 1997). Khi rệp sáp hại cà phê ở cấp 4 (tức là trên 75% bộ phận của cây có rệp) thì thiệt hại là 66,6% năng suất cà phê nhân (Phạm Thị Vượng và CTV, 2004). Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thủy (2011), từ năm 2006 đến 2009 tại Đắk Lắk cho thấy mức độ phát sinh và mật độ của rệp sáp tua ngắn Planococcus kraunhiae chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố ngoại cảnh, trong đó yếu tố mưa là quan trọng nhất, ảnh hưởng rất lớn tới sự phát sinh phát triển của rệp sáp bột tua ngắn. CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu và dụng cụ thí nghiệm 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm ngiên cứu: Viện Bảo vệ thực vật, Viện KH Nông lâm nghiệp Tây Nguyên và các tỉnh Đắk Lắk, Gia Lai. - Thời gian nghiên cứu: Từ 2009 đến 2011. 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Các chủng nấm côn trùng được phân lập từ các nguồn khác nhau, các loài rệp sáp, các vườn cà phê vối và các loại môi trường dùng trong nghiên cứu bao gồm: Czapek-Dox, Sabouraud, MT1, MT2, MT3, N1 và N2 2.1.3. Dụng cụ thí nghiệm Nồi hấp khử trùng, tủ sấy vô trùng, buồng cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ định ôn, máy lắc, đèn cực tím, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, pocan, hóa chất các loại, máy cất nước, máy ảnh, cốc thuỷ tinh, ống nghiệm, pipet, đĩa petri, que cấy, bình tam giác, phễu, cối sứ, đũa thuỷ tinh, bông, giấy thấm, dụng cụ phun thuốc. 8 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần rệp sáp và diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại tại Tây Nguyên - Thu thập và tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính sinh học cao trong phòng chống rệp sáp - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê - Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phòng chống rệp sáp hại cà phê 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu thành phần rệp sáp và diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại tại Tây Nguyên Theo phương pháp điều tra của viện BVTV (Phương pháp nghiên cứu BVTV, tập 1 - 1997) 2.3.2. Điều tra thu thập, phân lập, giám định và định loại các chủng nấm ký sinh - Thu thập nguồn rệp sáp bị nấm ký sinh tại một số vùng thuộc Tây Nguyên như Đắk Lắk, Gia Lai theo phương pháp điều tra thu thập mẫu vật trên đồng ruộng. Nấm ký sinh trên rệp sáp được tiến hành phân lập theo phương pháp của Barnett và Hunter (1972) và theo phương pháp thường quy của Viện Bảo vệ thực vật. Giám định theo phương pháp hình thái học kết hợp với giải trình tự gene (Lawrence , 1997). -Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ khác nhau: Các chủng nấm được cấy trên môi trường N1 trong đĩa Petri, mỗi chủng cấy 100 đĩa, cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa, đặt ở các mức nhiệt độ 15; 20; 25; 30 và 350C. Tiến hành theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc thông qua việc đo đường kính khuẩn lạc ở 1; 3; 5; 7; 10; 15 ngày sau cấy. - Đánh giá độc lực của các chủng nấm theo phương pháp đánh giá sơ tuyển bằng phản ứng enzyme ngoại bào trên các cơ chất chitine, lipid, cenllulose và glucose. Sau đó lựa chọn chủng nấm bằng phương pháp đánh giá hiệu lực 9 trên cơ thể rệp sáp. 2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê Quy trình lên men xốp: Tiến hành thí nghiệm trên 5 công thức giá thể nuôi cấy khác nhau: CT1: Giá thể gạo: 100%; CT2: Giá thể gạo + Ngô: 50 – 50; CT3: Giá thể ngô: 100%; CT4: Giá thể gạo + bã mía: 50 – 50; CT5: Giá thể bã mía: 100%. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử/gr chế phẩm. - Nghiên cứu một số dạng phụ gia thích hợp để tạo dạng và kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm. Lựa chọn và xác định 3 loại phụ gia để tiến hành thí nghiệm, ký hiệu là PG1, PG2, PG3 (thành phần phụ gia là các chất trơ). Các dạng phụ gia được phối trộn với bào tử tinh theo 3 tỷ lệ về trọng lượng như sau: CT1: Bào tử nấm; CT2: Bào tử nấm/Phụ gia: 1/6; CT3: Bào tử nấm/Phụ gia: 1/9; CT4: Bào tử nấm/Phụ gia: 1/12. Tiến hành bảo quản ở điều kiện thường (phòng thí nghiệm), sau mỗi tháng bảo quản lấy mẫu và kiểm tra chất lượng chế phẩm sau các tháng bảo quản. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử nảy mầm. - Nghiên cứu hỗn hợp chất bám dính khi sử dụng chế phẩm: Đánh giá hỗn hợp chất bám dính trên môi trường nuôi cấy để biết được khả năng nảy mầm của bào tử. Hỗn hợp nồng độ chất bám dính theo khuyến cáo của nhà sản xuất là 0,3 phần vạn, bổ sung vào môi trường và sau đó cấy dung dịch hòa từ chế phẩm nấm ở nồng độ 10-5 vào các đĩa, đặt trong điều kiện định ôn 5 ngày và tiến hành đếm số lượng bào tử nảy mầm. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử nảy mầm. 2.3.4. Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phòng chống rệp sáp hại cà phê 2.3.4.1. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong phòng thí nghiệm Đánh giá hiệu lực của các chế phẩm nấm trong phòng thí nghiệm, nhà lưới theo Tiêu chuẩn 10 TCN (216 -2003): Quy phạm khảo nghiệm hiệu lực của phân bón hoặc chế phẩm vi sinh đối với cây trồng. Mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 50 cá thể rệp. Pha 3 nồng độ dịch phun cho 3 công thức: CT1: 10 gr chế phẩm/1 lít nước; CT2: 5 gr chế phẩm/1 lít 10 nước; CT3: 2,5 gr chế phẩm/1 lít nước. Bổ sung chất bám dính ở nồng độ 0,3 phần vạn. Chỉ tiêu theo dõi: Số rệp chết sau phun 1; 3; 5; 7; 10; 14 ngày. 2.3.4.2. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm trong nhà lưới Tiến hành thả rệp tuổi 1-2 lên cây, khống chế số lượng rệp thí nghiệm là 50 con/một cây. Nồng độ phun và chỉ tiêu theo dõi tương tự thử nghiệm trong phòng. 2.3.4.3. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm trên đồng ruộng * Thử nghiệm ngoài đồng ruộng diện hẹp: Được tiến hành với 2 loại chế phẩm nấm, mỗi loại nấm tiến hành trên 3 nồng độ (như trên). Mỗi thí nghiệm được bố trí 3 công thức, mỗi công thức 5 cây cà phê nhắc lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi hiệu lực của thuốc sau 1, 3, 5, 7, 10, 14 ngày phun thuốc * Thử nghiệm ngoài đồng ruộng diện rộng: Công thức thí nghiệm: Công thức 1: Phun chế phẩm BIOFUN1; Công thức 2: Phun chế phẩm BIOFUN 2; Đối chứng: Phun nước lã. Phương pháp tiến hành: Trên vườn cà phê trong thời kỳ kinh doanh, kích thước ô thí nghiệm: 300 m2, thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên. Các chỉ tiêu theo dõi: Tính tỷ lệ cành bị nhiễm rệp. 2.3.4.4. Xây dựng mô ứng dụng chế phẩm phòng trừ rệp sáp cà phê trên đồng ruộng * Lựa chọn xây dựng mô hình : Lựa chọn vùng trồng cà phê trọng điểm của khu vực Tây Nguyên, vùng bị hại do rệp sáp nghiêm trọng nhất trong các năm qua. Địa điểm xây dựng mô hình tại Công ty Cà phê tháng 10 – huyện Krông Pắk – tỉnh Đắk Lắk. Diện tích mô hình 3ha và diện tích đối chứng là 3ha. Phun chế phẩm vào các cao điểm của rệp sáp trong mô hình. Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ cành bị nhiễm rệp. Các phương pháp x ử lý số liệu 11 1. Xử lý thống kê bằng chương trình IRRISTAT và SAS. 2. Hiệu lực của chế phẩm được hiệu đính theo công thức ABBOTT ( đối với thí nghiệm trong phòng và nhà lưới ) và theo công thức Henderson- tilton (đối với thí nghiệm ngoài đồng). CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần và diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị rệp sáp hại tại Tây Nguyên năm 2009, 2010 3.1.1. Thành phần rệp sáp hại cà phê tại Tây Nguyên Qua điều tra thu thập được 7 loài rệp sáp hại cà phê tại Đắk Lắk và Gia Lai, thuộc 2 họ của bộ cánh đều là họ rệp sáp bột Pseudococcidae (5 loài), họ rệp sáp mềm Coccidae (2 loài). Trong 7 loài rệp sáp đã xác định được, có 2 loài là rệp sáp bột tua ngắn Planococcus kraunhiae Kuwana và loài rệp sáp mềm xanh Coccus viridis Green là những loài có tần suất xuất hiện với mật độ cao và ảnh hưởng lớn tới năng suất và chất lượng cà phê tại Đắk Lắk và Gia Lai. Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tập trung vào 2 loài rệp gây hại chính là rệp sáp bột tua ngắn và rệp sáp mềm xanh. 3.1.2. Diễn biến tỷ lệ cành cà phê bị một số loài rệp sáp chính hại tại Tây Nguyên năm 2010 - Rệp sáp mềm xanh: Tỷ lệ cành cà phê bị nhiễm tại Buôn Ma Thuột qua các kỳ điều tra cho thấy trong năm có 2 cao điểm là trung tuần tháng 3 và đợt 2 từ tháng 8 đến tháng 9 tương ứng với tỷ lệ cành bị nhiễm ở vườn kiến thiết cơ bản đợt 1 là 78,89, đợt 2 là 68,89. Vườn kinh doanh đợt 1 là 13,33%, đợt 2 là 20,33%. Tại Cưkuin cũng xuất hiện 2 cao điểm tỷ lệ cành bị nhiễm vào trung tuần tháng 3 đến tháng 4 và đợt 2 vào trung tuần tháng 8 đến cuối tháng 9. Trong đó tỷ lệ cành bị nhiễm cao nhất tại vườn kiến thiết cơ bản lên đến 70,11% và ở vườn kinh doanh là 26,66%. Tại Krông Pắk tỷ lệ cành bị nhiễm có thấp hơn ở vùng Buôn Ma Thuột và Cưkuin, tuy nhiên thời điểm nhiễm cao nhất vẫn lên 12 đến 53,33% ở vườn kiến thiết cơ bản và 16,7% ở vườn kinh doanh. Tại Chư Sê – Gia Lai, tỷ lệ nhiễm rệp sáp mềm xanh thấp hơn hẳn các huyện trên, nhưng cũng xuất hiện 2 cao điểm vào tháng 3 và tháng 8. - Rệp sáp bột xuất hiện và gây hại cục bộ tại một số vườn ở thời kỳ đầu vụ khi cây ra hoa và ở giai đoạn quả non. Tại Buôn Ma Thuột rệp sáp bột xuất hiện từ đầu vụ và hại kéo dài tới trung tuần tháng 11 tuy nhiên với tỷ lệ nhiễm không cao. Các vùng khác sau thời điểm rệp xuất hiện vào đầu năm cho tới gian đoạn quả non sau đó mật độ giảm xuống và đến tháng 7-8 tại một số vườn lại phát sinh cục bộ. Tóm lại: Thông qua quá trình điều tra diễn biến tỷ lệ cành bị nhiễm rệp sáp mềm xanh và rệp sáp bột, chúng tôi nhận thấy trên đồng ruộng chúng xuất hiện 2 cao điểm trong năm: Đợt 1 vào tháng 3 đến tháng 4 và đợt 2 vào tháng 8 đến tháng 9. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả khác như Trần Kim Loang (2002), Võ Chấp (2003), Nguyễn Thị Thủy (2011). 3.2. Thu thập và tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính sinh học cao trong phòng chống rệp sáp hại cà phê 3.2.1. Thu thập, phân lập và giám định các chủng nấm ký sinh trên sâu hại - Diễn biến về tỷ lệ nấm ký sinh tự nhiên trên đồng ruộng: Qua kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nấm ký sinh trên rệp sáp mềm xanh ngoài đồng ruộng rất cao. Diễn biến của nấm ký sinh trong năm trên đồng ruộng phụ thuộc nhiều vào ẩm độ, đặc biệt sau những cơn mưa kéo dài ngày thì tỷ lệ nấm tăng đột biến. Trong điều kiện thời tiết từ tháng 1 đến tháng 3, tỷ lệ nấm ký sinh trên đồng ruộng có thấp hơn, sau đó từ tháng 4 tỷ lệ này tăng lên, tuy nhiên có những đợt giảm xuống do thời tiết nhiều ngày không mưa. Tỷ lệ rệp bị nấm ký sinh đạt cao nhất ngoài tự nhiên là 67,22 vào cuối tháng 8 đầu tháng 9. Thu thập mẫu rệp sáp bị nấm ký sinh ngoài tự nhiên, phân lập và giám định các loài nấm bằng hình thái học và giải trình tự gene, kết quả về thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê dược trình bày trong bảng 3.1. 13 Bảng 3.1. Thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê (năm 2009 – 2011) TT Loài nấm Ký hiệu chủng Ký chủ Địa điểm thu 1 Metarhizium anisopliae MR1 Rệp sáp bột Đắk Lắk MR2 Rệp sáp bột Đắk Lắk MR3 Rệp sáp bột Sơn La MR4 Rệp sáp bột Đắk Lắk MR6 Rệp sáp mềm xanh Nghệ An MR7 Rệp sáp bột Đắk Lắk MR8 Rệp sáp bột Gia Lai MR9 Rệp sáp bột Gia Lai 2 Beauveria bassiana BR1 Rệp sáp mềm xanh Sơn La BR2 Rệp sáp bột Đắk Lắk BR3 Rệp sáp bột Nghệ An BR4 Rệp sáp bột Nghệ An BR5 Rệp sáp bột Đắk Lắk BR6 Rệp sáp bột Nghệ An BR8 Rệp sáp mềm xanh Đắk Lắk BR9 Rệp sáp bột Đắk Lắk BR11 Rệp sáp bột Hà Nội BR14 Rệp sáp bột Sơn La 3 Cephalosporium lanoso- niveum BR12 Rệp sáp mềm xanh Đắk Lắk 4 Cordyceps nutans BR7 Rệp sáp bột Đắk Lắk Kết quả đã thu thập được 4 loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê, trong đó loài Metarhizium anisopliae thu được 8 chủng, loài Beauveria bassiana thu được 10 chủng, loài Cephalosporium lanoso-niveum thu được 1 chủng và loài Cordyceps nutans thu được 1 chủng. Như vậy, 2 loài nấm M. anisopliae và B. 14 bassiana là những loài có mức độ xuất hiện gây bệnh trên rệp sáp nhiều. Đây là kết quả lần đầu tiên xác định về thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê tại Việt Nam. Cùng với kết kết quả thu thập, phân lập và giám định các mẫu vật thuộc các loài sâu hại khác được thu thập bổ sung ở các vùng khác nhau đến năm 2011 đã thu thập được 25 chủng thuộc 6 loài nấm gồm: 9 chủng nấm Metarhizium anisopliae trong đó 4 chủng từ Đắk Lắk, 2 chủng từ Gia Lai, 1 chủng từ Sơn La, 1 chủng từ Nghệ An và 1 chủng từ Hà Nội. 12 chủng Beauveria bassiana trong đó 4 chủng từ Đắk Lắk, 4 chủng từ Nghệ An, 2 chủng từ Sơn La, 1 chủng từ Hà Nội và 1 chủng từ Bắc Giang. 1 chủng Cordyceps nutans từ Đắk Lắk , 1 chủng Cephalosporium lanosoniveum từ Đắk Lắk , 1 chủng Toxicocladosporium sp. và 1 chủng Paecilomyces cicadae từ Đắk Lắk. 3.2.2. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm Để xác định môi trường nuôi cấy nấm và nhân giống cấp 1 vừa đạt hiệu quả kỹ thuật về khả năng phát triển và sinh lượng enzyme ngoại bào lớn nhất, vừa đảm bảo hiệu quả kinh tế. Qua thử nghiệm 5 loại môi trường khác nhau, đã xác định được môi trường N1 là môi trường khả thi nhất dùng để tiến hành các thí nghiệm và sản xuất giống cấp 1 trong quy trinh sản xuất chế phẩm. 3.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ khác nhau Tiến hành thí nghiệm khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ 15; 20; 25; 30 và 350C, ẩm độ 85%. Kết quả cho thấy các chủng nấm phát triển thích hợp nhất ở mức nhiệt độ 25oC, hầu hết các chủng nấm phát triển kém ở nhiệt độ 30oC. Khi so sánh đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm BR ở mức nhiệt độ thích hợp, chúng tôi nhận thấy các chủng có tốc độ phát triển nhanh, kích thước khuẩn lạc lớn là BR5, BR10, BR12, BR13, BR15, BR16, đặc biệt là 2 chủng BR15 và BR16 (đạt kích thước trên 70mm sau 15 ngày nuôi cấy). Đây cũng là một trong các chỉ tiêu quan trọng khi tiến hành lựa chọn các chủng nấm để sử dụng làm vật liệu sản xuất chế phẩm. 15 3.2.4. Đánh giá và tuyển chọn độc lực các chủng nấm côn trùng - Đánh giá độc lực của các chủng nấm bằng enzyme ngoại bào Đánh giá khả năng phân giải enzyme ngoại bào của các chủng nấm trên các cơ chất chitine, cellulose, lipid và glucose của các chủng nấm BR được trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Khả năng phân giải một số cơ chất của Enzyme ngoại bào các chủng nấm BR sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường N1 (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng Đường kính vòng phân giải trên các cơ chất (mm) Chitine-T Chitine-C CMC Lipid Glucose BR1 4,0i 5,0g 4,3g 0,0j 3,3h BR2 9,3efg 9,6def 7,0ef 6,3hi 7,0fg BR4 13,3d 13,8bc 9,0cd 12,3c 9,6de BR5 15,3bc 16,0ab 10,6c 11,3cd 7,6ef BR6 7,0h 8,0ef 5,6fg 5,0i 5,0gh BR7 10,0ef 9,0ef 8,0de 10,6cde 8,0ef BR8 13,6cd 13,6bc 14,0e 11,0cde 15,3a BR9 10,6e 10,6de 10,6c 8,0fgh 10,6cd BR10 8,6efgh 8,3ef 8,0de 6,3hi 8,6def BR11 15,6b 15,3ab 14,6ab 15,0b 12,3bc BR12 8,3fgh 7,0fg 9,0cd 8,8fgh 9,0def BR13 17,6a 17,6a 16,0a 17,6a 13,3ab BR14 7,6gh 7,6efg 6,3ef 6,3hi 7,3f BR15 10,0ef 10,3de 10,3c 7,3gh 10,6cd BR16 16,3a 12,0cd 9,3cd 9,6def 9,6de CV % 7,5 10,8 7,6 10,0 9,8 Trên cơ chất chitine-T, chitine-C các chủng nấm BR có khả năng phân giải tốt. Cho đường kính vòng phân giải đạt lớn nhất trên 2 loại cơ chất này là chủng BR13 (đạt 17,6mm), đây cũng là chủng cho đường kính phân giải lớn trên 16 các cơ chất còn lại. Các chủng BR5, BR16, BR11 cũng là các chủng có đường kính vòng phân giải lớn trên các cơ chất. Đánh giá trên các chủng MR cho thấy: Các chủng MR1, MR3, MR4, MR8 có khả năng phân giải tốt các cơ chất thí nghiệm. Hỗn hợp nuôi cấy các chủng với nhau cho lượng enzyme ngoại bào nhỏ hơn so với khi nuôi cấy riêng rẽ, từ đó cho thấy không thể nuôi cấy hỗn hợp để tạo thành chế phẩm đa chủng. - Độc lực của các chủng nấm trên rệp sáp Sau thí nghiệm đánh giá độc lực của các chủng nấm bằng khả năng sinh enzyme ngoại bào và thử độc lực trực tiếp trên cơ thể rệp sáp hại cà phê, chúng tôi đã lựa chọn được 2 chủng nấm có hiệu lực cao nhất là MR4 và BR5 để tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm cho phòng trừ rệp sáp. 3.2.5. Nghiên cứu các phương pháp bảo quản các chủng giống gốc Bảng 3.3. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản tới chất lượng giống gốc (Viện BVTV, 2010 – 2011) Chủng PP bảo quản Số lượng bào tử sau các tháng bảo quản (x108) Ban đầu 3 tháng 6 tháng 9 tháng 12 tháng MR4 Thường (bt/ml) 2,23 1,79a 1,44a 0,90c 0,64c Hút chân không (bt/ml) 2,02 1,88a 1,72a 1,62b 1,56b Glyceryl (bt/ml) 2,03 1,73a 1,56a 1,71a 1,64a CV % 14,2 21,9 1,6 1,3 BR5 Thường (bt/ml) 5,05 4,24b 4,04a 2,92c 1,74c Hút chân không (bt/ml) 5,11 4,88a 4,44a 4,25b 4,17b Glyceryl (bt/ml) 5,07 4,92a 4,52a 4,35a 4,23a CV % 0,5 5,9 0,5 0,6 Ghi chú: Trong phạm vi cột của từng chủng nấm, các chữ cái a; b; c chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05. 17 Từ các thí nghiệm nghiên cứu phương pháp bảo quản chủng giống gốc, chúng tôi nhận thấy bảo quản bằng glyceryl và hút chân không là 2 phương pháp bảo quản tốt, chủng giống gốc vẫn đảm bảo chất lượng tốt sau 12 tháng bảo quản. 2 phương pháp này áp dụng để kéo dài thời gian bảo quản các chủng giống gốc để phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm. 3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng chống rệp sáp hại cà phê 3.3.1. Kết quả lựa chọn môi trường lên men xốp Bảng 3.4. Khả năng sinh bào tử của chủng BR5 loài B. bassiana và chủng MR4 loài M.anisopliae trên một số môi trường sản xuất (Viện BVTV, 2010) Chủng nấm Mật độ bào tử (x109/gr) LSD 5% CV % Gạo Gạo + Ngô(50:50) Gạo + Bã mía(50:50) Ngô Bã mía BR5 3,36a 2,27b 3,10a 3,16a 1,17c 0,51 14,1 MR4 1,89a 1,70a 1,54ab 1,40b 0,89c 0,32 16,9 Thông qua thí nghiệm trên chúng tôi nhân thấy: Bã mía là vật liệu có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm, đặc biệt trong công thức hỗn hợp giữa gạo và bã mía theo tỷ lệ 50:50 thì nấm phát triển tương đối tốt và đạt hàm lượng bào tử đối với nấm BR5 là 3,10 x 109 bào tử/gr, nấm MR4 là 1,54 x 109 bào tử/gr. Tuy nhiên khi sản phẩm đem vào tách triết bào tử tinh và phun ngoài đồng ruộng gặp khó khăn vì khi giá thể là bã mía sấy khô, chúng sẽ gẫy vụn tăm mía ra và làm tắc mặt sàng của máy tách bào tử và làm tắc vòi của bình phun thuốc. Giá thể tốt nhất cho việc tách triết bào tử tinh và ứng dụng phun trên đồng ruộng là gạo. 3.3.2. Nghiên cứu một số dạng phụ gia thích hợp để tạo dạng và kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm Sau khi tách chiết bào tử nấm, chúng tôi tiến hành phối trộn với 3 loại phụ gia là PG1, PG2 và PG3 nhằm kéo dài thời hạn bảo quản chế phẩm. Sau mỗi tháng bảo quản, tiến hành kiểm tra số lượng bào tử còn tồn tại trong sản phẩm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, bào tử tinh khi phối trộn với phụ gia 1 cho thời 18 gian bảo quản kéo dài nhất, trước khi đem vào bảo quản hàm lượng bào tử sống là 0,47x1012 bào tử/gr chế phẩm, sau 12 tháng bảo quản hàm lượng bào tử sống vẫn đạt 0,22x1012 bào tử/gr. dạng phụ gia 2 và 3 khi phối trộn thời gian bảo quản kém hơn. Bào tử tinh nguyên chất chỉ bảo quản được trong 6 tháng. Kết quả này trình bày trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Chất lượng chế phẩm tinh sau các tháng bảo quản khi phối trộn với các dạng phụ gia khác nhau (Viện BVTV, 2010 – 2011) Thời gian bảo quản Số bào tử sống/gr chế phẩm (x1012) BBT BTT+PG1 BTT+PG2 BTT+PG3 Ban đầu 4,79a 0,47a 0,48a 0,47a 1 tháng 4,65a 0,46a 0,45b 0,44ab 2 tháng 3,98b 0,44b 0,43c 0,42abc 3 tháng 3,31c 0,42b 0,41d 0,37bcd 4 tháng 2,86d 0,40c 0,38e 0,34cd 5 tháng 1,73e 0,38d 0,36f 0,34cd 6 tháng 0,33f 0,37d 0,32g 0,30d 7 tháng 0g 0,34e 0,28h 0,11e 8 tháng 0g 0,31f 0,23i 0,09ef 9 tháng 0g 0,28g 0,18j 0f 10 tháng 0g 0,26h 0k 0f 11 tháng 0g 0,24i 0k 0f 12 tháng 0g 0,22j 0k 0f CV% 7,9 2,9 3,1 3,5 Sau khi xác định được dạng phụ gia 1 là tốt nhất, chúng tôi tiến hành thí nghiệm phối trộn Bào tử tinh/phụ gia ở 3 tỷ lệ khác nhau là 1/6; 1/9 và 1/12. Kết quả thí nghiệm cho thấy: Phối trộn bào tử tinh với phụ gia 1 ở tỷ lệ 1/9 hoặc 1/12 sẽ kéo dài được thời gian bảo quản chế phẩm. 3.3.3. Nghiên cứu hỗn hợp chất bám dính khi sử dụng chế phẩm Thí nghiệm hỗn hợp chế phẩm với các chất bám dính nhằm tìm hiểu ảnh 19 hưởng của chất bám dính đến sự nảy mầm của bào tử nấm cho thấy hỗn hợp chế BIOFUN 1 (MR4) với Tween hoặc nước rửa chén Sunligh cho hiệu quả cao nhất và đạt hàm lượng 4,03 x 109 và 4,02 x 109 số bào tử nảy mầm so với 4,04 x 109 bào tử nảy mầm ở công thức không hỗn hợp với bám dính, chế phẩm BIOFUN 2 (BR5) với Tween hoặc nước rửa chén Sunligh đạt hàm lượng bào tử nảy mầm là 5,27 x 109 và 5,34 x 109 số bào tử nảy mầm/gr sản phẩm so với 5,57 x 109 số bào tử nảy mầm ở công thức không hỗn hợp với chất bám dính. 3.3.4. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Qua các kết quả thí nghiệm về công nghệ sản xuất, chúng tôi đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nấm để phòng chống rệp sáp hại cà phê. 3.4. Khảo nghiệm chế phẩm và xây dựng mô hình đánh giá hiệu quả phòng chống rệp sáp hại cà phê 3.4.1. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong phòng thí nghiệm Tiến hành đánh giá hiệu lực của 2 loại chế phẩm là BIOFUN 1 (MR4) và BIOFUN 2 (BR5) trên 2 loài rệp là rệp sáp mềm xanh và rệp sáp bột tua ngắn tại 2 địa điểm là Viện BVTV và Viện KHNLN Tây Nguyên, kết quả thí nghiệm cho thấy: Trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện BVTV, hiệu lực trừ các loài rệp sáp của chế phẩm đạt cao nhất là 71,8%. Tại Đắk Lắk, hiệu quả phòng trừ rệp sáp đạt cao nhất vào tháng 9 (24,40C, ẩm độ 87%) là 77,78% đối với chế phẩm BIOFUN 2 trên rệp sáp bột tua ngắn, chế phẩm BIOFUN 1 là 74,45% đối với rệp sáp thân gốc. 3.4.2. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong nhà lưới Các thí nghiệm đánh giá chế phẩm trên rệp sáp trong nhà lưới tại Viện Bảo vệ thực vật và nhà lưới tại Tây Nguyên. Trong điều kiện nhà lưới tại Viện BVTV, hiệu lực của chế phẩm BIOFUN 2 trừ rệp mềm xanh đạt cao nhất 68,5% sau 14 ngày xử phun. Chế phẩm BIOFUN 1 đạt 67,2%. Trong điều kiện nhà lưới tại Tây Nguyên, chế phẩm BIOFUN 1 và