Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đầu cổ của virus vaccine sởi phối hợp với nimotuzumab trên thực nghiệm

eo chương trình - apoptosis), xâm lấn và di căn tế bào. EGFR đặc biệt quan trọng trong bệnh sinh của ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ (HNSCC). Sự biểu hiện của EGFR gặp ở 92% trong các khối HNSCC. Hơn nữa, sự biểu hiện của EGFR tăng cao trong các khối u trong giai đoạn tiến triển hoặc trong các khối u kém biệt hóa. 1.2.2. Nimotuzumab trong điều trị ung thư đầu cổ Nimotuzumab là một kháng thể đơn dòng có khả năng gắn kết đặc hiệu với EGFR, ngăn chặn kích hoạt thụ thể. Nó nhận ra miền ngoại bào của EGFR và cạnh tranh vị trí gắn của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), ngăn ngừa EGF liên kết và kích hoạt EGFR tiếp theo, ức chế hoạt tính của tyrosin kinase, do đó ức chế sự tăng trưởng của các tế bào khối u. Ngoài ra để đáp ứng với EGFR bị phong tỏa bởi Nimotuzumab, các tế bào khối u giảm khả năng tiết ra các yếu tố tăng sinh mạch máu, như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), dẫn đến giảm sự hình thành mạch máu và tăng số lượng tế bào apotosis. Nimotuzumab (Cimaher) được chứng minh có hiệu quả trong điều trị HNSCC tiến triển không phẫu thuật được. Nimotuzumab được chứng minh là an toàn và ít biến chứng nặng. 1.3. Virus vaccine Sởi (MeV) trong liệu pháp virus điều trị ung thư 1.3.1. Virus sởi Virus sởi là virus có đường kính khoảng 100-300 nm, với một lõi RNA sợi đơn (-), thuộc chi Morbillivirus và họ Paramyxoviruses, được bao quanh bởi một capsid xoắn. Các glycoprotein vỏ bọc của MeV là protein hemagglutinin (H) và fusion (F) làm trung gian cho sự gắn và sự hòa hợp của virus với tế bào. Trong liệu pháp OLV hiện nay, sử dụng các chủng vaccine MeV thuộc các dòng Edmonston bao gồm một số chủng biến đổi thích nghi trong thí nghiệm, liên quan chặt chẽ nguồn gốc từ một chủng lâm sàng lấy từ họng của một em bé có tên là David Edmonston (năm 1954) được cấy truyền trong các tế bào khác nhau, tạo ra chủng MeV giảm độc lực hơn và không gây bệnh. 1.3.2. Thụ thể của MeV MeV sử dụng ba thụ cảm thể là CD46, CD150 và nectin-4 để xâm nhập vào tế bào đích, trong đó quan trọng nhất là thụ thể CD46. CD46 là một glycoprotein xuyên màng type 1 biểu hiện phổ biến ở tất cả các tế bào có nhân. Thụ thể CD46 được tìm thấy biểu hiện ở mức cao ở các tế bào ung thư. Ở các tế bào bình thường có biểu hiện CD46 thấp, MeV có khả năng lây nhiễm nhưng sự hình thành hợp bào là không đáng kể. Ở các tế bào ung thư có biểu hiện thụ thể CD46 cao, nhiễm MeV dẫn đến phản ứng hợp bào mạnh mẽ: MeV gắn với thụ thể xâm nhập vào tế bào, tăng sinh trong tế bào, hình thành hợp bào và tiêu diệt tế bào qua trung gian CD46 tăng lên rõ rệt. 1.3.3. Tính an toàn của vaccine sởi giảm độc lực MeV đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn của một OLV lý tưởng phải có được tính lựa chọn các khối u cao, không gây bệnh cho các mô lành cơ thể, ổn định về mặt di truyền và không có nguy cơ gây bệnh cho cộng đồng. 1.3.4. Các cơ chế gây ly giải tế bào ung thư 1.3.4.1. MeV trực tiếp giết chết tế bào u qua hình thành hợp bào Sự hợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào. Một tế bào bị nhiễm virus có thể hợp nhất 50-100 tế bào lân cận với nhau tạo thành một hợp bào. Đây là một cơ chế lây lan virus mà không cần giải phóng các hạt virus trưởng thành ra khỏi tế bào. Quá trình hợp nhất tế bào làm cho virus giảm tiếp xúc với kháng thể trung hòa của cơ thể vật chủ, virus tránh được sự kiểm soát của hệ miễn dịch. 1.3.4.2. Ly giải tế bào u qua trung gian kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u MeV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm nội sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực bào, tế bào DC, tế bào lympho T. 1.4. Sử dụng phối hợp virus vaccine sởi và kháng thể đơn dòng Nimotuzumab trong điều trị ung thư Có 2 thử nghiệm sử dụng MeV có khả năng nhắm mục tiêu là EGFR để xâm nhập và ly giải tế bào ung thư nguyên bào thần kinh và 1 thử nghiệm với đối tượng là tế bào HNSCC. Cả 3 thử nghiệm đều cho thấy khả năng ức chế và gây chết tế bào ung thư của MeV nhắm mục tiêu EGFR trên cả in vitro và in vivo. Nimotuzumab là kháng thể đơn dòng ức chế EGFR đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị HNSCC. Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành phối hợp MeV với kháng thể đơn dòng Nimotuzumab nhằm mục đích cộng hợp tác dụng điều trị ung thư theo cơ chế của hai liệu pháp trên để có thể đem lại hiệu quả tốt trong điều trị HNSCC in vitro và in vivo. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Động vật: Chuột nhắt thiếu hụt miễn dịch chủng BALB/c, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 18-22g, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm 2.1.2. Vaccine sởi (MeV): virus vaccine sởi chủng Edmonton 2.1.3. Các dòng tế bào: Tế bào ung thư biểu mô vảy đầu cổ người dòng Hep2, tế bào thận khỉ (tế bào Vero) 2.1.4. Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab:chế phẩm CIMAher 2.1.5. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 2.1.5.1. Thiết bị sử dụng: Thước kẹp NSK 150mm, cân điện tử TE3102S Sartorius, phòng sạch nuôi chuột, phòng nuôi cấy tế bào, máy li tâm, máy đo mật độ quang, máy realtime PCR, máy flow cytometry, pipet các kích cỡ khác nhau. 2.1.5.2. Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao: Phiến 6, 96 giếng, đầu côn, các đĩa nuôi cấy, lọc vi khuẩn, ống falcon, eppendorf ... 2.1.5.3. Hóa chất: Môi trường nuôi cấy tế bào M199, EMEM, bộ kít làm thử nghiệm MTT, Annexin V/PI Fluorescein isothiocyanate; bộ kít tách RNA, chuyển cDNA, primers, master Mix, cồn 70, 900... 2.2. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, trong và sau điều trị. 2.2.1. Đánh giá khả năng ức chế tế bào và chết theo chương trình của virus vaccine sởi phối hợp Nimotuzumab trên dòng tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 2.2.1.1. Các chỉ tiêu đánh giá Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ CCID50 Đánh giá khả năng ức chế tế bào Hep2 bằng thử nghiệm MTT Đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp flow cytometry - Đánh giá tế bào chết theo chương trình (sự tăng cường biểu hiện phiên mã gen STAT3 và ISG15) bằng kỹ thuật Realtime PCR. 2.2.1.2. Các kỹ thuật thực hiện a, Kỹ thuật nuôi cấy các dòng tế bào ung thư Tế bào Hep2 và Vero được lấy từ nguồn bảo quản âm sâu (-800C), rã đông thật nhanh (<1 phút). Đưa tế bào vào đĩa nuôi cấy cùng với môi trường EMEM. Khi tế bào phát triển, tách tế bào bằng trypsin-EDTA 1X. b, Phương pháp tăng sinh MeV nguồn gốc vaccine Nhiễm MeV vào tế bào Vero. Sau 9-10 ngày nhiễm virus thu dung dịch chứa MeV Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ CCID50 Đưa tế bào Vero vào phiến 96 giếng nồng độ 104/200µl/giếng. Nhiễm MeV với nồng độ hòa loãng của stock virus từ 10-2 -10-7. Sau 5 ngày nhiễm MeV sử dụng xanh methylen làm chất hiện màu, tính CCID50. c, Đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT Sử dụng MeV và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên phiến 96 giếng với nồng độ pha loãng 10-2 -10-8. Chia 4 nhóm (chứng, chỉ điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm kết hợp). Thời điểm 72 và 96 giờ sau điều trị cho dung dịch MTT vào các giếng, đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 570nm và tính kết quả. d, Phương pháp flow cytometry đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và hoại tử Tăng sinh tế bào Hep2 và đưa vào 6 phiến 6 giếng. Sử dụng MeV và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên các phiến 6 giếng. Chia 4 nhóm (chứng, chỉ điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm kết hợp). Thu tế bào ở các thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ để đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử. e, Đánh giá tế bào chết theo chương trình thông qua sự phiên mã gen STAT3, ISG15 của tế bào nuôi cấy bằng kỹ thuật Realtime PCR Tăng sinh tế bào Hep2 và đưa vào 6 phiến 6 giếng. Sử dụng MeV và Nimotuzumab để điều trị tế bào Hep2 trên các phiến 6 giếng. Chia 4 nhóm (chứng, chỉ điều trị MeV, chỉ điều trị Nimotuzumab và nhóm kết hợp). Thu tế bào ở các thời điểm 48, 72 giờ, tách RNA, chuyển cDNA và tiến hành chạy realtime PCR đánh giá sự phiên mã của gen STAT3 và ISG15 với GAPDH làm nội chứng 2.2.2. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của MeV phối hợp Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u đầu cổ người Hep2 2.2.2.1. Chỉ tiêu đánh giá Theo dõi sự xuất hiện của khối u Theo dõi đáp ứng điều trị ở các nhóm chuột mang u: So sánh kích thước u ở các nhóm theo thời gian điều trị Theo dõi tỉ lệ sống chết của chuột Phân tích tế bào khối u chết theo chương trình bằng phương pháp flow cytomitry Phân tích hình ảnh mô bệnh học của tế bào khối u Phân tích siêu cấu trúc tế bào 2.2.2.2. Các kỹ thuật thực hiện a, Chăm sóc chuột thí nghiệm Chuột nude được nuôi trong phòng sạch, đảm bảo tiêu chuẩn. b, Phương pháp tạo khối ung thư đầu cổ người trên chuột nude Chuột được cố định và tiêm 0,1 ml (106 tế bào) vào dưới da đùi phải. Tính thể tích khối u theo công thức: V = (D x R2) x 0,5 Trong đó: V: thể tích khối u (mm3); D và R là chiều dài của và chiều rộng của khối u (mm). c, Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị Khi khối u phát triển với kích thước khoảng 7-10 mm đường kính, chuột được phân chia ngẫu nhiên vào 4 nhóm, mỗi nhóm 10 chuột: - Nhóm chứng: tiêm TM đuôi 0,1 ml PBS/chuột, liều duy nhất. - Nhóm MeV: tiêm MeV trực tiếp vào khối u 6 lần, 2 lần/tuần, liều 107pfu/lần/con. - Nhóm Nimotuzumab: tiêm tĩnh mạch đuôi 0,1 ml dung dịch Nimotuzumab liều duy nhất 100μg/chuột. - Nhóm MeV + Nimotuzumab: được tiêm MeV vào khối u 6 lần, 2 lần/tuần, liều 107pfu/lần/con và được tiêm tĩnh mạch đuôi 0,1 ml dung dịch Nimotuzumab liều duy nhất 100μg/chuột. So sánh kích thước u ở các nhóm nghiên cứu theo thời gian Theo dõi tỉ lệ sống chết của chuột d, Phân tích tế bào khối u chết theo chương trình bằng phương pháp flow cytomitry: Tách tế bào từ mô u của 4 nhóm chuột và sử dụng kit Annexin V/PI để phân tích tế bào chết theo chương trình. e, Phương pháp phân tích mô bệnh học khối u: Khối u được tách từ đùi chuột, đúc paraffin và nhuộm HE và đọc dưới kính hiển vi. f, Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL, Nhật Bản (Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh). 2.3. Phương pháp phân tích kết quả, xử lý số liệu - Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0 và GraphPad Prism 6. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tác dụng kháng ung thư của virus vaccine sởi phối hợp với Nimotuzumab trên in vitro 3.1.1. Tăng sinh virus vaccine và các dòng tế bào Hình 3.1: Sau 24 giờ, các tế bào bám dính vào đĩa nuôi cấy, tốc độ tăng sinh gấp đôi của dòng tế bào Hep2 khoảng 24 giờ, tế bào phát triển tốt và đạt khoảng 80-90% bề mặt nuôi cấy sau 6-7 ngày. Sau 2 tuần nuôi cấy thu đủ số lượng tế bào Hep2 để làm các thí nghiệm. Hình 3.2. Ngày thứ 6 nhiễm virus, tế bào Vero hoại tử và bong lên khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Thu dịch tế bào nhiễm virus, ly tâm lấy phần dịch nổi, lọc lại bằng màng lọc 0,45 µm ta có dung dịch virus vaccine. 3.1.2. Chuẩn độ virus CCID50 Hình 3.3. Kết quả chuẩn độ CCID50 của MeV = 105+0,5/0,2 ml = 5x105,5/ml 3.1.3. Tế bào Hep2 điều trị bằng virus tạo hợp bào in vitro Hình 3.4. Hình ảnh tế bào Hep2 nhiễm virus tạo hợp bào 3.1.4. Đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT 3.1.4.1. Kết quả ức chế tế bào ở các nhóm nghiên cứu (hình 3.6, 3.8) 3.1.4.2. Kết quả ức chế tế bào ở các thời điểm điều trị bằng virus bằng thử nghiệm MTT Hình 3.9. Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm điều trị bằng virus ở nhóm MeV và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab Hình 3.10. Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm nghiên cứu của nhóm điều trị bằng Nimotuzumab 3.1.5. Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (chết apoptosis) 3.1.5.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường Hình 3.11. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi thường: 24 giờ sau điều trị bằng virus đã thấy tế bào có xu hướng co nhỏ lại. 48, 72 giờ, tế bào Hep2 có những hình ảnh nhiễm virus rõ: co tròn lại, tế bào hòa màng tạo thành những hợp bào. 96 giờ tế bào bong ra, có nhiều tế bào hoại tử và nổi trên bề mặt môi trường nuôi cấy. 3.1.5.2. Đánh giá tế bào chết apoptosis và hoại tử bằng phương pháp flow cytometry Hình 3.12. Ở cả 3 thời điểm 48, 72 và 96 giờ, tỷ lệ tế bào chết ở nhóm chứng thấp hơn ở 3 nhóm điều trị, tỷ lệ tế bào chết ở nhóm phối hợp MeV+Nimotuzumab cao hơn nhóm điều trị đơn. (p nhóm phối hợp - nhóm chứng: p < 0,05). Hình 3.13, Hình 3.14, Hình 3.15. Ở thời điểm 48 giờ, tỷ lệ tế bào apoptosis, apoptosis sớm, apoptosis muộn và tế bào hoại tử ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng, ở nhóm điều trị phối hợp cao hơn nhóm điều trị đơn (p < 0,05). Hình 3.15. Kết quả chạy flow cytometry tế bào Hep2 ở các thời điểm sau điều trị MeV và Nimotuzumab liều 2 MOI Q1 là vùng tế bào apoptosis giai đoạn sớm **:p < 0,01; ***:p < 0,0001 Hình 3.16. Ở thời điểm 72 giờ, tỷ lệ tế bào apoptosis, apoptosis sớm, apoptosis muộn ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng, ở nhóm điều trị phối hợp cao hơn nhóm điều trị đơn (p < 0,05). Hình 3.17, Hình 3.18. Ở thời điểm 96 giờ, tỷ lệ tế bào chết hoại tử ở các nhóm điều trị MeV (nhóm MeV và nhóm phối hợp) đều tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê với p<0,05 so với nhóm chứng (p (MeV-Control) = 0,006; p (MeV+ Nimotuzumab -Control) = 0,001). Hình 3.19. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần theo thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab, cao nhất ở thời điểm 96 giờ và thấp nhất ở thời điểm 48 giờ; (p < 0,05 ở nhóm MeV và nhóm kết hợp). Hình 3.20. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis đạt mức cao nhất ở thời điểm 72 giờ, sự khác biệt này có ý ‎nghĩa thống kê (p < 0,05 ở nhóm MeV và Nimotuzumab) 3.1.5.3. Kết quả đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng kỹ thuật realtime PCR 3.2. Kết quả tác dụng kháng ung thư của MeV và Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đầu cổ người 3.2.1. Kết quả tạo khối u tế bào Hep2 trên chuột nude Bảng 3.5. Ba ngày sau khi ghép 106 tế bào Hep2/chuột tại vị trí dưới da đùi phải, 13/40 con (32,5%) chuột xuất hiện khối u tại vị trí tiêm, ngày 11 sau ghép thì cả 40/40 chuột (100%) có u. Tại vị trí tiêm và xuất hiện khối u không có biểu hiện viêm loét, hoại tử, chảy máu. Hình 3.26. Kết quả ghép u dưới da đùi của chuột C2 (A) ngày thứ 3; (B) ngày thứ 5; (C) ngày thứ 7; (D) ngày thứ 11 3.2.2. Kết quả tác dụng kháng ung thư của MeV và Nimotuzumab 3.2.2.1. Tình trạng toàn thân chuột trong quá trình thí nghiệm Bảng 3.6. Sau khi ghép tế bào Hep2, chuột vẫn ăn uống, vận động, đáp ứng với kích thích bình thường, hậu môn khô, không đi lỏng. 3.2.2.2. Diễn biến trọng lượng cơ thể ở chuột nghiên cứu Bảng 3.7. Ở hầu hết các thời điểm, trọng lượng trung bình chuột ở các nhóm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 3.2.2.3.Kết quả thể tích trung bình khối u ở các chuột nghiên cứu Bảng 3.8. Ở thời điểm ngày 0 - ngày đầu tiên phân nhóm điều trị, thể tích trung bình ở tất cả 4 nhóm chuột đều tương đương nhau, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê p > 0,05. Hình 3.28, hình 3.29. Ở tất cả các thời điểm, thể tích trung bình khối u ở các nhóm điều trị đều thấp hơn nhóm chứng; nhóm điều trị phối hợp MeV+Nimotuzumab thấp hơn nhóm điều trị đơn MeV và Nimotuzumab (Hình 3.29) Hình 3.29. Thể tích trung bình khối u ở các thời điểm (mm3) *: p < 0,05; **:p < 0,01; ***:p < 0,001 3.2.2.4. Kết quả thời gian sống, tỉ lệ chết của chuột nude sau thời gian điều trị bằng MeV và Nimotuzumab Hình 3.30. Sau thời gian 60 ngày theo dõi, thời gian sống trung bình của chuột ở các nhóm điều trị dài hơn so với nhóm chứng (nhóm phối hợp là 58,1 ± 4,33 ngày; nhóm MeV là: 49,1 ± 16,50 ngày; nhóm Nimotuzumab là: 45,4 ± 18,66 ngày; nhóm chứng là 38,6 ± 18,76 ngày). Tuy nhiên sự khác biệt này chỉ có ý nghĩa thống kê ở nhóm chứng và nhóm điều trị phối hợp với p = 0,009. 3.2.2.5. Tỷ lệ sống tích lũy của chuột thí nghiệm giữa nhóm chứng và các nhóm điều trị Sau 60 ngày theo dõi các nhóm chuột, số chuột chết và tỷ lệ thời gian sống tích lũy ở các nhóm điều trị cao hơn nhóm chứng; ở nhóm điều trị phối hợp cao hơn ở nhóm điều trị đơn, cụ thể: Nhóm chứng: 8 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,2. Nhóm MeV: 4 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,6. Nhóm Nimo: 6 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,4. Nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab có 2 chuột chết: 2 chuột chết, tỷ lệ thời gian sống tích lũy là 0,8. p < 0,001 3.2.3. Kết quả đánh giá tế bào chết theo chương trình bằng phương pháp Flow cytometry trên tế bào tách ra từ mô ung thư 3.2.4. Hình ảnh mô bệnh học khối ung thư đầu cổ người Hep 2 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ghép dị loài Hình 3.33. Hình ảnh mô bệnh học khối ung thư đầu cổ người Hep2 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ghép dị loài là hình ảnh tế bào ung thư biểu mô kém biệt hóa. 3.2.5. Đánh giá siêu cấu trúc tế bào ung thư đầu cổ người Hep2 sau điều trị bằng MeV phối hợp với Nimotuzumab dưới kính hiển vi điện tử truyền qua Hình 3.35. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u Hep2 sau điều trị bằng MeV kết hợp với Nimotuzumab (mẫu KH4, KH5) Tế bào Hep2 bình thường; Tế bào Hep2 sau điều trị bằng bởi virus vaccine sởi; (C), (D) Tế bào Hep2 tạo thành hợp bào; (E) Tế bào Hep2 ngưng tụ nhiễm sắc thể; (F) Tế bào Hep2 phân mảnh nhiễm sắc thể; (G) Tế bào Hep2 xuất hiện nhiều không bào; (H) Tế bào Hep2 hoại tử. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Xác định nồng độ virus bằng phương pháp chuẩn độ CCID50 Các chuẩn độ virus CCID50 thường dựa trên các quan sát hiệu ứng bệnh lý tế bào dưới kính hiển vi thường nên có thể gặp nhiều sai số chủ quan như xác định sai hiệu ứng bệnh lý tế bào ở các giếng trong cùng một nồng độ chất thử, giữa các giếng của các nồng độ khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng k‎ỹ thuật chuẩn độ MeV bằng thử nghiệm CCID50 có sử dụng xanh methylen là chất hiện màu để đánh giá hiệu ứng bệnh lý tế bào của virus để đánh giá khách quan và chính xác hơn cho phép quan sát đồng thời hình ảnh hiệu ứng bệnh lý của tế bào ở các giếng cùng nhiễm một nồng độ virus và ở các giếng nhiễm virus với các nồng độ khác nhau, từ đó tính CCID50 ta thu được kết quả chuẩn độ của MeV. 4.2. Tác dụng ly giải tế bào Hep2 in vitro của MeV và Nimotuzumab 4.2.1. MeV và Nimotuzumab ly giải trực tiếp tế bào Hep2 bằng cách tạo hợp bào in vitro Trong nghiên cứu này, cả trên in vitro (quan sát tế bào Hep2 bằng kính hiển vi thường) và in vivo (quan sát hình ảnh siêu cấu trúc mô u bằng kính hiển vi điện tử truyền qua) đều thấy hình ảnh những tế bào Hep2 hình thành hợp bào khi điều trị bằng MeV. Điều này rất phù hợp với với cơ chế quan trọng của MeV trong điều trị là khả năng hình thành hợp bào đã được chứng minh trong các nghiên cứu về trước đây. Hợp bào tạo điều kiện cho virus lây lan từ tế bào này sang tế bào khác rất nhanh mà không cần giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào nên giảm được tối đa tác dụng của kháng thể trung hòa chống virus. 4.2.2. Đánh giá khả năng ức chế tế bào bằng thử nghiệm MTT Trong các thử nghiệm MTT, để đánh giá ức chế tế bào ung thư của MeV, các tác giả thường lựa chọn nồng độ MeV (MOI) từ 0,1- 10 và Nimotuzumab từ 7,8125 – 2.000 µg/ml với thời điểm khảo sát từ 12 giờ - 120 giờ (được khảo sát nhiều nhất là 24, 48 và 72 giờ). Trong nghiên cứu này, thử nghiệm MTT đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của tế bào Hep2 in vitro của MeV phối hợp với Nimotuzumab với nồng độ pha loãng của virus từ 10-2 đến 10-8 và nồng độ Nimotuzumab từ 25 - 400 µg/ml ở hai thời điểm là 72 giờ và 96 giờ. Ở cả hai thời điểm khảo sát 72 và 96 giờ thì tỉ lệ tế bào sống ở ba nhóm điều trị thấp hơn so với nhóm chứng, tỷ lệ tế bào sống ở nhóm phối hợp thấp hơn nhóm điều trị đơn ở tất cả các nồng độ pha loãng của MeV từ 10-2 đến 10-8 (p < 0,001). Tỷ lệ tế bào sống tăng dần ở tất cả những nồng độ pha loãng MeV từ 10-2 đến 10-8 (p < 0,05). Tuy nhiên, ngay cả ở nồng độ pha loãng MeV 10-8 thì tỷ lệ sống ở nhóm điều trị bằng MeV và nhóm phối hợp vẫn thấp hơn so với nhóm chứng (p < 0,001), điều này khẳng định tác dụng ly giải tế bào ung thư của MeV và Nimotuzumab. 4.2.3. MeV và Nimotuzumab ly giải tế bào Hep2 in vitro thông qua kích hoạt tế bào chết apoptosis Nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng: MeV và Nimotuzumab có khả năng ly giải tế bào Hep2 in vitro qua trung gian kích hoạt con đường tế bào chết apoptosis ở tất cả các thời điểm nghiên cứu (từ thời điểm 48 giờ, tăng cao nhất ở 72 giờ và giảm xuống ở thời điểm 96 giờ). Tỷ lệ tế bào chết apoptosis ở nhóm chứng thấp hơn ở 3 nhóm điều trị ở cả 3 thời điểm (p < 0,05). Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở nhóm kết hợp (MeV+Nimo) cao nhất ngay tại thời điểm 72 giờ, sau đó giảm xuống thấp nhất tại thời điểm 96 giờ; ở nhóm MeV cao nhất ngay tại thời điểm 48 giờ, sau đó giảm xuống thấp nhất tại thời điểm 72 giờ và ở nhóm Nimo tăng dần theo thời gian, thấp nhất tại thời điểm 48 giờ, sau đó tăng dần lên tại thời điểm 72 giờ và 96 giờ. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở các nhóm điều trị bằng MeV và Nimotuzumab đạt mức cao nhất ở thời điểm 72 giờ (p < 0,05). Tỉ lệ tế bào chết hoại tử ở các nhóm điều trị bằng MeV và Nimotuzumab đạt mức thấp nhất ở thời điểm 72 giờ và cao nhất ở thời điểm 96 giờ (p < 0,05). Nhiều nghiên cứu của các tác giả cũng chọn thời điểm khảo sát như chúng tôi là ngày 2,3,4 và đã chứng minh được tác dụng gây chết tế bào apoptosis của MeV trên nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau như ung thư buồng trứng, ung thư đại trực tràng. 4.2.4. MeV và Nimotuzumab có tác dụng ức chế quá trình tăng sinh tế bào in vitro thông qua kích hoạt STAT3, ISG15 Kết quả realtime PCR đánh giá sự phiên mã của mRNA STAT3 và ISG15 trong nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy: ở cả hai thời điểm là 48 giờ và 72 giờ thì sự phiên mã của STAT3 và ISG15 ở các nhóm điều trị đều cao hơn so với nhóm chứng; ở nhóm phối hợp cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm điều trị đơn (p < 0,001). Điều này chứng minh rằng virus vaccine sởi và Nimotuzumab có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u thông qua con đường apotosis và việc phối hợp MeV và Nimotuzumab đem lại hiệu quả cao hơn điều trị đơn MeV hoặc Nimotuzumab. Ở các nhóm điều trị bằng virus sẽ kích hoạch sự sản xuất ISG15 nội bào từ đó tăng kích thích các tế bào miễn dịch, tăng sản xuất IFN gamma từ đó hạn chế sự phát triển tế bào khối u, tăng quá trình chết apoptosis, tăng quá trình chết hoại tử tế bào. Ở nhóm điều trị bằng Nimotuzumab, ngăn cản sự kết hợp của EGF và thụ thể của nó (EGRF) làm hai tiểu phần của EGFR không gắn kết để hoạt hoá nội bào gây cản trở lan truyền tín hiệu vào trong tế bào, ức chế sự tăng sinh phát triển của tế bào khối u, ức chế tăng sinh mạch máu và tăng quá trình chết apoptosis. 4.3. Hiệu quả điều trị của MeV kết hợp Nimotuzumab trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ 4.3.1. MeV kết hợp Nimotuzumab không gây độc toàn thân cho chuột nude mang khối u đầu cổ Kết quả nghiên cứu này cho thấy MeV và Nimotuzumab không gây độc toàn thân ở chuột nude mang khối u tế bào Hep2: Sau khi tiêm MeV nội u (6 lần, 2 lần/tuần) và Nimotuzumab đường tĩnh mạch đuôi (liều duy nhất), chuột hoạt động bình thường, ko chảy máu, chỗ tiêm không nhiễm khuẩn, không loét, chuột hoạt động bình thường, vận động nhanh nhẹn, không đi lỏng. Trọng lượng của chuột tăng dần tương ứng với sự tăng kích thước khối u, không có sự khác biệt về trọng lượng giữa các nhóm điều trị MeV và Nimotuzumab với nhóm chứng tại các thời điểm nghiên cứu. MeV và Nimotuzumab cũng được chứng minh có hiệu quả trong điều trị các loại ung thư người, an toàn và ít biến chứng nặng. 4.3.2. MeV và Nimotuzumab có tác dụng hạn chế sự phát triển khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ Các nghiên cứu trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư người hay các thử nghiệm lâm sàng trên người (ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư buồng trứng, ung thư thần kinh, ung thư thực quản) đã khẳng định tác dụng kháng ung thư của MeV. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết hợp MeV với Nimotuzumab làm tăng cường hiệu quả kháng u. Tại tất cả các thời điểm nghiên cứu, kích thước khối u ở các nhóm điều trị đều thấp hơn ở nhóm chứng, nhóm phối hợp MeV và Nimotuzumab thấp hơn các nhóm điều trị đơn (pnhóm phối hợp-nhóm chứng < 0,05). 4.3.3. Kết hợp MeV và Nimotuzumab có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với một số nghiên cứu khác đều chứng minh được MeV có tác dụng kéo dài thời gian sống ở các chuột nude ghép dị loài các dòng tế bào ung thư người khác nhau. Sau 60 ngày theo dõi, thời gian sống trung bình ở nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab là 58,1 ngày, MeV là: 49,1 ngày; nhóm Nimotuzumab là: 45,4 ngày; nhóm chứng là 38,6 ngày. Kết thúc thí nghiệm, số chuột còn sống ở nhóm chứng là 2/10 (20%), nhóm MeV là 6/10 (60%, nhóm Nimotuzumab là 4/10 (40%), và nhóm MeV + Nimotuzumab là 8/10 (80%); sự khác biệt giữa nhóm chứng và nhóm kết hợp MeV và Nimotuzumab với p<0.05. Đồng thời, tỉ lệ sống sót tích lũy tính đến thời điểm ngày thứ 60 sau điều trị của nhóm điều trị kết hợp MeV và Nimotuzumab là 0,80 cao hơn so với