Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

(bp) RolB B1 B2 TCAAGTCGCCGAGGTTTCTT AAACGCTCCGCGGTGGT 610 10 RolC C1 C2 TTGACCTATGTGCTCTTT CTCCATTCCAAATTTGCATT 530 Chương trình phản ứng PCR: Chương trình nhiệt bắt đầu ở 94oC thời gian 2 phút, tiếp theo sau 30 chu kỳ với nhiệt độ: 94oC trong 1 phút; 55oC trong 1 phút; 72oC trong 1 phút; Kết thúc 30 chu kỳ nhiệt độ được giữ ở 72oC trong 5 phút. 2.1.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất Plumbagin 2.1.3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy Một số yếu tố như trạng thái môi trường, điều kiện chiếu sáng, loại môi trường, khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu được khảo sát nhằm chọn lọc điều kiện tối ưu cho sự phát triển sinh khối rễ. các thí nghiệm được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung sucrose 30 g/l, pH 5,8-5,9; Nhiệt độ 25oC ±2oC; độ ẩm = 65% để khảo sát cho từng yếu tố. Chỉ tiêu về trọng lượng tươi rễ tơ (gTLT/bình), chỉ số sinh trưởng rễ tơ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. 2.1.3.2. Xác định đường cong tăng trưởng 1 g mẫu rễ tơ được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu của nghiệm thức 2.2.3.1. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (3 bình/lần lặp lại). Khả năng phát triển của rễ tơ được ghi nhận sau 0, 1, 2, 3,4, 5, 6 tuần nuôi cấy, với chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng tươi (gTLT/bình); Hàm lượng Plumbagin (µg/g TLT). 11 2.1.3.3. Ảnh hưởng một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ - Thí nghiệm được thiết lập với 12 nghiệm thức, cho 7 yếu tố: Nước dừa (10-30%), chitosan (10-100 mg/L), salicylic acid (100-300 mg/L), đường (10-50 g/L), dịch chiết nấm men (100-1000 mg/L), casein (100-500 mg/L) và peptone (100-500 mg/L) (Bảng 2.2). Mức thấp (-1) và mức cao (+1) của các yếu tố được thiết lập bởi ma trận Plackett- Burman (Plackett, Burman 1946), qua phần mềm Design Experment 7.0 để chọn ra 4 yếu tố ảnh hưởng đến thông số cần khảo sát từ đó tìm điểm tối ưu dựa trên thuật toán D-Optimal. Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ Nghiệm thức X1- Nước dừa (10- 30%) X2 - chitosan (10-100 mg/L) X3- salicylic acid (100- 300 mg/L) X4 - đường (10-50 g/L) X5 - dịch trích nấm men (100- 1000 mg/L) X6 - casein (100- 500 mg/L) X7 - peptone (100- 500 mg/L) 1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 2 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 3 +1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 4 +1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 5 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 12 6 -1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 7 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 8 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 9 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 10 +1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 11 -1 +1 +1 -1 +1 +1 +1 12 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình erlen (250 ml) chứa 60 ml môi trường lỏng. kết quả được ghi nhận thông qua: xác định trọng lượng tươi (TLT), trọng lượng khô (TLK) và hàm lượng Plumbagin trong mỗi nghiệm thức sau 4 tuần nuôi cấy. 2.1.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ Nghiền 1 g mẫu rễ khô và ly trích với chloroform trong máy ly trích soxhlet ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Cho bay hơi dịch ly trích để loại chloroform và thu được bột ly trích thô (Jeyachandran và cs., 2009). Hòa tan 5 mg bột ly trích thô với 5 ml acetonitrile trong bình flask thể tích 10 ml, thêm dung dịch acetonitric đến vừa đủ 10 ml. Các nồng độ khác nhau được chuẩn bị và được dùng để chạy sắc ký lỏng cao áp. Trước khi phân tích các mẫu Plumbagin đều được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 µm. 2.1.4.1. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được định tính cùng với chất chuẩn Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng như sau: 13 - Sử dụng bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 20 x 20cm. - Dung dịch ly giải: Ether dầu hỏa: ethyl acetate = 7:3 - Thuốc thử: NaOH 10% trong cồn. 2.1.4.2. Định lượng Plumbagin bằngHPLC (Gopinath và cs, 2009) HPLC được tiến hành trên cột pha đảo C-18, (250×4.6), kích thước 5 μm. Dung môi để phân tách là acetonitrile (50 mM potassium dihydrogen phosphate: actonitrile với tỉ tệ (45:55)) ở pH 3,5, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Hệ thống hoạt động ở nhiệt độ 26oC. Thể tích mẫu: 20 μl. Sắc ký được ghi nhận ở 270 nm để xác định Plumbagin cùng với chất chuẩn. 2.1.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin Tế bào ung thư gan HepG2 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh Penicillin và Streptomycin. Tế bào HepG2 được cảm ứng bằng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau: 0 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM và 20 µM. Khả năng kháng tế bào HepG2 của Plumbagin được ghi nhận sau 3 ngày nuôi cấy thông qua xác định mật độ tế bào trong mỗi ml, sự hiện diện của gen bax, bcl-2 và beta-actin; đánh giá sự phân mãnh. 2.1.6. Xử lý số liệu : Thu thập số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2003, Design Experment 7.0, SigmaPlot và SAS. 14 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro 3.1.1.Xác định điều kiện khử trùng mẫu Kết quả khảo sát khả năng khử trùng mẫu của Javel cho thấy: Ở nghiệm thức sử dụng Javel 8% và thời gian 20 phút có tỷ lệ mẫu vô trùng 72,33%, tỷ lệ mẫu sống 53,49% và tỷ lệ nảy chồi 96,50% (Bảng 3.1) là điều kiện tối ưu trong các nghiệm thức khảo sát (38,67% mẫu đạt yêu cầu). Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước Javel và thời gian khử trùng tạo mẫu in vitro từ đoạn thân cây Bạch hoa xà. Nghiệm thức % mẫu vô trùng Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ nảy chồi(%) J1 1,67 h 100a 100 a J2 2,33 h 100 a 100 a J3 10,00 gh 100 a 100 a J4 14,38 fg 75,39 b 100 a J5 43,78 e 62,57 c 100 a J6 64,11 cd 46,56 f 100 a J7 22,50 f 64,89 c 100 a J8 49,67 e 60,25 cd 100 a J9 78,83 ab 44,92 f 100 a J10 61,70 d 56,95 de 100 a J11 72,33 bc 53,49 e 96,50 b 15 J12 84,83a 20,28 g 85,67 c Tương tác javen *thời gian, có: P <0,01 <0,01 <0,01 CV 9,29 3,54 1,18 Các số trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa thống kê ở mức xác suất với yếu tố P: p <0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests . 3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ Kết quả khảo sát khả năng tạo chồi từ chồi bên trong nuôi cấy mô cây Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy nhận thấy: Nghiệm thức A1 (1,0 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) cho chiều cao trung bình của chồi là 1,57 cm với số lượng chồi trung bình là 4,49 chồi/mẫu, còn ở nghiệm thức B1 (1,5mg/L BA và 0,1 mg/L IBA) - chiều cao trung bình của chồi thấp hơn, chỉ đạt 1,40 cm, nhưng lại đạt số lượng chồi trung bình lên đến 4,68 chồi/mẫu (Bảng 3.2). Với mục tiêu tạo số lượng lớn chồi trực tiếp từ chồi bên cho quá trình nhân nhanh in vitro, nghiệm thức B1 (1,5 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA) được chọn là nghiệm thức thích hợp cho sự tạo chồi in vitro cây Bạch hoa xà. 16 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà. NT BA (mg/L) IBA (mg/L) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu Chiều cao chồi trung bình (cm) A1 1,0 0,1 88,48 b 4,49 b 1,57 b A2 1,0 0,2 77,52 d 4,19 c 1,47 c A3 1,0 0,3 83,22 c 2,66 f 1,59 a A4 1,0 0,4 77,85 d 3,51 e 1,31 f A5 1,0 0,5 55,91 f 3,78 d 1,12 h B1 1,5 0,1 99,00a 4,68a 1,40 e B2 1,5 0,2 88,89 b 4,34 c 1,44 d B3 1,5 0,3 88,22 b 1,83 i 0,68 o B4 1,5 0,4 98,17 a 2,40 g 0,73 m B5 1,5 0,5 77,11 d 3,73 d 0,87 k C1 2,0 0,1 98,33 a 2,44 g 1,33 f C2 2,0 0,2 87,89 b 1,85 i 1,06 j C3 2,0 0,3 77,78 d 1,36 kj 0,83 l C4 2,0 0,4 98,33 a 2,78 f 1,10 i C5 2,0 0,5 77,78 d 3,58 e 1,26 g D1 2,5 0,1 88,89 b 1,46 j 1,04 j D2 2,5 0,2 88,57 b 1,21 k 0,68 on 17 D3 2,5 0,3 87,89 b 2,46 g 1,27 g D4 2,5 0,4 65,00 e 1,72 i 0,51 p D5 2,5 0,5 67,00 e 2,13h 0,70 n Tương tác BA*IBA, có: P CV <0,01 2,1 <0,01 2,39 <0,01 0,89 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests. 3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro Sự hình thành và phát triển của hệ rễ mới in vitro là điều kiện quan trọng để cây phát triển.Vì thế, trong thí nghiệm này, IBA được sử dụng để kích thích ra rễ. Kết quả sau 2 tuần nuôi cấy cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức đều có tạo rễ, nhưng có sự khác nhau về số lượng và chiều dài rễ ở các nghiệm thức (Bảng 3.3). Ở nghiệm thức có bổ sung IBA lần lượt là 0,1 mg/L; 0,15 mg/L; 0,3 mg/L đều nhiều rễ. Trong đó, nghiệm thức có bổ sung 0,1 mg/L IBA cho chiều dài rễ tốt nhất (2,28 cm). 18 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cây Bạch hoa xà từ chồi in vitro. NT IBA(mg/L) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ trung bình/mẫu Chiều dài rễ (cm) Số lá trung bình/mẫu E0 0,00 100 4,31 g 2,92 a 4,03g E1 0,10 100 11,32 c 2,28 b 6,62a E2 0,15 100 12,99 a 1,31 c 6,33 b E3 0,20 100 9,12 e 1,16 d 5,37d E4 0,25 100 10,32 d 1,16 d 4,99e E5 0,30 100 12,67 b 0,96 e 5,61c E6 0,35 100 5,59 f 0,66 f 4,69f Ảnh hưởng IBA lên sự tạo rễ, có: P <0,01 <0,01 <0,01 CV 1,32 3,55 1,76 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests. 19 3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro Cảm ứng tạo rễ bất định ở lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở nồng độ khác nhau nhằm xác định loại mô có khả năng tạo rễ tốt để sử dụng làm nguồn nguyên liệu chuyển gen, kết quả được ghi nhận ở Bảng 3.4, hình 3.1. Hình 3.1. Rễ bất định từ lá (a) và đoạn thân (b) Bảng 3.4. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy. Hàm lượng (mg/L) Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (gTLT) Nghiệm thức IBA NAA Lá Đoạn thân R1 0,0 0,0 1,21 m 0,43 o R2 0,0 0,1 2,63 b 0,68 n R3 0,0 0,5 2,53 c 0,82 l R4 0,0 1,0 1,83 h 1,13 k R5 0,0 1,5 1,70 jk 1,23 gh a b 20 R6 0,1 0,0 1,63 k 1,23 gh R7 0,1 0,1 2,05 g 1,75 a R8 0,1 0,5 2,10 fg 1,54 c R9 0,1 1,0 2,18 ef 0,85 l R10 0,1 1,5 2,39 d 1,67 b R11 0,5 0,0 1,72 j 1,44 e R12 0,5 0,1 3,06a 1,23 gh R13 0,5 0,5 1,70 jk 0,77 m R14 0,5 1,0 1,80 h 1,15 jh R15 0,5 1,5 1,80 h 1,26 g R16 1,0 0,0 1,82 h 0,85 l R17 1,0 0,1 2,14 f 0,75 m R18 1,0 0,5 2,24 e 1,49 d R19 1,0 1,0 2,39 d 1,19 ijh R20 1,0 1,5 2,55 c 0,84 l R21 1,5 0,0 1,85 h 0,76 m R22 1,5 0,1 2,35 d 1,31 f R23 1,5 0,5 1,74 ij 1,22 ghi R24 1,5 1,0 1,30 l 1,15 jh R25 1,5 1,5 1,26 lm 1,17 ijk Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. 21 z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's Multiple Range Tests. Từ kết quả nhận được, mô lá được sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Bạch hoa xà. 3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà 3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ Mô lá được xử lý với vi khuẩn và nuôi chung trong điều kiện môi trường chứa acetosyringone thay đổi (10, 50, 100, 150 M) và thời gian ủ chung kéo dài 1, 3, 7 ngày; mỗi nghiệm thức được tiến hành với 1000 mẫu. Sau thời gian nuôi chung, tiến hành chọn lọc và xác định các mẫu rễ chuyển gen, kết quả nhận được theo Bảng 3.5, Hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5). Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi chung với vi khuẩn: a. Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 1 ngày; b. Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 3 ngày; c. Nuôi chung mẫu cấy với vi khuẩn 7 ngày. 22 Kết quả kiểm tra PCR (Hình 3.6, 3.7) đã chọn được 4 dòng rễ chuyển gen, trong đó chỉ có một dòng mang cả 2 gen rolB và rolC. Kết quả nhận được ở điều kiện acetosyringone 50 µm/L và 7 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,2%) (Bảng 3.5). Hình 3.3. Rễ tơ giả định hiển vi (vật kính 40). Hình 3.4. Đoạn rễ tơ hiển vi (vật kính 40). 10.000 bp 3.000 bp 1.000 bp 500 bp 750 bp 250 bp L N P P1 P2 P3 P4 10.000 bp 3.000 bp 1.000 bp 500 bp 750 bp 250 bp L N P P1 P2 P3 P4 Hình 3.5. Rễ tơ nuôi trên môi trường lỏng lắc sau 30 ngày Hình 3.6. PCR gen rolB Hình 3.7. PCR gen rolC. 23 Bảng 3.5. Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acetosyringone đến mô nuôi và tỉ lệ mẫu chuyển gen. Ngày ủ Hàm lượng acetosyringone (µM) Tỉ lệ mẫu lá bị nhũn (%) Tỉ lệ mẫu rễ chuyển gen thu nhận được (%) 1 10 28 0 1 50 28 0 1 100 28.5 0 1 150 30 0 3 10 54,5 0 3 50 55 0 3 100 56,5 0 3 150 57,67 0,1 7 10 60 0,1 7 50 63 0,2 7 100 65 0 7 150 67,5 0 R2 0,9996 0,4834 CV 0,8518 190,1575 Từ kết quả phân tích cho thấy điểm tối ưu cho khả năng tạo mẫu chuyển gen cao nhất được dự đoán (dựa trên phần mềm SAS để phân tích mối tương quan đáp ứng bề mặt, tìm điểm tối ưu) là: thời gian ủ 24 chung mẫu với vi khuẩn là 3,47 ngày, hàm lượng acetosyringone 134,09 µM và tỉ lệ mẫu chuyển gen nhận được 0,025 %. 3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được xác định thông qua sắc ký lớp mỏng cùng với chất chuẩn Plumbagin (Hình 3.8), sắc ký đồ (Hình 4.9). Sự thay đổi hàm lượng Plumbagin chuẩn được ghi nhận ở các mức khác nhau (hình 3.10) và sự tương quan giữa hàm lượng với diện tích peak được thể hiện qua phương trình: y = 30905x + 42796 và R² = 0,994. Hình 3.9. Sắc ký đồ xác định Plumbagin bằng hệ thống HPLC. Hình 3.8. Sắc ký lớp mỏng định tính Plumbagin. Plumbagin Plumbagin 25 Hình 3.10. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng Plumbagin 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin 3.3.1. Trạng thái môi trường Kết quả nhận được cho thấy, trạng thái môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của rễ tơ cây Bạch hoa xà như: trọng lượng tươi của mẫu được nuôi cấy trên môi trường không có agar cho kết quả tốt hơn so với môi trường có bổ sung agar (Bảng 3.7; Hình 3.11). Sự khác biệt này do ở môi trường lỏng rễ được tiếp xúc tốt với môi trường và được lắc nên khả năng hấp thu dinh dưỡng và sự thoáng khí tốt hơn so nuôi trên môi trường rắn. Kết quả này cũng được ghi nhận khi nuôi cấy rễ cây họ đậu (Fernandez và cs, 1998), rễ cây Narcissus confuses (Montserrat và cs, 1997) và ở cây Cicer arietinum L. (Islam và cs, 2005). y = 30905x + 42796 R² = 0,9942 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 D iệ n t íc h p ea k Nồng độ Pumbagin (ppm) Đường chuẩn Plumbagin 26 Hình 3.11. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây BHX Bảng 3.7. Ảnh hưởng trạng thái môi trường nuôi đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây BHX. Trạng thái môi trường Trọng lượng rễ (g TLT/bình) Lỏng 2,57a Rắn 2,32b LSD0,01: 2,448 CV: 0,225 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 3.3.2. Điều kiện chiếu sáng Ánh sáng đóng vai trò quan trọng cho quá trình tăng trưởng và tạo ra các chất trao đổi thứ cấp. Nhiều dòng rễ tơ khi tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh và hình thành lục lạp hoàn chỉnh để thực hiện 27 chức năng quang hợp (Flores và cs, 1993). Tùy dòng rễ và loài thực vật mà rễ tơ được tạo ra có thể được kích thích hoặc kìm hãm bởi ánh sáng: như ở rễ tơ cây Ipomoea aquatic nuôi cấy ở điều kiện sáng kích thích sinh khối tăng gấp 2 lần và hàm lượng peroxidase tăng gấp 4 lần so với điều kiện tối (Taya và cs, 1994); Ngược lại, ánh sáng kìm hãm sự phát triển sinh khối và hàm lượng thiophene khi nuôi cấy rễ tơ cây Tagetes patula (Mukundan và Hjortsø, 1991). Kết quả nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà cho thấy ở điều kiện tối sinh khối thu được cao hơn so với điều kiện sáng, mặc dù sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 3.8; hình 3.12). Kết quả này cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009) khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà được tạo ra bởi dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 532 (MTCC). Kết quả ghi nhận được cho phép chọn điều kiện tối để nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà. Hình 3.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây BHX. 28 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây BHX. Điều kiện nuôi Trọng lượng rễ (g TLT/bình) Sáng 2,66a Tối 2,78a LSD0,01: 0,129 CV: 1,266 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 3.3.3. Xác định đường cong tăng trưởng Khảo sát sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) và hàm lượng Plumbagin trong các mẫu thu được sau mỗi tuần nuôi cấy (Bảng 3.9, Hình 3.13). - Trọng lượng tăng chậm trong tuần đầu nuôi cấy, sau đó rễ phát triển mạnh đến tuần thứ 5 và sau đó chậm lại và gần như không phát triển thêm nữa. Thời gian đầu rễ ở trạng thái thích nghi và hồi sinh, sau đó rễ phát triển mạnh. Sau giai đoạn phát triển này, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, đồng thời có sự tích lũy các chất chuyển hóa trong môi trường, do đó rễ phát triển chậm lại. Zhang và cs (2013) khi nuôi cấy rễ bất định cây Psammosilene tunicoides cũng đã ghi nhận được hiện tượng này. 29 - Hàm lượng plumbagin trong sinh khối tăng chậm trong giai đoạn đầu (tuần 1 và 2), sau đó tăng nhanh từ tuần thứ 3, 4 và 5. Mặc dù ở tuần thứ 6 hàm lượng Plumbagin cũng còn tăng nhưng đã chậm lại, ghi nhận này cũng phù hợp với báo cáo của Zhang và cs (2013) ở rễ bất định cây Psammosilene tunicoides nuôi cấy. Như vậy, ở giai đoạn đầu môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho sự phát triển nên tích lũy sinh khối, sau đó khi các chất dinh dưỡng trong môi trường suy giảm quá trình trao đổi chất thứ cấp xảy ra mạnh trong rễ. Hình 3.13.Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây BHX. Bảng 3.9. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời gian. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plumbagin (µg/g TLK) 0 1,030 153,808 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7 T rọ n g l ư ợ n g t ư ơ i (g ) Thời gian (tuần) ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG RỄ TƠ 30 1 1,085 88,28 2 1,340 94,701 3 1,863 137,16 4 2,828 193,144 5 2,955 201,416 6 2,960 208,605 Tùy theo loài thực vật mà thời gian cho giai đoạn sinh trưởng và tích lũy hoạt chất của rễ tơ có thay đổi, như ở cây Fagopyrum tataricum giai đoạn phát triển chậm trong 9 ngày đầu, giai đoạn phát triển nhanh từ ngày thứ 12-24, tương ứng với hàm lượng flavonoid trong rễ ở hàm lượng thấp trong 15 ngày đầu sau đó tăng nhanh từ ngày 16-30 (Zhao và cs, 2014); ở cây Gentiana scabra: 2 tuần đầu rễ tơ phát triển chậm, tuần thứ 3-5 rễ tơ phát triển nhanh, sau đó phát triển chậm; hàm lượng gentiopicroside tăng nhanh ở tuần thứ 3 -5, sau đó giảm (Huang và cs, 2014). 3.3.4. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ Thành phần môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển của rễ tơ nuôi cấy (Giri và Narasu, 2000). Kết quả khảo sát cho thấy, rễ tơ phát triển tốt trên cả 3 loại môi trường, mặc dù môi trường MS cho chỉ số trọng lượng rễ cao nhất nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 loại môi trường còn lại (Bảng 3.10, Hình 3.14). Kết quả cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009) khi nuôi cấy rễ tơ 31 cây Bạch hoa xà được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes MTCC 532 nuôi trên 3 môi trường MS, SH và B5, trong đó môi trường MS là tốt nhất (6,3 g TLT; 0,99 gTLK). Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và cs (2009) thì rễ tơ cây Angelica gigas phát triển tốt nhất trong môi trường SH so với MS và B5; trong môi trường ON rễ tơ cây Neem tăng trưởng tốt hơn so với trong môi trường MS và B5 (Satdive và cs, 2007). Điều này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của rễ tơ, nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài của thực vật. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Môi trường Trọng lượng rễ (g TLT) MS 2,84a B5 2,60a N 2,52a LSD0,01 0,35 CV 4,36 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 32 Hình 3.14. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây BHX nuôi cấy. 3.3.5. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Tỷ lệ giữa lượng mẫu nuôi cấy ban đầu và thể tích môi trường nuôi có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ tơ, kết quả cho thấy, lượng mẫu ban đầu 1g (TLT/60ml môi trường) cho chỉ số tăng trưởng cao nhất; có sự thay đổi về chỉ số sinh trưởng của rễ ở các nghiệm thức có lượng mẫu nuôi ban đầu là 2, 3, 4 (gTLT/60ml) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.11, Hình 3.15). ). Ở cùng điều kiện nuôi cấy nhưng lượng mẫu khác nhau cho chỉ số sinh trưởng khác nhau, điều này có thể do cạnh tranh về thành phần dinh dưỡng trong môi trường; sự thiếu hụt lượng oxy hòa tan trong môi trường vì theo ghi nhận của Patra và Srivastava (2014), khả năng phát triển rễ tơ cây Thanh hao hoa vàng tối ưu khi lượng oxy trao đổi trong môi trường bằng hoặc cao hơn lượng oxy rễ hấp thu. 33 Hình 3.15. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ BHX nuôi cấy. Bảng 3.11. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Nghiệm thức Trọng lượng ban đầu (g TLT) Trọng lượng sau 4 tuần nuôi cấy (gTLT) Chỉ số sinh trưởng 1 1,05 2,13 1,03a 2 2,02 2,98 0,48b 3 3,02 3,99 0,42b 4 4,00 5,68 0,32b LSD 0,01 0,25 CV 16,33 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 34 3.3.6.Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy 7 elicitor được khảo sát về mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy. Dựa vào mức ảnh hưởng của chúng để sàng lọc các yếu tố có ảnh hưởng chính đến các thông số cần quan tâm. Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Các nghiệm thức được thiết lập theo thiết kế Plackett-Burman, dựa trên thông số thực tế, ma trận Plackett-Burman thu được trọng lượng tươi 4,02-4,78 g, trọng lượng khô 0,36-0,56 g và hàm lượng Plumbagin 0,169-1,154 mg trong 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.12). Giá trị ảnh hưởng của từng yếu tố lên trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin được tính toán bằng phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.13). 4 yếu tố có giá trị ảnh hưởng lớn (giá trị dương) ở các thông số trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin (p < 0,05) của rễ tơ BHX nuôi cấy được chọn là: nước dừa, chitosan, salicylic acid và pepton. Kết quả cho thấy nước dừa có tác động mạnh nhất đến tăng trưởng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của rễ, còn pepton và chitosan có ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy Plumbagin. 35 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hàm lượng Plumbagin (mg) Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình 1 4,82 4,78 0,54 0,56 1,184 1,154 2 4,22 4,02 0,403 0,36 0,899 0,731 3 4,41 4,78 0,415 0,47 0,956 0,591 4 3,37 4,02 0,253 0,36 0,945 1,154 5 4,25 4,02 0,427 0,45 0,008 0,169 6 3,61 4,02 0,439 0,36 0,380 0,591 7 5,14 4,78 0,557 0,45 0,221 0,169 8 5,28 4,78 0,559 0,56 0,860 0,731 9 4,4 4,78 0,423 0,47 0,351 0,731 10 5,32 4,02 0,563 0,45 1,42 1,154 11 4,62 4,78 0,585 0,56 0,353 0,591 12 3,34 4,02 0,346 0,45 0,361 0,169 36 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Yếu tố Giá trị khảo sát Mức tác động Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng Plumbagin Nước dừa (%) 10 30 0,76 0,108 -0,014 Peptone (mg/L) 100 500 0,34 -0,00467 0,563 Dịch trích nấm men (mg/L) 100 1000 0,277 0,020 0,005