Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây xáo tam phân (paramignya trimera (oilv.) guill.) và cây nhó đông (morinda longissima y. z. ruan)

á tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của một số hợp chất sạch Bố cục của Luận án: Luận án bao gồm 139 trang với 45 bảng, 21 hình, 4 sơ đồ phân lập và 137 tài liệu tham khảo. Luận án bao gồm 4 chương: Giới thiệu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (02 trang); Chương 3: Kết quả (10 trang), Chương 4: Thảo luận (83 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); Các bài báo liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (15 trang); Phụ lục (31 trang). 3 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN Phần tổng quan này đã đề cập đến những vấn đề sau: - Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Paramignya. - Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Morinda. - Tổng quan về kỹ thuật đánh giá tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Thân và rễ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum) (C-499) được thu hái vào tháng 2/2013 tại xã Ninh Vân, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa. Thân và rễ cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan) (C-547) được thu hái vào tháng 4/2013 tại xã Chiềng An, tỉnh Sơn La. Tên khoa học của hai loài cây trên được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện KH&CN Việt Nam. Mẫu tiêu bản của hai cây được lưu trữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-499 và C-547. 2.2. Phương pháp Phương pháp hóa học Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, phương pháp phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha đảo, Diaion HP-20, Sephadex LH-20. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phương pháp phổ bao gồm phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1D và 2D-NMR. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Các cặn chiết và các hợp chất sạch được đánh giá bằng các phương pháp sau: - Tác dụng kháng virus viêm gan B (HBV) trên in vitro trên dòng HepG2.2.15 nhiễm HBV dựa trên giá trị ức chế mức độ biểu hiện HBsAg (IC50) - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột BALB/c trên mô hình gây độc gan bằng paracetamol. 4 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 3.2. Phân lập các hợp chất từ loài Xáo tam phân Từ thân rễ cây Xáo tam phân đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất, gồm 5 coumarin, ostruthin (PT-1), ninhvanin (PT-2, mới), 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin (PT-6), ninhvanin B (PT-7, mới), hai hợp chất biscoumarin monoterpen glycosides, paratrimerin A (PT-8, mới) và paratrimerin B (PT-9, mới), 01 cromen, 6-(2-hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran (PT-3),01 alcaloid, citrusinine-I (PT- 4),01 ancol, paramitrimerol (PT-5, mới) và 01 hợp chất limonoid glucoside mới, parabacunoic acid (PT-10, mới). Các đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 10 hợp chất phân lập được được trình bày ở phần này. 3.3. Phân lập các hợp chất từ loài Nhó đông Từ thân rễ loài Nhó đông đã phân lập và xác định cấu trúc của 22 hợp chất gồm: 12 hợp chất anthranoid, damnacanthal (ML-1), lucidin-ω-methyl ether (ML-2), soranjidiol (ML-3), morindone -5- methyl ether (ML-4), rubiadin (ML-5), rubiadin-3-methyl ether (ML-6), damnacanthol (ML-7), morindone (ML-8), 1-hydroxy-2- methyl-6-methoxy anthraquinone (ML-9), morindone-6-methyl ether (ML-10), morindone-6-O-β-gentiobioside (ML-11), lucidin-3-O-β- primeveroside (ML-12), 02 naphtalen glycosid mới, morinlongoside A (ML-13, mới), morinlongoside B (ML-14, mới), 02 iridoid glycosid, morinlongoside C (ML-15, mới), geniposidic acid (ML- 16), 05 hợp chất glycosid, 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D- lucopyranosyl]-(3R)-l-octen-3-ol (ML-17), acteoside (ML-18), cistanoside E (ML-19), ethyl-β-D-galatopyranoside (ML-20), isoacteoside (ML-21) và một flavonoid quercetin (ML-22). Đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 22 hợp chất phân lập được trình bày tại phần này. 3.4. Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 5 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ Chương này trình bày về thảo luận về các kết quả về đánh giá tác dụng sinh học các cao chiết và phân đoạn, về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất và hoạt tính sinh học của các hợp chất sạch. 4.1. Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 4.1.1. Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B Bảng 4. 1. Ảnh hưởng của các cao chiết đến khả năng sống của tế bào HepG2.2.15 stt Ký hiệu Loài Mẫu Giá trị OD % sống sót 1 　Mẫu trắng 0,049 　 2 　DMSO 0,805 100 3 PT P.trimera cao chiết MeOH 0,920 114,23 4 PR P. trimera cao nước 0,799 99,27 5 PR1 P. trimera phân đoạn dianion của cao nước 0,811 100,70 6 PR2 P. trimera phân đoạn dianion của cao nước 0,832 103,31 7 PR3 P. trimera phân đoạn dianion của cao nước 0,895 111,13 8 PR4 P. trimera phân đoạn dianion của cao nước 0,805 100,02 9 PR5 P.trimera phân đoạn dianion của cao nước 0,192 23,84 10 ML M. longissima EtOH extract 0,86 102,25 11 W M. longissima cao chiết nước 0,82 107,28 - Có 8 cao chiết cho tỷ lệ sống của tế bào HepG2.2.15 trên 80%, các cao này được đánh giá tiếp khả năng ức chế mức độ biểu hiện kháng nguyên bề mặt HBsAg. Bảng 4. 2. Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết STT Ký hiệu Phân đoạn Nồng độ Giá trị OD (450nm) SE Mức độ biểu hiện HBsAg ( %) 1 Mẫu trắng 　 0,190 0,140 0 2 DMSO 0 µM 1,228 0,016 100 3 Lamivudine 50 µM 0,635 0,022 42,86 4 PT cao chiết MeOH 60 µg/ml 1,351 0,026 111,88 6 5 PR cao nước 60 µg/ml 1,647 0,066 140,37 6 PR1 phân đoạn dianion của cao nước 60 µg/ml 1,393 0,011 115,89 7 PR2 phân đoạn dianion của cao nước 60 µg/ml 1,406 0,016 117,19 8 PR3 phân đoạn dianion của cao nước 60 µg/ml 1,310 0,035 107,93 9 PR4 phân đoạn dianion của cao nước 60 µg/ml 1,269 0,014 103,98 10 ML EtOH extract 60 µg/ml 0,91 0,028 69,37 11 W cao chiết nước 60 µg/ml 1,051 0,06 85,04 Kết quả cao etanol và cao nước của loài Nhó đông có tác dụng làm giảm mức độ biểu hiện của HBsAg của tế bào HepG2.2.15. Bảng 4. 3. Nồng độ ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết Nồng độ Abs 450 SE Ức chế (%) IC50 (μg/ml) Trắng 　 0,071 0,007 0 DMSO 0 µM 1,911 0,018 100 Lamivudine 50 µM 0,905 0,040 45,30 19,92±0,18 　ML 15 µg/ml 1,856 0,001 97,02 30 µg/ml 1,754 0,081 91,48 146,90±30,17 60 µg/ml 1,567 0,129 81,31 　 7,5 µg/ml 1,966 0,000 102,98 　W 7,5 µg/ml 1,917 0,008 100,34 15 µg/ml 1,894 0,038 99,09 297,76±58,14 　 30 µg/ml 1,843 0,028 96,29 　 60 µg/ml 1,841 0,107 90,77 　 Cao tổng etanol (ML) và cao nước (W) của thân và rễ loài Morinda longissima có tác dụng kháng HBV trên in vitro. 4.1.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên in vivo - Cao metanol và cao nước rễ Xáo tam phân có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol. Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ aminotransferase huyết thanh Lô Thuốc và liều lượng AST (UI/L) ALT (UI/L) 1 Đối chứng sinh lý 87,80 ± 1,48 28,70 ± 2,59 2 Đối chứng bệnh lý 715,75 ± 253,94p<0,05 so với (1) 558,25 ± 296,54 p<0,05 so với (1) 7 3 cao metanol 10g/kg 116,50 ± 34,65 p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5) 81,25 ± 8,59 p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5) 4 cao nước liều 10g/kg 266,00 ± 170,92 p<0,05 so với (2) p<0,05 so với (5) 113,25 ± 27,41 p<0,05 so với (2) p<0,05 so với (5) 5 Đối chứng tham khảo 101,33 ± 23,03 p<0,05 so với (1) p<0,05 so với (2) 46,67 ± 11,47 p<0,05 so với (1) p<0,05 so với (2) Hình 4.1. Tiêu bản vi thể tế bào gan (A): Đối chứng sinh lý, (B): Đối chứng bệnh lý, (C): cao metanol liều 10g/kg, (D) cao nước liều 10g/kg, (E): Đối chứng tham khảo 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất từ thân rễ cây Xáo tam phân Bằng cách kết hợp các dữ liệu phổ NMR một chiều và 2 chiều, IR, MS, UV, 10 hợp chất được phân lập từ thân rễ loài Xáo tam phân đã được xác định cấu trúc như sau: PT-1 (ostruthin), C19H22O3, 298 PT-2 (ninhvanin) mới, C20H24O4, 328 O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 PT-3 (6-(2-Hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran), C13H16O2, 203 PT-4 (citrusinine-I), C16H15NO5, 301 PT-5 (paramitrimerol) mới, C14H16O3, 232 8 PT-6 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)- 7-hydroxycoumarin, C19H22O4, 314 PT-7 (ninhvanin B) mới, C19H22O4, 314 PT-9 (paratrimerin B) mới, C40H44O16, 780 PT-8 (paratrimerin A) mới, C45H52O20, 912 PT-10 (axit parabacunoic) mới, C32H44O13, 636 Hợp chất PT-8 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, tan trong các dung môi hữu cơ như axeton, clorofom, [α]D25 - 25,0o(c 0,02, MeOH). Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI- MS với hai peak ion giả phân tử ở m/z 781,2691 [M+H]+ và 803,2548 [M+Na]+ cho biết công thức phân tử của PT-8 là C40H44O16. Ion mảnh ở m/z 457,1637 [M-C12H20O10 +H]+ cho thấy hợp chất PT-8 là một mono-coumarin glucoside. Phổ IR với các tần số dao động hóa trị νmax 3379 và 1646 cm- 1 chứng minh sự có mặt của các nhóm chức OH và Cacbonyl CO lacton. Phổ UV-Vis cho thấy sự có mặt của hệ liên hợp chromophore (coumarin) ở νmax 204, 256, 292, 330 nm. Trên phổ 13C-NMR/DEPT của PT-8 xuất hiện tín hiệu 40 cacbon, gồm 12 nguyên tử cacbon bậc bốn, 22 nhóm metin (có 8 cacbon trong khoảng 74-79 ppm), 4 nhóm metilen (có hai cacbon trong khoảng 62,4-62,8 ppm), và 2 nhóm metyl. Phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất hiện các tín hiệu proton của hai vòng coumarin thế ở vị trí C-6,7 với hai cặp proton thơm dạng duplet-ortho H-3 (δH 6,28, d, 9,5 Hz)/H-4 (δH 7,95, d, 9,5 Hz); và H- 3' (δH 6,22, d, 9,5 Hz)/H-4' (δH 7,88, d, 9,5 Hz), bốn proton thơm dạng singlet H-5 (δH 7,47, s) và H-8 (δH 7,03, s), H-5' (δH 7,39, s) và H-8' (δH 7,09, s). Hình 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-8 9 Cấu trúc gồm hai coumarin thế ở vị trí C-6,7 của PT-8 được khẳng định một lần nữa qua các tương tác trên phổ COSY, HMBC, NOESY (Hình 4,12). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất hiện các tín hiệu của hai đơn vị đường β-D-glucose, cụ thể là hai proton anomer δH 4,99 (H-1''), 4,93 (H-1'''), hai cacbon anomer 102,49 (C-1'''), 101,62 (C-1''), 8 nhóm metin gắn với oxi ở δC 62,48-78,42 ppm và các tín hiệu proton ở δH 3,21-3,90 ppm. Ngoài ra, vị trí liên kết giữa hai đường glucose và hai nhân coumarin được xác định bằng dữ kiện phổ HMBC của PT-8 thông qua tương tác giữa proton anomer H-1'' (δH 4,99, d, 8 Hz) và cacbon C-7 (δC 158,35), giữa H-1''' (δH 4,93, d, 7,5 Hz) và C-7' (δC 160,03) cho phép xác định. Hơn nữa, trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa giữa proton anome H-1 và H-1 với hai proton thơm H-8 và H-8 khẳng định vị trí liên kết của hai đường glucose với hai nhân coumarin. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR hợp chất PT-8 còn xuất hiện thêm một cầu nối monoterpen (C10) được xác định là 1,4-dimethyl-4- vinylcyclohexene tương tự như hợp chất bisparasin [111]. Phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của cầu nối này bởi tín hiệu của một liên kết đôi có cấu hình trans [δH 6,41 (1H, d, 16,5 Hz, H-9) và δH 6,35 (1H, d, 16,5 Hz, H-10)], một olefin proton singlet H-10' (δH 5,35, s); 4 proton không tương đương dạng peak multilet thuộc về hai nhóm metilen-vicinal H-12 (δH1,65 &1,88, m) và H-12' (δH 2,16 & 2,29, m), hai nhóm metyl thế CH3-11' (δH 1,85, br s) và CH3-11 (δH 1,31, s). Cấu trúc cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene với hai vòng coumarin được khẳng định bằng phổ HMBC, thông qua tương 10 tác giữa nhóm metyl CH3-11' (δH 1,85) và C-10' (δC124,55), C-11' (δC135,60) và C-12' (δC28,56), tương tác nhóm metyl CH3-11 (δH 1,31) với C-10 (δC 140,92), C-11 (δC 40,22) và C-12 (δC 31,95). Liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin của hợp chất PT-8 được chứng minh qua tương tác HMBC qua ba liên kết (3J) giữa proton trans-olefin H-9 (δH 6,41) và C-5 (δC 126,6), trans-olefin H- 10 (δH 6,37) và C-6 (δC 127,66), giữa H5' (δH 7,39) và C-9'(δC 44,34). Liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin được khẳng định thêm một lần nữa trên phổ NOESY, xuất hiện tương tác giữa hai proton thơm H-5 và H-5' của vòng coumarin với proton vinyl H-9 và H-9'. Như vây, qua các tương tác HMBC và NOESY trên cho phép xác định vị trí liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin là tại C-6/C-9 và C-6'/C-9', Hơn nữa, từ phổ NOESY cho thấy có tương tác giữa nhóm 11-CH3 (δH 1,31, s) và proton H-9' (δH 4,13, s) chứng minh tính chất cấu hình dạng cis giữa hai nhóm này, cũng như cấu hình dạng cis giữa hai nhân coumarin. Cấu hình dạng ghế của cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene được khẳng định bằng tương tác NOESY của proton metylen H-12 (δH 1,87, m) với H-12 (δH 2,16, m) và đồng thời cho phép xác định vị trí nhóm 11-CH3 và proton H-9 là axial- và pseudo-axial trên cầu nối này. Trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa hai proton thơm H-5 (δH 7,47) với proton H-4 (δH 7,88) của hai nhân coumarin và đặc điểm cản quay do hai vòng coumarin glucozit cồng kềnh và cấu hình dạng cis của hai nhóm thế coumarin trên, cho phép xác định cấu hình tại hai cacbon bất đối C-9' và C-11 có thể xuất hiện ở dạng 9'S,11S hoặc 9'R,11R. Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-8 11 Hình 4.12. Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất 8 Bảng 4.14. Bảng số liệu phổ hợp chất PT-8 C 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) 1H-NMR ( MeOD, 500 MHz) HMBC 13C1H HMBC 1H13C COSY 1H -> 1H NOESY 1H -> 1H 2 163,28 (s) - 3, 4 - 3 114,31 (d) 6,28, d, 9,5 Hz - 2, 4a 4 4 4 146,00 (d) 7,95, d, 9,5 Hz 5 2, 8a, 5 3 3 4a 115,19 (s) - 3, 8 - - 5 126,60 (d) 7,47, s 4 4, 7, 8a - 9 6 127,66 (s) - 8, 10 - - 7 158,35 (s) - 5, 8, 1'' 6, 7 - 8 103,99 (d) 7,03, s - 4a, 6, 7, 8a - 1'' 8a 155,22 (s) - 4, 5, 8 - - 9 121,23 (d) 6,41, d, 16,5 Hz 5 5, 10 10 5, 11- CH3 10 140,92 (d) 6,37, d, 16,5 Hz 9, 11-CH3 9, 11, 11- CH3 9 11-CH3 11 40,22 (s) - 9, 12, 11- - 9, 10, 9' 12 C 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) 1H-NMR ( MeOD, 500 MHz) HMBC 13C1H HMBC 1H13C COSY 1H -> 1H NOESY 1H -> 1H CH3 12 31,95 (t) 1,65-1,88, 2H, m 11-CH3 10, 11, 12' 12' 11- CH3 25,82 (q) 1,31, s 12 10, 11, 9', 12' - 2' 163,49 (s) - 2', 3' - - 3' 114,08 (d) 6,22, d, 9,5 Hz - 2', 4'a 4' 3' 4' 145,89 (d) 7,88, d, 9,5 Hz 5' 2', 5', 8'a 3' 4' 4'a 114,40 (s) - 3', 8' - - 5' 130,95 (d) 7,39, s 4' 4', 7', 8'a - 6' 131,62 (s) - 8' - - 7' 160,03 (s) - 5', 8', 1''' - - 8' 103,63 (d) 7,09, s - 4'a, 6', 7', 8'a - 1''' 8'a 155,03 (s) - 4', 5', 8' - 9' 44,34 (d) 4,13, s 12, 5', 11'- CH3 12, 11- CH3, 5' - 10' 124,60 (d) 5,35, s 11'-CH3 11' 135,60 (s) - 12, 11'-CH3 12' 28,56 (t) 2,29, m 2,16, m 12, 11'-CH3 12 8 11'- CH3 23,66 (q) 1,85, s - - 1'' 101,62 (d) 4,99, d, 8 Hz 7 2'' 8 2'' 74,77 (d) 3,35-3,4, m 1'' 3'' 78,19 (d) 3,42 -3,53, m 4'' 71,71 (d) 3,23, 1H, t, 9 Hz 5'' 78,42 (d) 3,42 -3,53, m 6'' 62,72 (t) 3,85, dd, 12, 2 Hz 3,35-3,39, m 4'' 1''' 102,49 (d) 4,93, d, 7,5 Hz 7' 2''' 8' 2''' 75,01 (d) 74,77 (d) 3,58, dd, 8,0, 8,0 Hz 1''' 3''' 78,34 (d) 3,42 -3,53, m 4''' 71,21 (d) 3,33-3,39, m 5''' 78,38 (d) 3,42 -3,53, m 6''' 62,48 (t) 3,88, dd, 12, 2 Hz 3,70, dd, 12, 6,5 Hz Dựa vào dữ kiện phổ trên, hợp chất PT- 8 được xác định là một biscoumarin glucoside mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và đặt tên là paratrimerin A. 4.3. Xác định các hợp chất từ thân rễ cây Nhó đông 13 Bằng cách kết hợp các dữ liệu phổ NMR một chiều và 2 chiều, IR, MS, UV, 22 hợp chất được phân lập từ thân và rễ loài Nhó đông đã được xác định cấu trúc như sau: Damnacanthal (ML-1) C16H10O5, 282 Lucidin-ω-methyl ether (ML-2) C16H12O5, 284 Sorandidiol (ML-3) C15H10O4, 254 Morindone-5-methyl ether (ML-4), C16H12O5, 284 Rubiadin (ML-5) C15H10O4, 254 Rubiadin-3-methyl ether(ML-6), C16H12O4,268 Damnacanthol (ML-7) C16H12O5, 284 Morindone (ML-8) C15H10O5, 270 1-hydroxy-2-methyl-6- methoxy anthraquinone (ML-9) C16H12O4, 268 Morindone-6-methyl ether (ML-10) C16H12O5, 284 Morindone-6-O-β- Gentiobioside(ML-11) C27H30O15, 594 Lucidin-3-O-β- primeveroside (ML-12) C26H28O14, 564,5 14 morinlongoside A (ML-13) C29H38O15, 626 morinlongoside B (ML-14) C27H36O13, 568 morinlongoside C (ML- 15) C22H32O15, 536 Geniposidic acid (ML-16) C16H22O10, 374 3-O-[β-D-Xylopyranosyl-(1-6)-β- D-glucopyranosyl] (3R)-l-octen-3-ol (ML-17) C19H33O10, 421 Cistanoside-E (ML-18) C21H32O12, 476,47 Ethyl-β-D- galatopyranoside (ML-19) C8H16O6, 208,09 Isoacteoside (ML-20) C29H36O15, 624 Acteoside (ML-21) C29H36O15, 624 Quercetin (ML-22) C15H10O7, 302 4.4. Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 4.4.1. Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B Đánh giá ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của 09 hợp chất sạch đã được đánh giá bằng MTS sau 48 giờ ủ. Bảng 4. 3. Ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của các hợp chất sạch stt 　Nồng độ Ký hiệu Hợp chất Giá trị OD % Sống sót 1 　 　Mẫu trắng 0,049 　 15 2 　 　DMSO - D6 0,805 100 3 10 µM VHKC 1099 ostruthin (PT-1) 0,165 20,55 4 10 µM VHKC 1111 ninhvanin (PT-2) 0,625 77,60 5 10 µM VHKC 1114 6-(2-Hydroxyethyl)- 2,2-dimethyl-2H-1- benzopyran (PT-3) 0,905 112,37 6 10 µM VHKC 1131 paratrimerin A (PT-8) 0,900 111,81 7 10 µM VHKC 1132 paratrimerin B (PT-9) 0,713 88,59 8 10 µM VHKC 1133 parabacunoic acid (PT- 10) 0,53 65,81 9 10 µM VHKC 1100 morindone (ML-8) 1,011 125,60 10 10 µM VHKC 1138 damnacanthal (ML-1) 0,800 99,39 11 10 µM VHKC 1139 rubiadin (ML-5) 1,014 125,97 Kết quả cho thấy 05 hợp chất sạch cho tỷ lệ sống của tế bào HepG2.2.15 trên 80%, các hợp chất này được đánh giá tiếp khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg. Bảng 4. 4. Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trong tế bào Hep2.2.15 của các hợp chất sạch Ký hiệu Phân đoạn Nồng độ Giá trị OD (450nm) SE Mức độ biểu hiện HBsAg % Mẫu trắng 　 0,190 0,140 0 DMSO 0 µM 1,228 0,016 100 Lamivudine 50 µM 0,635 0,022 42,86 VHKC 1114 6-(2-Hydroxyethyl)- 2,2-dimethyl-2H-1- benzopyran (PT-3) 20 µM 1,276 0,044 104,61 VHKC 1131 paratrimerin A (PT-8) 20 µM 1,300 0,061 106,92 VHKC 1100 morindone (ML-8) 20 µM 0,992 0,067 77,28 VHKC 1138 damnacanthal (ML-1) 20 µM 1,077 0,094 85,42 VHKC 1139 rubiadin (ML-5) 20 µM 1,058 0,077 83,64 Morindone (ML-8), rubiadin (ML-5) và damnacanthal (ML-1) có khả năng ức chế tốt biểu hiện HBsAg. Bảng 4. 5. Giá trị IC50 của 03 mẫu chất sạch Nồng độ Abs 450 SE Ức chế % IC50(µM) Mẫu trắng 　 0,071 0,007 0 　 DMSO 0 µM 1,911 0,018 100 　 16 Lamivudine 50 µM 0,905 0,040 45,30 19,92±0,18 　 2,5 µM 1,829 0,026 95,53 　 VHKC 1100 5 µM 1,577 0,015 81,85 32,06±3,21 　morindone (ML-8) 10 µM 1,465 0,056 75,74 　 　 20 µM 1,315 0,089 67,61 　 　 2,5 µM 1,813 0,009 94,66 　 VHKC 1138 5 µM 1,711 0,067 89,11 32,54±3,05 　damnacanthal (ML-1) 10 µM 1,471 0,107 76,06 　 　 20 µM 1,275 0,003 65,41 　 　 2,5 µM 1,858 0,081 97,13 　 VHKC 1139 5 µM 1,809 0,019 94,44 45,82±10,79 　rubiadin (ML-5) 10 µM 1,657 0,042 86,20 　 　 20 µM 1,409 0,053 72,72 　 Hợp chất morindone (ML-8), rubiadin (ML-5) và damnacanthal (ML-1) có hoạt tính ức chế HBV in vitro thông qua khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg trên dòng tế bào HepG2.2.15. 4.4. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của một số hoạt chất từ loài Xáo tam phân Ninhvanin (PT-2, hợp chất mới), ở mức 50 mg/kg/ngày làm giảm nồng độ ALT huyết thanh cũng như hạn chế một phần tổn thương gan do paracetamol gây ra (400 mg/kg). Ostruthin (PT-1) ở mức 50 mg/kg/ngày làm giảm nồng độ ALT và AST huyết thanh và hạn chế tổn thương gan do paracetamol gây ra. Ostruthin có tác dụng bảo vệ gan tốt tương đương với sylimarin với cùng liều 50 mg/kg/ngày Bảng 4. 6. Ảnh hưởng của hợp chất ostruthin và ninhvanin lên nồng độ aminotransferase huyết thanh Lô Thuốc và liều lượng AST (UI/L) ALT (UI/L) 1 Đối chứng sinh lý 84,20 ± 3,90 29,20 ± 2,59 2 Đối chứng bệnh lý 324,00 ± 50,54 p< so với (1) 495,67 ± 61,50 p< so với (1) 3 ostruthin 50 mg/kg 97,00 ± 15,72 p> so với (1) p< so với (2) p>so với (5) 62,00 ± 23,30 p< so với (1) p<0,01 so với(2) p> so với (5) 4 ninhvanin 50 mg/kg 283,00 ± 11,13 p>so với (2) p< so với (5) 162,67 ± 72,51 p< so với (2) p< so với (5) 17 5Đối chứng tham khảo (silymarin 50 mg/kg) 90,32 ± 19,06p> so với (1) p<so với (2) 56,00 ± 12,53 p< so với (1) p< so với (2) Hình 4. 1. Tiêu bản vi thể tế bào gan (A): Đối chứng sinh lý, (B): Đối chứng bệnh lý (C): Đối chứng tham khảo (D) ostruthin liều 50 mg/kg P (E): ninhvanin liều 50 mg/kg KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hai cây thuốc Xáo tam phân và Nhó đông đã được nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học một cách có hệ thống. Về tác dụng sinh học của cao chiết Cao etanol và cao nước của thân rễ loài Nhó đông có có tác dụng kháng HBV in vitro thông qua làm giảm mức độ biểu hiệu HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 nhiễm virus viêm gan B (HBV) với giá trị IC50 tương ứng là 146,90 ± 30,71 μg/ml, 297,76 ± 58,14 μg/ml. Cao nước rễ cây Xáo tam phân ở liều 10g/kgP đã làm giảm hoạt độ AST, ALT và một phần tổn thương gan ở chuột do paracetamol liều 400 mg/kg thể trọng (kgP). Cao metanol rễ Xáo tam phân ở liều 10 g/kgP có tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin ở mức liều 50 mg/kgP. Về thành phần hóa học Từ thân rễ cây Xáo tam phân đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất, gồm 5 coumarin, ostruthin (PT-1), ninhvanin (PT-2, mới), 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin (PT-6), ninhvanin B (PT-7, mới), hai hợp chất biscoumarin monoterpen glycosides, paratrimerin A (PT-8, mới) và paratrimerin B (PT-9, mới), 01 cromen, 6-(2-hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran (PT-3),01 alcaloid, citrusinine-I (PT- 4),01 ancol, paramitrimerol (PT-5, mới) và 01 hợp chất limonoid glucoside mới, parabacunoidc acid (PT-10, mới). 18 Từ thân rễ loài Nhó đông đã phân lập và xác định cấu trúc của 22 hợp chất gồm: 12 hợp chất anthraquinone, damnacanthal (ML-1), lucidin-ω-methyl ether (ML-2), soranjidiol (ML-3), morindone -5-methyl ether (ML-4), rubiadin (ML-5), rubiadin-3- methyl ether (ML-6), damnacanthol (ML-7), morindone (ML-8), 1- hydroxy-2-methyl-6-methoxy anthraquinone (ML-9), morindone-6- methyl ether (ML-10), morindone-6-O-β-gentiobioside (ML-11), lucidin-3-O-β-primeveroside (ML-12), 02 naphtalen glycosid mới, morinlongoside A (ML-13, mới), morinlongoside B (ML-14, mới), 02 iridoid glycosid, morinlongoside C (ML-15, mới), geniposidic acid (ML-16),05 hợp chất glycosid, 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)- β-D-lucopyranosyl]-(3R)-l-octen-3-ol (ML-17), acteoside (ML-18), cistanoside E (ML-19), ethyl-β-D-galatopyranoside (ML-20), isoacteoside (ML-21) và một flavonoid quercetin (ML-22). Về đánh giá tác dụng sinh học của một số hợp chất sạch Ba hợp chất anthraquinone, morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) có tác dụng kháng HBV in vitro thông qua làm giảm mức độ biểu hiệu HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 nhiễm HBV với giá trị IC50 tương ứng là 32,06 ± 3,21 μM, 32,54 ± 3,05 μM, 45,82 ± 10,79 μM. Hợp chất ninhvanin ở liều 50 mg/kg/ngày chỉ có tác dụng làm giảm chỉ số ALT và hạn chế một phần tổn thương gan gây ra bởi paracetamol liều 400 mg/kg trên chuột. Trong khi đó, hợp chất ostruthin ở liều 50 mg/kg/ngày không những có tác dụng làm giảm chỉ số AST, ALT, hạn chế tổn thương gan gây ra bởi paracetamol và có tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin ở mức liều 50 mg/kg/ngày. KIẾN NGHỊ Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Paramignya trimera và Morinda longissima cho thấy: - Cần nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả, độ an toàn và cơ chế hoạt động trong điều trị các bệnh về gan của ostruthin (PT-1). - Ba hợp chất anthranoid, morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) là những hợp chất tiềm năng để nghiên cứu và phát 19 triển các loại thuốc để điều trị HBV. Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn về tác dụng chống HBV của các hợp chất này trên in vivo. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Lần đầu tiên, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Xáo tam phân và Nhó đông được nghiên cứu trên thế giới. - Từ thân và rễ của loài Xáo tam phân, 06 hợp chất mới (ninhvanin (PT-2), ninhvanin B (PT-7), paratrimerin A (PT-8), paratrimerin B (PT-9), paramitrimerol (PT- 5), axit parabacunoidc (PT-10) được phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học. Đặc biệt, hợp chất PT-8 và PT-9 là các glycoside biscourmarin liên kết monoterpen đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. - Từ thân và rễ của loài Nhó đông đã phân lập hai hợp chất naphthalene glycoside mới, morinlongoside A (ML-13), morinlongoside B (ML-14), một glycoside iridoid, morinlongoside C (ML-15). - Cao metanol và ostruthin từ thân và rễ của loài Xáo tam phân cho thấy các hoạt động bảo vệ gan tốt, hạn chế tổn thương gan gây ra bởi paracetamol ở chuột BALB/c. - Lần đầu tiên phát hiện, chiết xuất ethanol và nước và morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) từ thân và rễ của loài Nhó đông có hoạt tính chống HBV trên in vitro thông qua sự ức chế HBsAg ở tế bào HepG2.2.15. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Tê