Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận Gellan từ Sphingomonas Paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm - Nguyễn Thị Hồng Hà

3). Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan thu được ở hình 3.2. đã khẳng định lại khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi môi trường được bổ sung L-threonine 0,05%. 21.5 22.7 24 24.2 0 5 10 15 20 25 30 1.50 1.75 2.00 2.25 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /L ) Nồng độ bột đậu tƣơng (%) 7 Axit amin Hàm lƣợng gellan (g/l) Đối chứng (Không axit amin) 19,4 ± 0,36 Glycine 21,4 ± 0,39 L-valine 22,1 ± 0,89 L-glutamine 23,2 ± 0,47 L-threonine 24,3 ± 0,52 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các axit amin Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine 3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 Động học phát triển của chủng S. paucimobilis GL12 cho thấy chủng sinh trưởng mạnh nhất từ giờ thứ 6 đến 24 giờ. Theo thời gian lên men, với việc tăng sinh khối, đồng thời lượng gellan được tích lũy quanh tế bào cũng tăng lên, kéo theo giảm hiệu quả cấp oxy cho tế bào. Để khắc phục hiệu ứng này, tiến hành các thử nghiệm bổ sung thêm H2O2 vào dịch lên men dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2. Tuy nhiên, nồng độ H2O2 quá mức lại là một trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến việc ức chế sự phát triển của tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan. Do vậy, trong phần này tiến hành các thử nghiệm bổ sung dần H2O2 vào các mốc thời gian tương ứng 6, 12, 18, 24, 28 giờ với các liều lượng khác nhau theo từng chế độ thử nghiệm. Sau 72 giờ lên men, các mẫu được lấy đi đánh giá lượng sinh khối và gellan tạo thành Kết quả phân tích ở bảng 3.4 cho thấy, việc bổ sung H2O2 theo CĐ1 và CĐ2 hầu như không làm tăng được lượng sinh khối cũng như không cải thiện được khả năng sinh tổng hợp gellan cho chủng nghiên cứu. Điều này có thể lý giải do ở những giờ nuôi đầu (6, 12 giờ) lớp gellan bảo vệ bên ngoài vi khuẩn chưa nhiều nên việc sử dụng hàm lượng H2O2 ở những nồng độ 4 và 3 mM là không phù hợp sẽ gây sốc tế bào, ức chế quá trình tăng sinh. Đổi lại, với CĐ3 lượng H2O2 bổ sung ban đầu được duy trì ở mức thấp hơn (2 mM) sau mới tăng dần lên tới 3 và 4 mM ở những giờ cuối đã kích thích tăng sinh khối tế bào và kéo theo tăng hàm lượng gellan. Kết quả nhận được ở các CĐ4, CĐ5 và CĐ6 cho hàm lượng gellan thấp hơn hoặc tương tự với CĐ3. Thử nghiệm cũng cho thấy, kéo dài việc cung cấp H2O2 ở giờ thứ 28 (CĐ6) là không cần thiết bởi lẽ lúc đó vi khuẩn bắt đầu vào pha cân bằng, nhu cầu oxy đã giảm, khi đó chế độ sục khí hay lắc của hệ thống lên men cũng đủ để đảm bảo duy trì sự sống cho vi khuẩn. Guilan Z., (2014) cũng đã công bố sự sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi bổ sung H2O2 trong những giờ đầu lên men. Như vậy, bổ sung H2O2 theo CĐ3 sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 20.8 22.5 24.3 24.5 0 5 10 15 20 25 30 0.01 0.03 0.05 0.07 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /l ) Tỷ lệ L- threonine (%) 8 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan Chế độ Lƣợng H2O2 bổ sung (mM) tƣơng ứng ở các mốc 6, 12, 18, 24, (28) giờ Lƣợng sinh khối tế bào (g/l) Hàm lƣợng gellan (g/l) ĐC 0, 0, 0, 0 3,95 ± 0,36bc 20,1 ± 0,96b CĐ1 4, 3, 2, 2 3,97 ± 0,26c 20,1 ± 0,148b CĐ2 3, 4, 2, 2 4,12 ± 0,18ab 21,7 ± 0,84b CĐ3 2, 2, 3, 4 4,74 ± 0,36a 26,2 ± 0,88a CĐ4 2, 2, 4,3 4,38 ± 0,29ab 25,3 ± 0,47a CĐ5 2, 2, 3, 5 4,76 ± 0,18a 26,2 ± 1.19a CĐ6 2, 2, 3, 4 và (4) 4,74 ± 0,38a 26,2 ± 0,98a 3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan Để xác định được thời gian lên men thích hợp cho hàm lượng gellan cao nhất, trong phần này các thí nghiệm được thiết kế theo các điều kiện lựa chọn ở trên (Bột đậu tương 2,0%, L-threonine 0,05 %, bổ sung H2O2 theo CĐ3, các điều kiện khác giữ nguyên). Kết quả trình bày ở hình 3.3. cho thấy, quá trình sinh tổng hợp gellan diễn ra sau 6 giờ nuôi cấy. Pha logarit của chủng kéo dài từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 30. Cùng với sự tăng sinh khối trong pha này, lượng gellan tích lũy trong dịch lên men cũng tăng theo từ 0,44 đến 10,20 g/l nhưng đạt giá trị cực đại (31,40 g/l) ở giờ thứ 66. Như vậy, hàm lượng gellan của chủng S. paucimobilis GL12 được sinh tổng hợp trong suốt pha logarit và cả ở pha cân bằng. Tác giả Nampoothiri M. K., (2003) cũng cho thấy chủng S. paucimobilis ATCC 31461 đạt hàm lượng gellan cao nhất tại 48 giờ. Trong khi đó, với chủng S. paucimobilis E2, Lobas D., (1992) lại tìm thấy từ 60-68 giờ là khoảng thời gian thích hợp cho thu nhận gellan. Như vậy, thời gian lên men tạo gellan phụ thuộc nhiều vào chủng sản xuất và điều kiện tiến hành. Dựa vào các kết quả thí nghiệm thu được, lựa chọn thời gian 66 giờ là thời điểm kết thúc quá trình lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis GL12. Hình 3.3. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S. paucimobilis GL12 (Mũi tên chỉ các thời điểm bổ sung H2O2 tương ứng với nồng độ 2, 2, 3, 4 mM) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 5 10 15 20 25 30 35 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 O D 6 0 0 n m H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /l ) Thời gian (giờ) Hàm lượng gellan (g/l) OD 600 nm 1 2 3 4 9 3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12, đã xác định được mức độ tác động đơn lẻ của các yếu tố tới sự sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12. Tuy nhiên, trong môi trường lên men các vi sinh vật sẽ phải chịu tác động đồng thời của các yếu tố đó, đặc biệt ba yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn là glucose, bột đậu tương và L-threonine. Nhằm xác định được giá trị tối ưu của các yếu tố này, phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken đã được sử dụng và đưa ra được phương trình hồi qui biểu diễn ảnh hưởng của ba yếu tố trên tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 như sau: Hàm lượng gellan (Y) = + 32,2 + 2,02X1 + 0,71X2 + 1,18X3 + 1,5X1X2 – 0,89X1X3 + 1,39X2X3 – 3,05X1 2 – 3,05 X2 2 – 1,12X3 2 với X1, X2 và X3 là các yếu tố glucose, bột đậu tương và L-threonine tương ứng Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis GL12. Kết quả tìm được giá trị hàm lượng gellan cao nhất theo lý thuyết đạt từ 31,0 đến 32,96 g/l khi tổ hợp 3 yếu tố là nồng độ glucose: 3,6 %; bột đậu tương: 2,1 %; L- threonine 0,06 %. Tiến hành lên men thực nghiệm với các điều kiện vừa tìm được ở trên, kết quả hàm lượng gellan thu được đạt (32,80 ± 0.85 g/l) nằm trong khoảng tin cậy trung bình 95% của khoảng giá trị dự đoán theo lý thuyết. Những kết quả này xác nhận, kết quả lý thuyết và thực nghiệm chênh trong giới hạn cho phép. Dưới điều kiện tối ưu, chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 sinh tổng hợp gellan với hàm lượng 32,7 g/l sau 48 giờ lên men (Nampoothiri M. K., 2003). Cũng với chủng trên, Bajaj B. I., (2007) lại thu được 35,9 g/l, trong khi đó, Jun Zhang (2015) báo cáo chỉ tổng hợp được gellan từ S. paucimobilis QHZJUJW CGMCC2428 với hàm lượng 19.90 ± 0.68 g/l trên môi trường có 4% sucrose, 3% peptone, ở pH 7.0, 30oC sau 72 giờ lên men. 3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít * Xác định tốc độ khuấy: Trong phần này 5 tốc độ khuấy 200; 225, 250, 275 và 300 vòng/phút được thử nghiệm. Kết quả hình 3.10 cho thấy, ở tốc độ khuấy 200 vòng/phút, khả năng tạo gellan thu được khá thấp chỉ đạt 28,3 g/l sau 66 giờ lên men. Sản lượng gellan đạt tối đa là 32,5 g/l ở tốc độ khuấy 275 vòng/phút. Tuy nhiên, khi tăng tốc độ khuấy lên 300 vòng/phút sản lượng gellan giảm nhẹ. Kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, tốc độ khuấy trộn ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12. Trong nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô lớn thì độ nhớt của môi trường cao và nhu cầu oxy lớn do vậy nếu tốc độ khuấy thấp sẽ không thích hợp. Nhưng tốc độ khuấy quá lớn sẽ tạo ra lực cắt làm ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như sự phát triển của tế bào, điều đó đồng nghĩa với việc các sản phẩm thứ cấp tạo thành cũng bị ảnh hưởng (Banik R. M., 2006). Do vậy, tốc độ khấy 275 vòng/phút được chọn cho nghiên cứu tiếp theo. 10 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít (khấy 275 v/ph) * Xác định thời gian thu hồi gellan: Đồ thị biểu thị sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp gellan của chủng vi khuẩn S. paucimobilis GL12 trong quá trình sinh tổng hợp gellan trên bình lên men sục khí 10 lít với tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và tốc độ khuấy 275 vòng/phút được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, đường cong sinh trường của chủng nghiên cứu ở qui mô này cũng tương tự như ở qui mô bình tam giác, lượng sinh khối đạt cực đại sau khoảng 30 giờ lên men. Gellan cũng được tích lũy ngay từ pha logarit, tăng dần theo thời gian và đạt cực đại ở pha cân bằng (33,1 g/l ở 58 giờ). Mặc dù hàm lượng gellan thu nhận ở quy mô bình sục khí không khác nhiều so với quy mô phòng thí nghiệm (32,8 g/l ở 66 giờ), nhưng thời gian thu nhận gellan đã rút ngắn được tới 8 giờ. Điều này có thể là do ở hệ thống bình lên men việc kiểm soát tốc độ cấp khí tốt hơn cho quá trình tăng trưởng và duy trì của vi khuẩn. Hơn nữa, lượng H2O2 bổ sung theo bậc vào môi trường lúc này có thế lại đóng vai trò như một tác nhân gây sốc nhẹ để cảm ứng cho vi khuẩn tăng tiết nhanh gellan ra bên ngoài bề mặt để bảo vệ chúng. 3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối Do đặc tính của chủng S. paucimobilis khi sinh trưởng phát triển sẽ tiết ra gellan bám xung quanh tế bào để bảo vệ chúng khỏi các tác động bên ngoài. Do vậy, để tách gellan khỏi sinh khối, dịch lên men cần được xử lý trước khi ly tâm. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn Nhiệt độ dịch lên men ( o C) Hàm lƣợng gellan (g/l) Hàm lƣợng sinh khối tế bào (g/l) Không xử lý nhiệt (ĐC) --- --- 75 -- -- 85 - 3,51 90 31,9 4,62 95 32,8 4,74 100 32,6 4,75 Chú thích: --- : Không tách pha, không thu hồi được gellan; -- : Có dấu hiệu tách pha, khi ly tâm không phân tách được sinh khối tế bào và gellan; - : Có tách pha, khi ly tâm dịch nổi chứa gellan còn lẫn sinh khối tế bào; 28.3 29.1 30.7 32.3 31.8 0 5 10 15 20 25 30 35 200 225 250 275 300 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /L ) Tốc độ khuấy(vòng/phút) 0 0.5 1 1.5 2 0 5 10 15 20 25 30 35 0 12 24 36 48 52 56 58 60 62 64 66 O D 6 0 0 n m H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /l ) Thời gian (giờ) Hàm lượng gellan pH 1 2 4 3 11 Kết quả của bảng 3.5. cho thấy, khi xử lý dịch lên men ở nhiệt độ dưới 85oC không thể tách hết gellan ra khỏi sinh khối. Tuy nhiên ở các mốc nhiệt xử lý 90, 95, 100oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút cho hiệu quả tách vi khuẩn khỏi dịch lên men là như nhau. Hiện tượng này có thể do khi nâng nhiệt tế bào vi khuẩn ở nhiệt độ cao sẽ biến tính co cụm lại và nhả khối dịch gellan bám xung quanh tế bào. Bên cạnh đó ở khoảng nhiệt độ này cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan ở dạng sợi đơn, độ nhớt giảm kéo theo giảm độ kết dính với bề mặt vi khuẩn. Do vậy, khi tiến hành ly tâm sẽ dễ dàng tách được gellan khỏi tế bào vi khuẩn. 3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ * Lựa chọn dung môi thích hợp: Dịch lên men thu được qua bước tiền xử lý ở trên được cho thử nghiệm kết tủa gellan với các dung môi ethanol, acetone và isopropyl alcohol theo tỉ lệ dịch:dung môi là 1:3 (v/v). Kết quả ở hình 3.6A. cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan từ các dung môi thử nghiệm là khá cao (trên 91%) và khác nhau không đáng kể, có lẽ vì gellan là một polyme anion nên chúng kết tủa tốt với các dung môi phân cực. Tuy nhiên xét về hiệu quả kinh tế và tính an toàn, ethanol sẽ là dung môi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp của luận án. West T. P., (2003) cũng đã chọn ethanol là dung môi để thu hồi gellan và nhận thấy khi sử dụng ethanol hiệu suất thu hồi gellan đạt cao hơn so với khi sử dụng dung môi isopropyl alcohol và methanol. A. Ảnh hưởng của các loại dung môi B. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất thu hồi gellan * Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan: Để hiệu suất thu hồi gellan cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men gellan/ethanol đến khả năng thu hồi gellan được tiến hành khảo sát với 4 tỷ lệ khác nhau: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3. Kết quả nghiên cứu ở hình 3.6B cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan cao nhất ở tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/3 cho hiệu suất thu hồi đạt 94,2%. Ở tỷ lệ 1/2, hiệu suất thu hồi gellan có thấp hơn nhưng không nhiều so với tỉ lệ 1/3 (hiệu suất đạt 93,6%). Khi giảm lượng cồn xuống (ở các tỷ lệ 1/1 và 2/2) hiệu suất thu hồi gellan cũng bị giảm xuống nhiều (tương đương 76,2% và 62,5%). 91.5 94.2 93.3 30 30.9 30.6 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 Aceton Ethanol Isopropyl alcohol H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /l ) H iệ u s u ấ t th u h ồ i g el la n ( % ) Dung môi Hiệu suất thu hồi gellan Hàm lượng Gellan (g/l) 20.5 25 30.7 30.9 62.5 76.2 93.6 94.2 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2/1 1/1 1/2 1/3 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /l ) H iệ u s u ấ t th u h ồ i g el la n ( % ) Tỷ lệ dịch lên men/ethanol Hàm lượng gellan (g/l) Hiệu suất thu hồi gellan (%) 12 Từ các nhận xét trên, tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/2 sẽ được lựa chọn nhằm giúp tiết kiệm đáng kể lượng ethanol tiêu hao mà vẫn đảm bảo được hiệu suất thu hồi gellan khá cao. 3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan Do đặc tính của các chủng Sphingomonas sp trong quá trình sinh trưởng và phát triển cũng thường tiết ra môi trường các sắc tố carotenoid màu vàng nên kéo theo các kết tủa gellan cũng bị sậm màu nếu các sắc tố này không được loại ra trước đó (Xuechang W., 2011). Dựa trên khả năng hòa tan của các carotenoid vào các dung môi hữu cơ, lặp lại các lần kết tủa gellan với các dung môi này sẽ làm tăng được độ sáng màu cho kết tủa. Trong phần này, tiến hành thí nghiệm với 500 ml dịch lên men sau khi đã tách sinh khối. Ethanol 95 o được sử dụng làm dung môi để kết tủa gellan với 4 lần kết tủa lặp lại. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu qua các lần kết tủa được cho ở bảng 3.6. Từ kết quả phân tích này và quan sát sự cải thiện độ trắng của kết tủa gellan (hình 3.7), kết tủa lặp lại 3 lần sẽ được lựa chọn. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu Số lần kết tủa Lƣợng gellan tổng (g) Hiệu suất thu hồi gellan (%) Lƣợng carotenoid tổng bị loại ra (g) Khả năng loại carotenoid (%) Dịch gellan thô 16,40 - 0,0930 - 1 15,35 93,6 0,0776 83,4 2 15,04 91,7 0,0846 91,0 3 14,70 89,6 0,0867 93,2 4 14,61 89,1 0,0868 93,3 Dịch gellan sau lên men Kết tủa lần 1 Kết tủa lần 2 Kết tủa lần 3 Hình 3.7. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại 3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột Để sản phẩm gellan dễ sử dụng, dễ bảo quản thì cần tạo chế phẩm gellan dạng bột. Dịch gellan đậm đặc có đặc tính là một khối keo nhớt nên không dễ dàng để tiến hành sấy phun, sấy đông khô nếu không bổ sung chất trợ sấy. Tuy nhiên, khi bổ sung chất trợ sấy có thể sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc tạo gel của chế phẩm. Phương pháp sấy đối lưu đã khắc phục được các nhược điểm trên và được sử dụng để thử nghiệm cho nội dung nghiên cứu này. 13 Qua khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày vật liệu sấy đã tìm được thông số sấy thích hợp với độ dày khối sấy 5cm, nhiệt độ của tác nhân sấy là 80oC và thời gian sấy là 24 giờ, hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt 85,9 % với độ ẩm sản phẩm là 6,50 %. Tóm tắt các bước trên tính được hiệu suất tổng của quá trình thu hồi chế phẩm gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 là 76,9 % (bảng 3.7) Bảng 3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 Các công đoạn Hiệu suất (%) Dịch nổi 100 Kết tủa gellan + loại màu 89,6 Sấy 85,9 Toàn bộ quá trình 76,9 3.2.5. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan Trong quá trình sản xuất và phân phối hàng hóa, bao bì có chức năng bảo vệ sản phẩm trong môi trường kín, ngăn cản độ ẩm không khí, tránh ánh sáng, tránh tác động của các lực bên ngoài, giữ cho tính chất của sản phẩm được ổn định trong một thời gian nhất định. Vì chế phẩm gellan có đặc tính hòa tan được trong nước, dễ bị hút ẩm nên việc lựa chọn loại bao bì thích hợp để bảo quản chế phẩm là rất cần thiết. Sau khi khảo sát đặc tính của một số loại bao bì 1 lớp và nhiều lớp (màng kép), độ ẩm của gellan bảo quản trong các loại màng này hầu như không thay đổi so với khi mới đóng gói. Ở loại màng ghép thì màng có lá nhôm tránh ẩm tốt nhất, điều đó đã chứng minh vai trò của lớp lá nhôm mỏng trong vật liệu tạo màng, có được kết quả này là do ngoài các tính chất về độ bền hóa học, bền nhiệt độ, bền cơ học, màng nhôm còn có một số tính chất mà các vật liệu khác không có được là tính chống khí, độ ẩm và ánh sáng rất tốt. Xét về mặt kinh tế thì các loại màng ghép càng nhiều lớp giá càng đắt. Do vậy, để phù hợp cho việc đóng gói sản phẩm được an toàn, đồng thời có hiệu quả kinh tế, màng Al/PE được lựa chọn cho bảo quản sản phẩm gellan. Sau 06 tháng bảo quản gellan đựng trong màng này vẫn có độ ẩm 6,51%. 14 3.2.7. Đề xuất quy trình thu nhận S. paucimobilis GL12 Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu, quy trình công nghệ sản xuất bột gellan được đề xuất: Hình 3.8. Qui trình công nghệ thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men 10 lít 3.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl của gellan, các thí nghiệm được tiến hành trong môi trường kiềm ở một số giá trị pH khác nhau 8, 9, 10, và 11 với thời gian xử lý 8 Chủng vi khuẩn S.paucimobilis GL12 Nhân giống (30oC ± 2; pH 7 ± 0,2; 20 giờ; 200 vòng/phút) Lên men sinh tổng hợp gellan (giống 8%; 30oC, pH 7; H2O2 ở 6, 12, 18 và 24 h bổ sung 2, 2, 3 và 4 mM; 275 vòng/ phút; tốc độ thổi khí 1 lít/lít/phút; 58 giờ) Tiền xử lý dịch lên men tách vi khuẩn (95 – 100 oC/ 15 phút) Kết tủa gellan (dịch nổi/Ethanol: 1/2; kết tủa 10 giờ) Sấy tủa (Độ dày lớp sấy 5cm; 80 - 85 oC; thổi khí: 1m/s; sấy 24 giờ) Ethanol 95o Ly tâm thu dịch nổi chứa gellan (7000v/ph trong 15 phút) Ly tâm thu tủa (ly tâm 4500 v/ph, trong 15 phút) Nghiền và bao gói Chế phẩm gellan 15 phút. Các mẫu gellan khử acyl sẽ được đưa đi phân tích đánh giá mức độ deacyl bằng phương pháp phổ hồng ngoại IR. Trên các phổ hồng ngoại nhận được ở hình 3.9 đều xuất hiện các pic ở vùng 3400 và 1726 cm -1. Trong đó, pic ở khoảng 3400 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức OH - của chuỗi polysaccharide. Và pic xuất hiện ở khoảng 1726 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng của các nhóm chức acyl, cường độ của các pic phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít của các nhóm này. Với các mẫu gellan chuẩn và gellan thu được từ S. paucimobilis GL12, phổ IR của chúng xuất hiện đầy đủ hai pic hấp thụ ở 3400 và 1726 cm-1 với cường độ khá mạnh (hình 3.9a và 3.9b). Với phổ IR của các mẫu gellan khử acyl, cũng xuất hiện pic ở hai băng sóng này, tuy nhiên cường độ pic ở khoảng 1726 cm-1 đều bị giảm và có sự khác nhau theo mỗi điều kiện khử acyl (hình 3.9c và 3.9d). Khi tăng độ kiềm của phản ứng đồng nghĩa với việc tăng mức độ deacyl, do đó khi xử lý ở pH 10 nhận thấy độ lớn của pic ở vùng 1726 cm-1 có giá trị nhỏ hơn so với khi xử lý ở pH 9. A. Phổ IR của gellan (chuẩn) B. Phổ IR của gellan từ S. paucimobilis GL12 C. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện phản ứng pH = 9 trong 8 phút (tư ng ứng độ deacyl 65%) D. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện phản ứng pH = 10 trong 8 phút (tư ng ứng độ deacyl 82%) Hình 3.9. Phổ IR của các gellan 4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 100 79 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 cm-1 % T 3421.13cm-1 1027.02cm-1 1725.63cm-1 1616.93cm-1 1291.52cm-1 1415.02cm-1 2934.45cm-1 607.48cm-1 1229.75 895.57 814.29 4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500 100 79 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 cm-1 % T 1032.28cm-13399.48cm-1 1611.42cm-1 1412.87cm-1 2932.13cm-1 1293.19cm-1 1725.18cm-1 611.64cm-1 1231.53 894.71 812.75 16 Từ kết quả xác định chiều cao các đỉnh phổ thu được và dựa vào công thức tính mức độ deacyl của các mẫu thử nghiệm ở các pH khác nhau được cho ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan pH Mức độ deacyl-ĐĐA (%) Đặc tính gel 8 KXĐ Gel mềm 9 65 Gel mềm, yếu 10 82 Gel chắc, giòn 11 84 Gel chắc, giòn Thực nghiệm cho thấy, khả năng deacyl phụ thuộc nhiều vào pH xử lý. Khi xử lý ở pH 8 (nhiệt độ 80°C, trong 8 phút), mức độ deacyl gần như không đáng kể, sản phẩm thu được từ phản ứng này cho gel có các tính chất gần với gellan (gel mềm, đàn hồi). Khi tăng mức độ kiềm lên đạt pH 9, thu được sản phẩm có độ deacyl ở khoảng 65%, tạo gel nhão, yếu. Xử lý ở pH 10, sản phẩm nhận được có độ deacyl 82%, cho gel chắc, giòn. Khi tăng đến pH 11 mức độ deacyl cải thiện không đáng kể (đạt 84%). Như vậy, việc thay đổi pH có thể nhận được các sản phẩm có độ deacyl khác nhau và với mỗi sản phẩm nhận được có thể sử dụng để tạo gel có tính chất khác nhau từ mềm, đàn hồi tới cứng và giòn. Đặc tính khác nhau của gel nhận được từ các sản phẩm gellan khử acyl có thể được giải thích do sự thay thế nhóm acyl đã làm giảm liên kết hydro nội phân tử, làm giảm cấu trúc xoắn cuộn của gellan dẫn đến khả năng hút ẩm giảm, tăng độ cứng và độ giòn cho gel. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl Nhằm tìm ra thời gian thích hợp cho phản ứng deacyl, tiến hành khảo sát thời gian deacyl ở điều kiện môi trường kiềm có pH 10, ở nhiệt độ 80oC, độ deacyl hóa của sản phẩm được xác định sau các mốc 4, 6, 8, 10 và 12 phút phản ứng (hình 3.10). Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian deacyl hóa cho thấy, tốc độ deacyl xảy ra khá nhanh trong 8 phút và mạnh mẽ nhất ở khoảng 4 phút đầu của phản ứng (độ deacyl đạt 60%). Thời điểm 8 và 10 phút sau phản ứng, tốc độ deacyl xảy ra chậm dần (độ deacyl tăng từ 82% - 86%). Sau 10 phút, độ deacyl của gellan ít bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích do giai đoạn đầu quá trình deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl trên bề mặt của gellan, chúng tiếp xúc trực tiếp với các ion OH- nên tốc độ deacyl xảy ra khá nhanh. Sau đó, phản ứng deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl bên trong khó tiếp xúc hơn, đòi hỏi thời gian khuếch tán lâu hơn của ion OH- vào lớp bên trong. Vì vậy, tốc độ phản ứng deacyl hóa diễn ra chậm dần. Ngoài ra, do gellan có mạch polyme dài, đan xen, cuộn xoắn che lấp các nhóm chức nên rất khó loại bỏ hoàn toàn nhóm acyl. Điều này cũng nhận được tương tự khi tiến hành deacetyl hóa chitin để được sản phẩm chitosan. Theo tác giả Đặng Xuân Dự (2015) sử 17 dụng nồng độ NaOH 50%, đun nóng ở 80°C sau khoảng 3 giờ phản ứng đã thu được chitosan có độ đề acyl khoảng 83%. Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian deacyl đến độ deacyl của gellan Hình 3.11. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều ki1n phản ứng pH = 10 trong 10 phút (tư ng ứng độ deacyl 86%) Từ các kết quả trên, lựa chọn được các điều kiện thích hợp cho thu nhận gellan khử acyl từ dịch nổi chứa gellan của chủng S. paucimobilis GL12 như sau: điều chỉnh dịch tới pH 10, giữ ở 80°C trong 10 phút, hạ nhiệt dịch khử, trung hòa về pH 7 bằng HCl. Phổ IR của sản phẩm ở điều kiện xử lý này được cho trên hình 3.11 tương ứng với mức độ deacetyl 86%. 3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol Ethanol được lựa chọn để kết tủa gellan khử acyl trong dịch lên men. Nhằm thu hồi hiệu suất gellan khử acyl cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men gellan khử acyl/ethanol đến khả năng thu hồi gellan khử acyl. Sau khi kết thúc quá trình khử acyl và trung hòa về pH 7, ethanol 95o được bổ sung vào khối dịch theo các tỷ lệ dịch/ethanol: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3 để kết tủa trong 10 giờ, sau đó đánh giá lượng gellan khử acyl thu được cho mỗi thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan khử acyl tăng dần khi tăng lượng ethanol trong dịch và đạt ổn định khi tỷ lệ dịch kh