Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus Thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)

ƣờng theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt đƣợc mô tả đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Rajesh và cộng sự (2012). Sau khi xác định đƣợc khoảng tác động của từng yếu tố đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein của MSS8.4, nhập dữ liệu vào phần mềm Design expert 10.1. Xử lý số liệu CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis 3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus Để phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ 2 cánh (Diptera), 317 mẫu đất, lá đã đƣợc thu thập tại 7 tỉnh thành từ 7 vùng địa lý của Việt Nam. Các địa điểm này trƣớc đó chƣa từng sử dụng các chế phẩm sinh học. Trong 317 mẫu đất, lá thí nghiệm có 198 mẫu mang vi khuẩn Bacillus và 119 mẫu không phân lập đƣợc B. thuringiensis. Nhƣ vậy tần suất xuất hiện của Bacillus là 62,4%. Những khu vực có tỉ lệ Bacillus cao trong mẫu: Kiên Giang (75,0%), Điện Biên (72,8%) và Hà Nội (72,8%); thấp nhất là Nghệ An (33,3%). Trong số 1.020 khuẩn lạc với các đặc điểm thuộc chi Bacillus, có 440 khuẩn lạc thuộc nhóm B. thuringiensis dựa trên khả năng hình thành tinh thể (chiếm 43%). Tỉ lệ này phụ thuộc vào số mẫu lấy đƣợc ở các tỉnh, cao nhất ở các mẫu đƣợc thu thập ở Hà Nội (54%) và thành phố Hồ Chí Minh (53%), thấp nhất ở mẫu thu thập ở Lâm Đồng (25%), các tỉnh Điện Biên và Kiên Giang cho tỉ lệ tƣơng đƣơng nhau (42% và 44%). Các mẫu đất đƣợc thu thập tại 7 vùng địa lý của Việt Nam có tần suất Bt cao hơn so với những công bố trƣớc đây (Martin và Travers, 1989; Binh và cộng sự, 2005). Tần suất Bt trong nghiên cứu này là 62,4% điều này hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đây của Martin và Travers (1989), trong mẫu đất của New Zealand (Chilcott và Wigley, 1993), trong mẫu đất của Hàn Quốc ( Lee và cộng sự, 1995) và trong mẫu đất của nhật Bản (Ohba và Aizawa, 1986). Sự xuất hiện của Bt hầu nhƣ khắp nơi trong môi trƣờng sống, bao gồm: đất nông nghiệp, đất rừng, đất đô thị, đất ngập mặn, thậm chí cả sa mạc (Dulmage và Aizawa,1982; Martin và Travers, 1989; Zhang và cộng sự, 2000; Uribe và cộng sự, 2003). Trong nghiên cứu này, sự xuất hiện của Bt tập trung chủ yếu ở Hà Nội thuộc đất thành thị và có mật độ dân số cao. Kết quả này cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Quesada-Moraga (Quesada-Moraga và cộng sự, 2004), phù hợp với kết quả của Ayyasamy (2012). Theo Ayyasamy, tỉ lệ Bt ở đất thành thị là 80%, tuy nhiên tần suất xuất hiện cao nhất ở đất nông nghiệp (Ayyasamy và 9 cộng sự, 2012). Nhƣ vậy, so với số liệu công bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện Bt và chỉ số Bt mà đề tài phân lập đƣợc là khá cao. Chứng tỏ số lƣợng vi khuẩn Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý. 3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể 440 chủng B. thuringiensis đã phân lập thuộc 7 vùng địa lý của Việt Nam, đƣợc tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng MPA. Sau 3 ngày quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin để xác định hình dạng tinh thể của các chủng vi khuẩn. Kết quả thu đƣợc cho thấy tất cả các chủng phân lập có khả năng sinh tinh thể ở tất cả các hình dạng. Có những chủng có khả năng sinh từ 1-3 loại tinh thể. Cụ thể, 186/440 chủng sinh tinh thể hình lƣỡng tháp chiếm 42,2%; 193/440 chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 43,8%; 46/440 chủng sinh tinh thể hình lập phƣơng chiếm 10,5%; 15/440 chủng sinh tinh thể hình không xác định chiếm 3,5%. Nghiên cứu về hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập tại tỉnh Thành Đô - Trung Quốc có dạng hình tháp lƣỡng cực và hình cầu, chiếm tới 91,8% (Yu và cộng sự, 2015). Tuy nhiên, phần lớn cấu trúc tinh thể của các chủng Bt thu thập tại bang Tamil Nadu - Ấn Độ có dạng hình lập phƣơng (26,9%) và hình tháp lƣỡng cực (21,2%) (Ramalakshmi và Udayasuriyan, 2010). Kết quả quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt thu thập ở Saudi Arabia kết luận, cấu trúc tinh thể dạng cầu chiếm tỉ lệ lớn (54%), sau đến là dạng không định hình (27%) và tháp lƣỡng cực (16%) (El-kresh và cộng sự, 2014). Sự đa dạng và khác biệt về hình dạng tinh thể của các chủng phân lập đƣợc trong nghiên cứu này cũng nhƣ trong các nghiên cứu khác có thể do sự khác nhau về đặc điểm sinh học của các chủng Bt cũng nhƣ đặc điểm protein Cry của các chủng thu thập đƣợc. Theo các tài liệu công bố trên thế giới, các chủng mang Gen cry2A rất đa dạng chúng có thể sinh ra từ các dƣới loài Bt. serovar kurstaki, Bt. serovar sotto, Bt.serovar israelensis, Bt.serovar kenyae có hình dạng tinh thể chủ yếu là hình cầu và hình lƣỡng tháp. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh ra tinh thể hình cầu và hình lƣỡng tháp đƣợc lựa chọn để nghiên cứu phân loại và sàng lọc gen cry2A bằng phản ứng huyết thanh miễn dịch. Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis b ng kit huyết thanh miễn dịch Thông qua phản ứng ngƣng kết với các typ huyết thanh, xác định đƣợc 32 chủng Bt (chiếm 71%), trong đó có 5 chủng thuộc dƣới loài Bt. serovar. kurstaki, 2 chủng Bt. serovar israelensis (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis b ng phƣơng pháp huyết thanh 10 ST T Dƣới loài Bacillus thuringiensis Typ huyết thanh Số chủng ngƣng kết Tỷ lệ (%) 1 Bacillus thuringiensisserovar israelensis 14 2 6,25 2 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki 3a,3b 5 15,62 3 Bacillus thuringiensisserovar sumiyoshiensis 3d 9 28,13 4 Bacillus thuringiensisserovar coreanensis 25 4 12,5 5 Bacillus thuringiensis serovar neoleonensis 24a, 24b 2 6,25 6 Bacillus thuringiensis serovar aizawai 7 5 15,63 7 Bacillus thuringiensis serovar yunnanensis 20a, 20b 1 3,13 8 Bacillus thuringiensisserovar pakistani 13 3 9,38 9 Bacillus thuringiensis serovar oswaldocruzi 38 1 1,39 Tổng 32 100 Nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2005) cho thấy, gen cry2 xuất hiện ở tất cả các chủng B. thuringiensisserovar kurstaki. Ngoài ra, chủng B. thuringiensisserovar israelensis cũng đƣợc tìm thấy phổ biến ở các môi trƣờng sống của muỗi (Martinez và Caballero, 2002). Do đó, các chủng thuộc nhóm này sẽ đƣợc đề tài lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3.Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập Để thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) của các chủng Bt thuộc dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar israelensis pha loãng nồng độ bào tử đến mức 109 bào tử/ml và thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà tuổi hai, ấu trùng muỗi và ấu trùng ruồi đục quả. Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng Bt sau 3 và 5 ngày thử nghiệm Tên chủng Bacillus thuringiensis Thử nghiệm với ấu trùng muỗi Thử nghiệm với ấu trùng ruồi nhà Thử nghiệm với ấu trùng ruồi đục quả Tỉ lệ chết sau 3 ngày Tỉ lệ chết sau 5 ngày Tỉ lệ chết sau 3 ngày Tỉ lệ chết sau 5 ngày Tỉ lệ chết sau 5 ngày Tỉ lệ chết sau 7 ngày 11 (%) (%) (%) (%) (%) (%) LD 2.21 66,67 90,33 83,33 100 - - LNT 7.12 66,67 96,67 83,33 100 16,67 33,33 LNT 16.6 73,33 83,33 86,67 100 13,33 16,67 MSS 1.1 50 100 66,67 83,33 3,33 10 MSS 4.2 46,67 78,67 60 76,67 0 10 MSS 6.3 63,33 98,33 80 100 13,33 20 MSS 8.4 80 100 93,33 100 20 33,33 4D4 6,67 30 16,67 30 0 0 - - Kết quả thử ấu trùng cho ta thấy, các chủng B. thuringiensis đƣợc tuyển chọn có khả năng diệt ấu trùng khá cao. T lệ ấu trùng chết tăng dần theo thời gian thí nghiệm. nồng độ 109 bào tử/ml các chủng đƣợc lựa chọn có t lệ ấu trùng chết đạt 76,67 - 100 % sau 5 ngày. Tuy nhiên, khả năng diệt ấu trùng ruồi đục quả là tƣơng đối thấp, chỉ đạt 0 – 33,33% sau 7 ngày thử nghiệm. - 3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập 3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh b ng phƣơng pháp PCR Kết quả phát hiện gen cry2A bằng phƣơng pháp PCR cho thấy, 7 chủng thuộc 2 dƣới loài B. thuringiensis serovar kurstaki và B. thuringiensis serovar israelensis đều cho sản phẩm PCR có 1 băng với kích thƣớc khoảng 1,9 kb. 3.2.2. Tách d ng và đọc trình tự gen cry2A Gen cry2A từ hai chủng có hoạt tính diệt ruồi cao nhất đƣợc khuếch đại và gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bào E. Coli DH5α. Sau 14 - 16 giờ cấy trải lên môi trƣờng chọn lọc LB, Ampicilin 50 g/ml, ở 37oC, tiến hành sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Từ 4 dòng tế bào mang gen của mỗi chủng sàng lọc bằng cặp mồi đặc hiệu, đều thu đƣợc đoạn kích thƣớc đúng nhƣ tính toán (khoảng 1,9 kb). Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid của 3 dòng tế bào cũng cho 1 băng có kích thƣớc 3,9 kb và 1 băng có kích thƣớc 1,9 kb, đúng nhƣ kích thƣớc tính toán. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,9 kb đã đƣợc tách dòng thành công. DNA plasmid của các dòng đƣợc gửi đi đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự tự động (Macrogen, Hàn Quốc) sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Trình tự nucleotide sau khi đọc trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit ver 7.0.9. Các trình tự DNA này sau đó đƣợc so sánh và xác định mối quan hệ với các trình tự gen cry2A khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế. Kết quả xây dựng cây phả hệ cho thấy trình tự thu đƣợc mã hoá cho gene 12 thuộc nhóm cry2A, phân nhóm cry2Aa. Nhóm độc tố cry2Aa và cry4 đã đƣợc chứng minh có khả năng gây độc lên côn trùng thuộc bộ 2 cánh (Bravo, 1997). Trình tự DNA của của các gen cry2Aa này đƣợc căn đa chuỗi so sánh với các trình tự gen thuộc phân nhóm cry2Aa trên Ngân hàng Gen Quốc tế. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 có chiều dài 1902 bp và có độ tƣơng đồng là 99% với trình tự tƣơng ứng đã công bố trƣớc đây trên ngân hàng genvới 6 điểm sai khác: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G), 1303 (G-A), 1575 (C-T), chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng công bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên Genbank với mã số là KM588296.1. So sánh trình tự amino axit (aa) suy diễn của 2 gen trên bằng công cụ so sánh BLAST trên NCBI cho thấy,trình tự axit amin của chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng hoàn toàn với chủng công bố, chủng MSS8.4 có độ tƣơng đồng 99% với các trình tự axit amin của Cry2A từ Bt với 5 vị trí sai khác (102 (S-N), 167 (R-Q), 261 (F-L), 352 (W-G), 435 (D-N)), đột biến nu ở vị trí 1575 (C-T) không làm thay thế axit amin. Điều này chứng tỏ rằng 2 gen cry đƣợc nhân dòng từ 2 chủng vi khuẩn MSS8.4 và LNT7.12 đều là gen mã hóa cho độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa. Cấu trúc của độc tố Cry2A từ chủng MSS8.4 đƣợc so sánh với những trình tự của Cry2Aa từ những chủng B. thuringiensis đã biết trƣớc đó cho thấy, có độ tƣơng đồng cao (99%) so với Cry2Aa từ chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki (Pdb_id 1: 1I5P_A) đƣợc Morse và cộng sự xác định bằng sự nhiễu xạ tia X (Morse, 2001). Cry2Aa từ MSS8.4 đƣợc chia làm 3 vùng cấu trúc: Endotoxin đầu N gồm 210 a.a (Val-53 đến Lys-263); tiếp theo là Endotoxin vùng giữa gồm 205 a.a (Leu-267 đến Asn-472); cuối cùng là vùng Endotoxin đầu C gồm 224 a.a (Từ Phe-494 đến Asn-628). Kết quả này một lần nữa khẳng định gen tách dòng là gen mã hóa cho protein độc tố Cry2A, phân nhóm Cry2Aa. 3.2.3. Biểu hiện gen 3.2.3.1. Tạo chủng tái tổ hợp mang gen cry2A trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) Để khẳng định xem khả năng diệt côn trùng có phải đƣợc quy định bởi gen cry2A hay không, gen cry2A từ chủng MSS8.4 tiếp tục đƣợc sử dụng để biểu hiện ra protein độc tố Cry2A và kiểm tra khả năng diệt côn trùng của protein tái tổ hợp. 5 khuẩn lạc ngẫu nhiên đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả cho thấy 4 dòng xuất hiện băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt mở vòng với 2 enzym BamHI và XhoI cũng thể hiện đã tạo thành công chủng E. coli tái tổ hợp mang gen cry2A. 13 3.2.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong E. coli BL21 Biểu hiện sơ bộ gen cry2A Kết quả điện di protein tổng số trên gel SDS-PAGE cho thấy, dòng tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện pET-22b(+)-cry2A khi đƣợc cảm ứng cho phép tạo một vạch protein đậm có kích thƣớc khoảng 70 kDa, hoàn toàn trùng khớp với tính toán lý thuyết về kích thƣớc của protein Cry2A ở dạng dung hợp. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng quá trình biểu hiện gen cry2A đã thành công. Kiểm tra Cry2A tái tổ hợp b ng Western blot Kết quả hình 3.17 cho thấy, protein dung hợp đƣợc thể hiện qua 1 băng với kích thƣớc đúng nhƣ tính toán (khoảng 70 kDa). Điều này có thể khẳng định, protein Cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong hệ vector pET22b(+). Hình 3.17. Phân tích sự biểu hiện của protein Cry2A b ng kỹ thuật Western blot.M: Thang chuẩn protein (Biobasic); 1: Đối chứng dƣơng (Sigma); 2-4: Mẫu sau cảm ứng thu ở 1h, 2h, 5h; 5: Mẫu không mang gen. Để có thể tạo ra sản phẩm Cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh, sản phẩm protein cần đƣợc tiếp tục xử lý và kiểm tra diệt côn trùng trên côn trùng thử nghiệm. Bảng 3.3. Thử hoạt tính sinh học của rCry2A và protein tinh thể từ B. thuringiensis với ấu trùng M. domestica Côn trùng Protein LC50 (g) Giới hạn LC50 tin cậy Thấp nhất Cao nhất M. domestica 4D4 442,5 11,3 56,5 MSS8.4 283,5 17,6 100 rCry2A 264,7 28,3 66,1 MSS8.4+rCry2A 268,6 27,8 59,3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ghi nhận sau 72 giờ cho thấy, protein tái tổ hợp có hoạt tính cao với côn trùng thử nghiệm (LC50 = 264,7 g). Đồng thời hoạt tính của protein Cry2A tự nhiên của chủng MSS8.4 (LC50 = 283,5 µg) cũng cao hơn của chủng chuẩn 4D4 (LC50 = 442,5 g). Sự sai khác về khả năng diệt côn trùng có thể ở chủng MSS8.4 ngoài khả năng hình thành độc tố Cry2A còn có sự xuất hiện của độc tố Cry1A. 3.2.4. Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu hiện gen 14 3.2.4.1. Nghiên cứu tối ưu nhiệt độ biểu hiện gen cry2A Tế bào E. coli BL21 đƣợc cấy lắc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là: 28, 30, 37, 40 oC. Sau 4 giờ nuôi cấy, thu tế bào, điện di kiểm tra trên gel 12,6 % polyacrylamide. Kết quả cho thấy, ở nhiệt độ 37oC, tế bào biểu hiện cho băng protein đậm nhất. Do đó lựa nhiệt độ 37oC cho sự biểu hiện của rCry2A. 3.2.4.2. Nghiên cứu tối ưu nồng độ chất cảm ứng biểu hiện gen cry2A Lựa chọn nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng IPTG lần lƣợt ở 0,1; 0,2; 0,5; 1; 1,5 mM. Kết quả biểu hiện cho thấy sự tổng hợp protein Cry2A tối ƣu nhất khi đƣợc cảm ứng ở 1mM. 3.2.4.3. Nghiên cứu tối ưu thời gian biểu hiện gen cry2A Cố định nhiệt độ cảm ứng là 37oC, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM và khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp theo thời gian (1, 2, 3, 4, 5 giờ). Mẫu đƣợc xử lý và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6%. Kết quả, lƣợng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian, cao nhất tại thời điểm 4 và 5 giờ. Do đó, lựa chọn thời điểm 4 giờ để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lƣợng sản phẩm và chi phí lên men. 3.2.5. Tinh chế protein tái tổ hợp b ng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin Chủng tái tổ hợp đƣợc biểu hiện ở 37 oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1 mM, thu sau 4 giờ. Sau đấy sinh khối tế bào đƣợc thu lại bằng ly tâm, xử lý và tinh sạch . Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy protein Cry2A tái tổ hợp đã đƣợc thu lại ở dạng tinh sạch, có kích thƣớc 70 kDa tƣơng đƣơng với kích thƣớc tính toán lý thuyết. 3.2.6. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8.4 Bảng 3.4. Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể từ chủng MSS8.4 và protein tái tổ hợp rCry2A Côn trùng thử nghiệm Protein LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy Thấp nhất Cao nhất M. domestica 4D4 442.5 11.3 56.5 MSS8.4 283.5 17.6 100 rCry2A 264.7 28.3 66.1 A. minimus 4D4 9.42 53.33 70 MSS8.4 7.34 56.67 83.33 rCry2A 7.03 70 93.33 A. aedes 4D4 19.05 6.67 63.33 MSS8.4 14.52 56.67 73.33 rCry2A 13.33 63.33 80 Cx. quinquefasciatus 4D4 19.05 36.67 46.67 15 Côn trùng thử nghiệm Protein LC50 (g)* Giới hạn LC50tin cậy Thấp nhất Cao nhất MSS8.4 17.6 70 90 rCry2A 14.52 56.67 86.67 Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể đƣợc xác định dựa trên khả năng diệt ấu trùng của ấu trùng thử nghiệm bộ hai cánh gồm: M. domestica, A. minimus, A. aedes, Cx. quinquefasciatus. Thử nghiệm ở các nồng độ thay đổi từ 0,5 – 500 g/g, kết quả đƣợc xác định và phân tích bởi chƣơng trình Probit analysis. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ghi nhận tại Bảng 3.4. Nhƣ vậy, protein tái tổ hợp Cry2A đã đƣợc biểu hiện thành công trong E. coli và protein tái tổ hợp có hoạt tính diệt ấu trùng bộ Hai cánh cao hơn protein tự nhiên, cũng nhƣ chủng chuẩn. Kết quả này cao hơn rất nhiều so với nghiên cứu của Misra và cộng sự, các phân đoạn protein Cry2Aa4 sau tinh sạch bằng sắc ký ái lực có LC50 trong khoảng 100-500 mg (Misra và cộng sự, 2002); Yilmaz và cộng sự (2017), tác giả chỉ ra rằng, Cry2Aa18 đƣợc biểu hiện có nguồn gốc từ cry2A của chủng B. thuringiensis SY49-1 có khả năng diệt ấu trùng C. pipiens (LC50= 630 g/ml). So với kết quả nghiên cứu của Reyaz và Arulsel (2016), protein tái tổ hợp sau tinh sạch Cry2AI1 có hoạt tính đối với Spodoptera litura và Helicoverpa armigera (LC50= 2,448 µg/ml) và Helicoverpa armigera (LC50= 3,374μg/ml) thì hoạt tính của protein rCry2A thấp hơn khá nhiều. 3.3. Lựa chọn môi trƣờng và tối ƣu lên men làm tăng khả năng hình thành protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia 3.3.1. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 3.3.1.1. Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý bã bia làm nguyên liệu lên men vi khuẩn MSS8.4 Khi sử dụng làm nguyên liệu lên men vi khuẩn MSS8.4, bã bia đƣợc nghiền nhỏ và đƣa về nồng độ chất rắn 2%. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác ở 30oC, thời gian 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút, kết quả phân tích đƣợc trình bày ở bảng 3.5. Kết quả phân tíchcho thấy, sử dụng dịch thủy phân bằng phƣơng pháp axit cho mật độ TCC, SC và protein tinh thể cao nhất, mật độ tế bào đếm đƣợc đạt 4,9x108 CFU/ml; trong khi đó, thí nghiệm sử dụng bã bia vô trùng (TN3), TCC chỉ đạt 107 CFU/ml. Nhƣ vậy, tiền xử lý bã bia bằng phƣơng pháp axít nhiệt và kiềm nhiệt đã làm tăng hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng giúp vi khuẩn MSS8.4 sinh trƣởng tốt hơn.Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhận định của Brar và các cộng sự, khi thủy phân các hợp chất hữu cơ ở nhiệt độ cao sẽ làm tăng giá trị dinh dƣỡng trong môi trƣờng. Do đó, mật độ tế bào, bào tử của vi khuẩn MSS8.4trên môi trƣờng bã bia thủy phân bằng 16 phƣơng pháp axit nhiệt cao hơn so với trên các môi trƣờng khác (Brar và cộng sự, 2005). Khả năng sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4 cũng có sự khác biệt rõ rệt ở các thí nghiệm khác nhau. thí nghiệm sử dụng bã bia vô trùng, sau 48 giờ lên men vi khuẩn MSS8.4, nồng độ delta-endotoxin đạt 319 mg/l. Trong khi đó, thí nghiệm sử dụng bã bia tiền xử lý bằng phƣơng pháp axít nhiệt nồng độ delta-endotoxin đạt 428 mg/l, cao gấp 1,3 lần so với thí nghiệm sử dụng bã bia vô trùng. Do đó, phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc lựa chọn là phƣơng pháp tiền xử lý bã bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4. 3.3.1.2. Phân tích thành phần của dịch thủy phân bã bia bằng phương pháp axit nhiệt Để đánh giá hàm lƣợng các chất có trong dịch thủy phân bã bia, dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt đƣợc gửi đi phân tích tại Phòng Phân tích chất lƣợng môi trƣờng - Viện Công nghệ môi trƣờng. Kết quả phân tích cho thấy, trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt hàm lƣợng C, N (hai nguồn cơ chất quan trọng nhất trong sinh trƣởng của vi khuẩn) cao hơn hẳn so với dịch bã bia thủy phân bằng phƣơng pháp kiềm nhiệt hoặc chỉ vô trùng.Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhận định ở trên, khi cho rằng tác nhân axit ở điều kiện nhiệt độ cao đã giúp tăng khả năng phân hủy các hợp chất cao phân tử, làm tăng hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ dễ hấp thu trong dịch thủy phân. Các nguyên tố khoáng là nhân tố không thể thiếu trong quá trình sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn nói chung và các chủng thuộc gen Bt nói riêng. Trong đó, các ion kim loại nhƣ Mg, Mn, Fe, Zn, Ca, v.v... có tác dụng điều tiết quan trọng đến sinh trƣởng, hình thành bào tử cũng nhƣ sinh tổng hợp protein tinh thể diệt côn trùng. Do vậy, trong môi trƣờng tổng hợp lên men vi khuẩn thƣờng đƣợc bổ sung thêm một số muối khoáng với nồng độ nhƣ sau: 0,3% MgSO4.7H2O; 0,02%o MnSO4.7H2O; 0,02%o FeSO4.7H2O; 0,2%o ZnSO4.7H2O và 1,0%o CaCO3(Ngô Đình Bính, 2000). Xét theo nhu cầu khoáng này của vi khuẩn Bt thì không có nguyên tố nào ở cả ba thí nghiệp đáp ứng đủ nhu cầu khoáng. Do vậy, phải bổ sung thêm khoáng vào dịch thủy phân bã bia để cải thiện chất lƣợng môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Ozkan và các cộng sự: ở nồng độ 10-6M, Mn là yếu tố chủ chốt tác động đến sự sinh tổng hợp độc tính của vi khuẩn Bt mà không ảnh hƣởng tới quá trình khác của tế bào. Trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt, Mn có nồng độ 0,136 mg/l (2,7x10-6M/l) là nồng độ nằm trong khoảng nông độ phù hợp cho lên men vi khuẩn Bt thu độc tố delta endotoxin(Ozkan và cộng sự, 2003). Theo nghiên cứu của Içgen và các cộng sự, sự sinh trƣởng, hình thành bào tử và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Btk không chỉ phụ thuộc vào 17 các yếu tố dinh dƣỡng cacbon, nito mà còn chịu tác động rất lớn từ các nhân tố khoáng. Cụ thể, khi bổ sung Mg ở nồng độ từ 8x10-5M đến 4x10-3M mật độ tế bào và nồng độ protein tinh thể tăng mạnh (Içgen và cộng sự, 2002). Theo kết quả phân tích, nồng độ của Mg trong dịch thủy phân bã bia bằng phƣơng pháp axit nhiệt là 12 mg/l (2,9x10-3M), đây là nồng độ Mg nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển và sinh độc tố của vi khuẩn Bt theo nhƣ nghiên cứu của Içgen. 3.3.1.3.Xác định nồng độ bã bia phù hợp làm môi trường lên men vi khuẩn MSS8.4 Các thí nghiệm lên men vi khuẩn MSS8.4 sử dụng bã bia đƣợc thực hiện ở các nồng độ nhƣ sau: 1%TS; 1,5%TS; 2%TS; 2,5%TS; 3%TS; 3,5%TS. Các kết quả nghiên cứu cho thấy: t lệ % chất khô của bã bia nằm trong khoảng từ 2 – 3là phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Bt. nồng độ thấp (1%TS) mật độ vi khuẩn trong mẫu sau 48 giờ lên men chỉ đạt 2,9x107CFU/ml, trong khi đó ở nồng độ 2,0 – 3,0%TS mật độ tế bào sau 48 giờ lên men đạt trên 10 8CFU/ml. Trong thí nghiệm 6 khi tăng nồng độ bã bia lên 3,5%, mật độ tế bào thu đƣợc sau 48 giờ lên men không cao chỉ đạt 107CFU/ml. Protein tinh thể đƣợc sinh ra đồng thời với quá trình hình thành bào tử và là sản phẩm mong muốn trong quá trình lên men vi khuẩn MSS8.4. Do vậy, đây là một chỉ tiêu quyết định đến chất lƣợng sản phẩm. Kết quả thí nghiệm trong bảng 3.6 cho thấy ở nồng độ bã bia 2,5% nồng độ protein tinh thể đạt đƣợc là cao nhất. Nhƣ vậy, xét về mặt tổng thể nồng độ 2,5%TS là phù hợp nhất cho lên men MSS8.4 thu độc tố diệt ấu trùng ruồi. Nồng độ 2,5%TS sẽ đƣợc sử dụng cho tất cả các nghiên cứu về sau. 3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4. 3.3.2.1. Xác định nguồn dinh dưỡng bổ sung vào môi trường bã bia Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong bình tam giác, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Xác định mật độ tế bào, bào tử và nồng độ protein tinh thể sau 48 giờ lên men. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ bổ sung vào dịch thủy phân bã bia cho thấy cám gạo và bột đậu tƣơng là hai yếu tố có tác động tích cực đến sinh trƣởng cũng nhƣ sự tạo thành tinh thể độc của chủng vi khuẩn MSS8.4. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoài Trâm và các cộng sự thì bột đậu tƣơng là nguồn dinh dƣỡng tốt nhất cho sinh trƣởng của vi khuẩn Bt sinh độc tố diệt sâu (Nguyễn Hoài Trâm, 2004). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả công bố của Nguyễn Thị Hòa và các cộng sự thì khi bổ sung cám gạo và bột đậu tƣơng vào dịch thủy phân bùn thải sinh học làm môi trƣờng lên men vi khuẩn Btk thu độc tố diệt trừ sâu (Hoa và cộng sự, 2014). Trong hai nguồn dinh 18 dƣỡng cám gạo và bột đậu tƣơng thì bột đậu tƣơng có khả năng tan tốt hơn, do vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn dinh dƣỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia. Khi xem xét hàm lƣợng protein tinh thể trong dịch lên men MSS8.4 sau 48 giờ nuôi cấy cho thấy: có một sự khác biệt rõ rệt khi bổ sung thêm muối MgSO4.7H2O và MnSO4 vào dịch thủy phân bã bia. hai thí nghiệm có bổ sung 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 0,05 g/l MnSO4 hàm lƣợng protein tinh thể thu đƣợc sau 48 giờ lên men tăng khoảng 10% so với thí nghiệm đối chứng là dịch thủy phân bã bia, hàm lƣợng deta endotoxin lần lƣợt đạt 469 mg/lít và 461 mg/lít. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Braun năm 2000, Icgen và các cộng sự khi nghiên cứu về vai trò của Mg2+ trong sinh trƣởng và sinh tổng hợp pro