Tóm tắt Luận án Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ nhạy cao sử dụng điện cực in Các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm

trở kháng phức thực nghiệm được mô phỏng bằng mô hình mạch tương đương Randles. 2.1.2 Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) Nguyên lý cơ bản của phương pháp CV là áp đặt một điện thế biến đổi tuần hoàn lên điện cực làm việc và ghi lại dòng tuân theo định luật Nernst. Phương pháp này cho phép điều khiển quá trình phản ứng điện hóa thông qua các thông số điện áp, tốc độ quét thế. Trong nội dung luận án, tác giả sử dụng phương pháp CV để tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE, tổng hợp vật liệu polyme, khử điện hóa graphene oxít trên điện cực SPCE. Ngoài ra, phương pháp CV còn giúp cho việc phân tính tính chất lớp vật liệu polyme biến tính trên bề mặt điện cực và đánh giá tương tác kháng nguyên – kháng thể thông qua việc xác định các thông số đặc trưng Epa, Epc, Ipa, Ipc. 2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu 2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm 2.3.1 Giới thiệu 2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm Chíp vi lưu ly tâm kiểu cấu trúc van xi phông bằng phương pháp khuôn đúc sử dụng vật liệu polydimethylsiloxane (PDMS) ứng dụng kết hợp với điện cực thương mại của hãng DropSens mã DRP-110 và DRP-AUTR10. Việc thu nhỏ kích thước buồng phản ứng sẽ giảm đáng kể lượng dung dịch hóa chất và thể tích mẫu phân tích tiêu hao giảm từ 100 µL (trong phương pháp nhỏ giọt trực tiếp trên bề mặt điện cực) xuống còn 5 µL. 6 Hình 2.8. Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay của máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi lưu và điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực được cố định đồng thời trên giá đỡ. 2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến 2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE Tiến hành tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE bằng phương pháp quét thế tuần hoàn. Tiến hành nhỏ 35 µL dung dịch HAuCl4 100 µM pha trong dung dịch đệm PBS 100 mM lên trên bề mặt SPCE sao cho bao phủ cả 3 điện cực (bao gồm cả Ag/AgCl, điện cực đối và điện cực làm việc). Tiến hành quét thế tuần hoàn từ -0,6 V ÷ +0,5 V vs. Ag/AgCl, tốc độ quét 50 mV/s và bước nhảy 10 mV. 2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol - Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (MHDA): Axít 16-mercaptohexadecanoic (MHDA) là axít hữu cơ chuỗi mạch dài gồm 16 nguyên tử các bon, có một đầu là nhóm cacboxyl (-COOH) và đầu còn lại là nhóm thiol (-SH). Ngâm toàn bộ phần điện cực làm việc của cảm biến trong 100 µL dung dịch MHDA nồng độ 1 mM phân tán trong dung môi ethanol và giữa tại nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau bước này trên bề mặt điện cực hình thành màng SAM có nhóm chức cacboxyl hướng lên trên bề mặt. - Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM (p-ATP): Phân tử p-ATP có cấu trúc mạch vòng benzen có gắn nhóm chức thiol (-SH) và nhóm chức amin (-NH2) tại vị trí para. Điện cực làm việc của cảm biến được ngâm trong 100 µL dung dịch của p-ATP nồng độ 25 mM phân tán trong dung môi ethanol và được ủ tại nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 6 đến 24 giờ. Như vậy, sau bước này bề mặt điện cực cảm biến hình thành màng SAM có nhóm amin hướng lên trên bề mặt. 2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa 2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa 2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy- PPa và erGO 2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng 2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị Tấm cốđịnh Chip vi lưu Điện cực Giá đỡ 7 2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm amin của đầu thu sinh học Hình 2.11. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm amin (NH2) của đầu thu sinh học và nhóm cacboxyl (-COOH) trên bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS và EDC [219]. 2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học Hình 2.12. Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm cacboxyl (-COOH) của kháng thể và nhóm amin (NH2) trên bề mặt điện cực sử dụng EDC [219]. 2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa Bước 1. Chuẩn bị mẫu chỉ dấu sinh học cần phân tích Bước 2. Phản ứng đặc hiệu giữa đầu thu sinh học và chỉ dấu sinh học phân tích Bước 3. Khảo sát phổ tổng trở điện hóa Vật liệu biến tính điện cực SPCE Mô hình Mạch điện tương đương Phẩn tử trong mạch điện Màng đơn lớp tự lắp ghép SAM C và Warburg ( ) W 1/ 2 1 , , , 1 Z .W   = = dl s ct C dl R R Z j C j Vật liệu polyme CPE và Warburg ( ) W 1/ 2 1 , , , ( ) . 1 Z .W   = = s ct CPE n R R Z j Q j 2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm ZW Rs Cdl Rct ZW Rs Rct CPE 8 CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH 3.1 Mở đầu 3.2 Thực nghiệm Hình 3.1. (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ tạo dao động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động của QCM ở chế độ đo động. Hình 3.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực in vàng SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12. 3.2.3 Quy trình cố định mAb α-hCG trên điện cực vàng (EDC) R1-N=C=N-R2 (NHS) (Kháng thể) -NH2 (Ethanolamine) Cố định kháng thể S O OH SPAuE NH NH NH O OH S O OH S O OH S O OH S S O O SPAuE O O S O O S O O S O O S OO N OO N OO N OO N OO N S O SPAuE O O S O S O O S S O Loại bỏ các liên kết không đặc hiệu NH NH NH S O SPAuE O S O S O S S O OO N OO N NH NH Hình 3.3. Quy trình công nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng SAM. 3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/QCM Cảm biến dựa trên linh kiện QCM được khảo sát ở chế độ đo trong pha lỏng động, độ dòng chảy của dung dịch là 3 mL/giờ, độ pH của dung dịch đo là 7,4 [102]. Sự suy giảm tín hiệu tần số cộng hưởng của linh kiện QCM được ghi nhận ngay trong quá trình bơm dung dịch. Thời gian cho mỗi phép phân tích khảo sát tương tác kháng nguyên-kháng thể là 80 phút. (a) (b) (a) (b) (c) 9 3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE Cảm biến được tiến hành đo phổ trở kháng phức trong dung dịch gồm có 0,1 M KCl và 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- trong dải tần số từ 100 kHz đến 50 mHz tại thế một chiều 0,16V và thế xoay chiều 10 mV. Sử dụng phần mềm khớp (fit) phổ tổng trở với mô hình mạch tương đương Randles và xác định giá trị của phần tử trong mạch. Xây dựng đồ thị phụ thuộc của giá trị Rct vào nồng độ kháng nguyên α-hCG. Khi phản ứng miễn dịch xảy ra giữa kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt điện cực sẽ hình thành khối điện môi cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực, Rct tăng theo lượng kháng nguyên bắt cặp với kháng thể. 3.3 Kết quả và thảo luận 3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb α- hCG/SAM(MHDA)/QCM 3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể Hiệu suất cố định kháng thể đánh giá theo công thức (Nkháng thể/NNHS) x 100%; kết quả thu được là 2,88% cao hơn so với nghiên cứu của Wang chỉ là 0,14% [299]. Như vậy có thể thấy quy trình cố định kháng thể chúng tôi nghiên cứu là hoàn toàn phù hợp. 3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến Khảo sát thống kê với 03 cảm biến độc lập với cùng quy trình chế tạo, tần số suy giảm mạnh trong khoảng nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL đến 7,0 0 10 20 30 40 50 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 mAb hCG/NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM NHS-EDC/SAM (MHDA)/QCM SAM (MHDA)/QCM § é d Þc h t Ç n s è  f (H z) Thêi gian (phót) Linh kiÖn QCM Hình 3.6 Độ dịch tần sau mỗi bước chế tạo của cảm biến nhạy khối lượng sử dụng QCM 5 MHz. 0 5 10 15 20 25 30 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 § é d Þc h t Ç n s è  f (H z ) Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG (ng/mL) Hình 3.8 Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến nhạy khối lượng. Hình 3.5. Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa. ∆RCT -Zim (Ω) Zre(Ω) W RS RCT ZW Cdl RS [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- 10 ng/mL và suy giảm không đáng kể khi nồng độ kháng nguyên tăng trong khoảng từ 12 đến 27 ng/mL. 3.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb α-hCG/SAM(MHDA) /SPAuE Khảo sát với 5 mẫu trắng và 3 mẫu cảm biến độc lập ứng với mỗi điểm nồng độ. Kết quả cho thấy Rct thay đổi tuyến tính trong khoảng nồng độ kháng nguyên từ 4 đến 100 ng/mL, giới hạn phát hiện của cảm biến là 9,35 ng/mL với diện tích điện cực làm việc là 3,67 mm2. 3.4 Kết luận Tối ưu qui trình công nghệ cố định màng kháng thể bằng màng SAM dựa trên linh kiện QCM. Cảm biến nhạy khối lượng hoạt động tốt trong dải nồng độ thấp và sai số nhỏ hơn 5%. Cảm biến miễn dịch điện hóa không đánh dấu sử dụng điện cực mực in vàng (SPAuE) có giá thành rẻ hơn nhiều so với QCM, yêu cầu một lượng nhỏ dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay là cơ sở cho việc chế tạo cảm biến sinh học sử dụng một lần. Kết quả cho thấy cảm biến mAb hCG/MHDA/SPAuE đáp ứng yêu cầu đối với xét nghiệm đối với các bệnh liên quan đến chỉ dấu α-hCG. CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN 4.1 Mở đầu 4.2 Thực nghiệm Hình 3.10. Phổ trở kháng phức đáp ứng của cảm biến với kháng nguyên α-hCG có nồng độ 0÷100 ng/mL 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30 20 ng/mL 30 ng/mL 70 ng/mL 100 ng/mL -Z " ( k  ) Z' (k) 0 100 pg/mL 4 ng/mL 10 ng/mL Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG ZW Rs Cdl Rct Mạch tương đương Randles 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 R ct ( k  ) Nång ®é kh¸ng nguyªn -hCG (ng/mL) R ct (k) = 16,65 + 0,22*C (ng/mL) LOD = 9,35 ng/ml Hình 3.11. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA) /SPAuE. 11 Hình 4.2. (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in các bon, (b) Điện cực mực in các bon SPCE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa Vertex Invium. 4.3 Kết quả và thảo luận 4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa Do DNA aptamer có kích thước nhỏ hơn kháng thể và mang điện tích âm nên tín hiệu của cảm biến có thể được giải thích liên quan đến hai cơ chế xảy ra đồng thời. Đối với cảm biến aptamer sự tăng hay giảm của giá trị Rct phụ thuộc vào cơ chế nào chiếm ưu thế hơn. Kháng nguyên PSA; Aptamer; Ethanolamine; S COOH SAM Axit 16-Mercaptohexadecanoic PSA S S S S S S S S S OH OH OH S OH S S S S S OH OH OH S OH S S S S S S SPAuE SPAuE [Fe(CN)6] 3-/4- [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- [Fe(CN)6] 3-/4- PSA (a) (b) S S SS S S [Fe(CN)6] 3-/4-[Fe(CN)6] 3-/4- S SS [Fe(CN)6] 3-/4- S SS [Fe(CN)6] 3-/4- e- [Fe(CN)6] 3-/4- SPCE PSA S S S [Fe(CN)6] 3-/4- S O HS OH S S AuNP S S S S O H S S O H S [Fe(CN)6] 3-/4- AuNP [Fe(CN)6] 3-/4- e- S S S [Fe(CN)6] 3-/4- AuNP S O HS OH S S S S S AuNP S O H S S O H S [Fe(CN)6] 3-/4- AuNP SPCE [Fe(CN)6] 3-/4- e- Hình 4.5. Mô hình quá trình động học xảy ra trên bề mặt điện cực trong phép đo trở kháng phức Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6]3-/4-: (a) trên điện cực SPAuE, (b) trên điện cực AuNPs-SPCE. Cơ chế về hàng rào tĩnh điện: Aptamer là chuỗi oligonucleotide có các liên kết thiếu phosphate mang điện tích âm [77]. Aptamer được cố định trên bề mặt điện cực sẽ hình thành hàng rào điện thế âm cản trở điện tử truyền đến bề mặt điện cực. Nếu kháng nguyên mang điện tích dương khi tương tác với aptamer sẽ làm giảm hàng rào tĩnh điện giúp cho sự chuyển điện tử đến điện cực dễ dàng và điện trở Rct giảm [176]. Cơ chế về hiệu ứng không gian: Khi kháng nguyên liên kết đặc hiệu với aptamer sẽ tạo thành khối điện môi trên bề mặt điện cực, tạo thành vùng không (a) (b) (c) 12 gian cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực dẫn tới Rct tăng [56, 88]. 4.3.2 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE 4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ 8 10 12 14 16 18 20 22 0 2 4 6 8 10 (d) (c) (b) -Z '' (k  ) Z'(k) PSA-Aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE §iÖn cùc SPAuE SAM (MHDA)/SPAuE Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/SPAuE PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE (a) 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 (e)(d) (c) (a) -Z '' (k  ) PSA/aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE Z'(k) §iÖn cùc SPCE AuNPs-SPCE SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE Aptamer (5 g/mL)/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE PSA (10 ng/mL)/Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE (b) Hình 4.6. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE. Hình 4.11. Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo của cảm biến PSA- aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE. Kết quả phép đo phổ tổng trở đã cho thấy aptamer được cố định thành công trên bề mặt điện cực thông qua màng SAM của MHDA cũng như đã xảy ra tương tác đặc hiệu giữa aptamer và kháng nguyên PSA trên bề mặt điện cực cảm biến. Với điện cực AuNPs-SPCE, hiệu suất cố định aptamer là 56% trong khi điện cực SPAuE là 72%. Tuy nhiên, độ nhạy của cảm biến cảm biến sử dụng AuNPs-SPCE đạt 73% trong khi giá trị này chỉ đạt 18% đối với cảm biến sử dụng điện cực planar SPAuE. Việc sử dụng điện cực AuNPs-SPCE giúp phân tán aptamer và tăng hiệu suất bắt cặp giữa aptamer và kháng nguyên PSA. 4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến trên điện cực SPAuE Trên điện cực SPAuE xác suất cố định aptamer trên điện cực vàng lớn nên hiệu ứng màn chắn tĩnh điện sẽ chiếm ưu thế. Tín hiệu cảm biến thăng giáng và không theo quy luận nhất định. Đường chuẩn của cảm biến không đáp ứng được yêu cầu tuyến tính trong dải nồng độ thuộc “vùng xám” trong xét nghiệm chẩn đoán UTTLT. 13 Hình 4.7. Khảo sát sự phụ thuộc của ∆Rct như một hàm của nồng độ PSA của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100 µg/mL. 4.3.3 Cảm biến PSA-Aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE 4.3.3.1 Phân tán aptamer Hình 4.8. Ảnh SEM bề mặt điện cực SPCE sau khi tổng hợp hạt nano vàng bằng phương pháp quét thế vòng với số vòng quét: 5, 10, 15, 20 vòng. Hình 4.9. Phổ EDS của điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng được tổng hợp bằng phương pháp quét điện thế tuần hoàn 20 chu kỳ. 4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 -5 -4 -3 -2 -1 0 Nång ®é PSA (ng/mL)  R C T ( k  ) 50 g/mL 5 g/mL Nång ®é aptamer cè ®Þnh PSA-aptamer/SAM/SPAuE 0 2 4 6 8 10 12 14 16 -15 -10 -5 0 5 100 g/mL 50 g/mL 5 g/mL  R C T ( k  ) Nång ®é PSA (ng/mL) PSA-aptamer/SAM/SPAuE Nång ®é aptamer cè ®Þnh AuNP – 10 CVsAuNP – 5 CVs AuNP – 15 CVs AuNP – 20 CVs 14 4.3.3.3 Đặc trưng của cảm biến 0 2 4 6 8 10 12 14 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Rct(k)=0,0275+0,0518*PSA(ng/mL) (b) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE  R ct ( k  ) Nång ®é PSA (ng/mL) R 2 =0,9845 Hình 4.12. a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên PSA từ 0 ng/mL đến 14 ng/mL; b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến PSA- aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE. Các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ hạt vàng cũng như nồng độ aptamer cố định cho thấy tín hiệu của cảm biến đạt kết quả tốt nhất với 10 vòng quét tổng hợp hạt nano vàng và nồng độ của aptamer là 5 µg/mL. Đường kính của bán cung trong phổ EIS tăng khi nồng độ kháng nguyên PSA tăng, hiệu ứng không gian chiếm ưu thế. Cảm biến có tính chọn lọc và độ tuyến tính cao trong dải nồng độ PSA từ 0 đến 10 ng/mL, giới hạn phát hiện LOD= 1,95 ng/mL. đáp ứng được yêu cầu phát hiện chỉ dấu PSA ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư tiền liệt tuyến. 4.4 Kết luận Hạt nano vàng tổng hợp trên điện cực SPCE cho phép phát triển màng SAM alkanethiol giống như trên điện cực SPAuE. Kết quả này rất có ý nghĩa, điện cực SPCE với giá thành thấp khi được biến tính bởi hạt nano vàng trên bề mặt sẽ cho phép sử dụng như điện cực vàng. Bên cạnh đó, các hạt nano vàng giúp phân tán đều đầu thu sinh học được cố định trên bề mặt điện cực. Các kết quả đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của hai loại cảm biến trên điện cực SPAuE và AuNPs-SPCE được giải thích một cách khoa học và đầy đủ bởi hiệu ứng không gian và hiệu ứng màn chắn tĩnh điện. Các lý giải này cũng giải thích được những mâu thuẫn trong kết quả công bố của nhóm tác giả Be Liu (2012) và Jolly Pawan (2015). 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Z' (k) PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE Nång ®é kh¸ng nguyªn PSA 0 ng/mL, 8 ng/mL 2 ng/mL, 10 ng/mL 4 ng/mL, 12 ng/mL 6 ng/mL, 14 ng/mL -Z " ( k  ) Mạch tương đương Randles ZW Rs Cdl Rct 2 4 6 8 10 12 14 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 −hCG Protein TAU amylin PSA  R ct ( k  ) Nång ®é (ng/mL) Hình 4.14. Độ chọn lọc của cảm biến PSA- Aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE. 15 CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN 5.1 Mở đầu 5.2 Thực nghiệm 5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE SPCE SPCE n O OH N H N H SPCE Pyrrole (Py) Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa) Pyrrole (Py) Pyrrole-2-carboxylic axit (Pa)Graphene oxit (GO) SPCE n O OH N H N H SPCE n O NH N H N H (EDC) R1-N=C=N-R2 SPCE n O O N H N H (NHS) NO O -NH2 (b) (a) Polyme Cố định kháng thể SPCE erGO Polyme n O O N H N H (NHS) NO O -NH2 SPCE n O NH N H N H Cố định kháng thể Hình 5.1. Quy trình cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của kháng thể và nhóm cacboxyl của polyme PPy-PPa: (a) trên điện cực SPCE; (b) trên điện cực erGO-SPCE. 5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi màng SAM(p-ATP) SPCE SPCE S NH2 SPCE NH S NH SPCE SPCE NH S NH Tạo hạt nano vàng Tạo màng SAM Xử lý EDC Cố định kháng thể (EDC) R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH O (Ab) Kháng thể AFP Kháng nguyên AFP Ethanolamine Phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thểSH NH2 4-Aminothiolphenol (p-ATP) AuNP Hình 5.2. Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE. 5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(p- ATP) và hạt nano vàng 16 SPCE SPCE S NH2 Tạo hạt nano vàng Tạo màng SAM Kháng thể AFP SPCE Tạo màng polymer SPCE S S N H H AuNP N H S NH AuNP AuNP SPCE S S N H H AuNP N H S NH AuNP AuNP Phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể SPCE NH2 S S N H NH2 H AuNP N H S N H AuNP AuNP Xử lý EDC Cố định kháng thể (EDC) R1-N=C=N-R2 + R3-C-OH O (Ab) Kháng nguyên AFP Ethanolamine AuNP SH NH2 4-Aminothiolphenol (p-ATP) Hình 5.3. Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của vật liệu lai polyme (p-ATP) và hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE. 5.3. Kết quả và thảo luận 5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/SPCE 5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE 5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần của monome Pa với Py Tỷ lệ hợp phần của Pa với Py là 1:3 (40mM:120 mM) cho màng polyme có đáp ứng điện hóa tốt nhất (Hình 5.6). Màng polyme có dạng bông súp lơ và phát triển đa tầng trên bề mặt điện cực (Hình 5.4b). Phép đo quang phổ Raman được thực hiện tại bước sóng kích thích là 632,8 nm, vạch phổ tại số sóng 1398 đến 1400 cm-1 khẳng định sự có mặt của -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 SPCE Tû sè Pa / Py 0 mM : 160 mM 40 mM : 120 mM 80 mM : 80 mM 120 mM : 40 mM 160 mM : 0 mM E / V vs. Ag/AgCl I /  A Hình 5.6. Đáp ứng dòng-thế của điện cực được tổng hợp màng PPy-PPa/SPCE với tỷ lệ Pa so với Py thay đổi từ 0 đến 100% mol. Hình 5.5. Phổ Raman của màng polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE. 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 (2) (3) (4) G-band C - ê n g ® é ( a .u .) Sè sãng (cm -1 ) ®iÖn cùc SPCE trÇn D-band PPy-PPa/SPCE t¹i c¸c vÞ trÝ kh¸c nhau (1) COO - Dao ®éng ®Æc tr-ng cña Py Hình 5.4b. Ảnh SEM bề mặt màng polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE. (b) 17 nhóm cacboxyl trong cấu trúc màng polyme đồng trùng hợp. 5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 0 20 40 60 80 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 n sè mÉu = 3  R c t( k  ) Nång ®é AFP(ng/mL) b) LOD = 2,46 ng/mL mAb AFP/PPy-PPa/SPCE Rct (k) = 0,312 + 0,04*AFP (ng/mL) R 2 = 0,984 n samples = 3 Hình 5.7. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL. -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 Nång ®é AFP I /  A 0 ng/mL; 5 ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 40 ng/mL; 60 ng/mL 80 ng/mL; 100 ng/mL E / V vs. Ag/AgCl mAb AFP/PPa-PPy/SPCEa) 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 Nång ®é AFP (ng/mL)  I p c ( A ) b) mAb AFP/PPy-PPa/SPCE R 2 = 0,984 R 2 = 0,99 Ipc() = 0,37 + 0,158*AFP (ng/mL) Hình 5.8. Đáp ứng dòng thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL. 5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Z' (k) SPCE GO-SPCE erGO-SPCE 30CVs -Z " ( k  ) a) 3 4 5 6 7 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 SPCE GO-SPCE erGO-SPCE I /  A E / V vs. Ag/AgCl b) Hình 5.10. Đặc trưng điện hóa của điện cực erGO-SPCE khảo sát trong dung dịch đo gồm 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- và KCl 0,1 M. a) Đáp ứng phổ EIS, b) Đáp ứng dòng-thế tại tốc độ quét 50 mV/s. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Nång ®é AFP 0 ng/mL ; 5 ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 30 ng/mL; 40 ng/mL 50 ng/mL; 60 ng/mL 70 ng/mL; 80 ng/mL 90 ng/mL; 100 ng/mL -Z " (k  ) Z'(k) mAb AFP/PPa-PPy/SPCEa) ZW Rs Rct CPE Mạch tương đương 18 Điện cực sau khi phủ GO có độ dẫn kém, sau khử điện hóa erGO-SPCE với 30 vòng quét cho đáp ứng dòng thế cao hơn so với điện cực SPCE ban đầu. Độ dẫn và tốc độ truyền điện tử được cải thiện khi sử dụng điện cực erGO-SPCE. Tỷ số IG/ID giảm khi số vòng quét tăng, Tỷ số này khá cách biệt giữa 10 và 20 vòng quét CV nhưng sai khác khá nhỏ tại số vòng quét là 20 và 30. Điều kiện tối ưu khử điện hóa GO là 30 vòng quét. 5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực Hình thái bề mặt erGO-SPCE khác biệt hẳn so với điện cực ban đầu với các nếp gấp giúp tăng diện tích bề mặt riêng của điện cực. Màng PPy-PPa được tổng hợp trên điện cực erGO/SPCE nhiều nếp nhăn tựa như cấu trúc của vỏ não người; hình thái này hoàn toàn khác biệt so với cấu trúc dạng bông súp lơ của polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE. 5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến Hình 5.12. Ảnh SEM của a) bề mặt điện cực SPCE trần, b) có nhỏ phủ GO, c) điện cực SPCE biến tính bởi erGO và d) điện cực được tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa PPy-PPa và erGO. SPCEa) GO/SPCEb) erGO/SPCEc) PPa-PPy/erGO/SPCEd) 800 1000 1200 1400 1600 1800 I D /I G = 2,70 I D /I G = 2,67 I D /I G = 2,21 G-band (d) erGO 30CVs (c) erGO 20CVs (a) GO C - ê n g ® é a .u . Sè sãng (cm -1 ) (b) erGO 10CVs I D /I G = 1,02 D-band Hình 5.11. Phổ Raman của màng GO và erGO trên điện cực SPCE. 19 2 4 6 8 10 12 14 0 1 2 3 4 5 mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE -Z '' (k  ) Z'(k) Nång ®é AFP 0 ng/mL ; 0,1 ng/mL 1 ng/mL; 5 ng/mL 10 ng/mL; 20 ng/mL 30 ng/mL; 40 ng/mL 50 ng/mL; 60 ng/mL 70 ng/mL; 80 ng/mL 90 ng/mL; 100 ng/mL a) 3 4 5 6 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Nång ®é AFP (ng/mL)  R ct (k  ) b) LOD=0,34 ng/mL mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE R 2 = 0,996 Rct (k) = 0,375 + 0,057*AFP (ng/mL) n sè mÉu = 3 Hình 5.13. Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL. Vùng đáp ứng tuyến tính cua cảm biến mở rộng từ 0,1 ng/mL đến 100 ng/mL. Độ nhạy của cảm biến đạt 57 /ng.mL-1 cao hơn 1,4 lần so với cảm biến sử dụng polyme PPy-PPa (40 /ng.mL-1). 5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM(p-ATP)/ AuNPs-SPCE 5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng 5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM Thời gian tạo màng đơn lớp quyết định đến tính ổn định và độ bền của màng SAM. Với thời gian tạo màng SAM là 18 và 24 giờ đáp ứng tín hiệu Rct không ổn định do điện cực SPCE ngâm quá lâu trong môi trường ethanol sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của điện cực. Chúng tôi chọn điều kiện tối ưu để tổng hợp màng SAM trên điện cực 20 CVs AuNPs-SPCE là 12 giờ. 5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 100 50  R c t(  ) Nång ®é AFP (ng/mL) 6 giê