Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin - 1, dinophysistoxin - 2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ

sử dụng trong thẩm định phương pháp của Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Canada (National Research Council Canada – NRCC) là thịt vẹm có chứa các độc tố OA, DTX1 và DTX2 đã biết trước hàm lượng ở dạng tự do và tổng lượng. Hàm lượng các độc tố trên chứng chỉ của mẫu chuẩn được tổng hợp trong bảng 2.2. Bảng 2.1. Hàm lượng các độc tố trong mẫu chuẩn OA DTX1 DTX2 Hàm lượng tự do (µg/g) 1,07 1,07 0,86 Tổng hàm lượng (µg/g) 2,40 1,10 2,20 7 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể 2.3.1.1. Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ - Xác định ion sơ cấp: Tiến hành phân tích khối phổ của từng độc tố ở chế độ quét toàn phổ (full scan) và chế độ chọn lọc từng ion (SIM) để xác định giá trị m/z các ion tạo thành của từng độc tố. - Tối ưu hóa thế loại dung môi (declustering potential – DP) để chọn điều kiện cho cường độ ion sơ cấp tốt nhất với từng độc tố. - Xác định các ion thứ cấp: đưa dung dịch chuẩn của từng độc tố ở nồng độ 100 ng/ml vào hệ thống MS, tiến hành ghi phổ của các ion sơ cấp ở chế độ theo dõi ion thứ cấp (product ion scan) để phát hiện các ion thứ cấp tạo thành. - Tối ưu hóa điều kiện của buồng va chạm tạo ion thứ cấp của từng độc tố: Lựa chọn 2 ion thứ cấp để sử dụng cho việc phân tích các độc tố với chế độ theo dõi đa phản ứng (Multireaction monitoring – MRM) làm ion định lượng và ion định tính cho từng độc tố. 2.3.1.2. Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký Dựa vào các đặc điểm lý hóa của OA, DTX1, DTX2, tham khảo các nghiên cứu đã được công bố, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau về pha tĩnh, pha động (loại dung môi, tỷ lệ thành phần trong pha động), các điều kiện sắc ký khác (tốc độ dòng, chế độ rửa giải, v.v.) để tìm ra các điều kiện sắc ký phù hợp cho việc tách các độc tố khỏi nền mẫu, có thành phần pha động tương thích với detector MS/MS và cho đáp ứng pic tốt nhất trên detector MS/MS. 2.3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể a/ Lựa chọn dung môi chiết độc tố: Tiến hành khảo sát trên các mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn cũng như trên mẫu nhuyễn thể thực nhiễm độc tố để chọn ra loại dung môi chiết, điều kiện chiết phù hợp cho phép có hiệu suất chiết tốt. b/ Khảo sát quy trình làm sạch dịch chiết độc tố từ nhuyễn thể - Đánh giá mức độ cần thiết phải làm sạch dịch chiết độc tố từ nhuyễn thể. - Khảo sát thiết lập điều kiện làm sạch dịch chiết để lựa chọn quy trình phù hợp. 2.3.1.4. Khảo sát điều kiện thủy phân để phân tích độc tố toàn phần a/ Khảo sát, lựa chọn điều kiện thủy phân độc tố dạng ester Dựa trên nguyên tắc thủy phân ester của độc tố bằng dung dịch NaOH, tiến hành tối ưu hóa hoặc đánh giá sự phù hợp của một số điều kiện 8 then chốt của quá trình thủy phân (nhiệt độ, thời gian thủy phân...) để có được hiệu suất thủy phân cao nhất để chuyển OA, DTX1, DTX2 ở dạng ester về dạng tự do, đồng thời không làm mất đi lượng độc tố tự do có trong mẫu từ trước khi thủy phân (nếu có). b/ Thiết lập điều kiện làm sạch dịch thủy phân Sau quá trình thủy phân, thực hiện đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu thủy phân tới việc phân tích LC-MS/MS. Trong trường hợp kết quả thực nghiệm cho thấy nền dịch thủy phân ảnh hưởng đáng kể tới kết quả phân tích LC-MS/MS, tiến hành khảo sát lựa chọn quy trình làm sạch dịch thủy phân cho phép loại trừ ảnh hưởng nền mẫu tới phân tích LC-MS/MS nhưng vẫn bảo toàn được lượng độc tố. 2.3.1.5. Thẩm định phương pháp Sau quá trình khảo sát, xây dựng phương pháp, phương pháp phân tích OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể bằng LC - MS/MS gồm điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu thích hợp sẽ được thẩm định toàn diện về các chỉ tiêu sau: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính của khoảng nồng độ công tác, độ đúng và độ chính xác, độ nhạy (gồm LOQ và LOD). 2.3.2. Phân tích độc tố trên mẫu nhuyễn thể 2.3.2.1. Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn thể Dựa trên các quy định, nghiên cứu đã công bố để lựa chọn số lượng cá thể tạo thành một mẫu phù hợp đại diện được cho tình trạng nhiễm độc tố của loài nhuyễn thể tương ứng tại địa phương lấy mẫu. 2.3.2.2. Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể Để đảm bảo bảo tồn được lượng độc tố trong mẫu nhuyễn thể ổn định từ khi lấy mẫu cho tới khi phân tích, độ bền của độc tố trong nhuyễn thể sẽ được khảo sát trong các điều kiện sau: - Bảo quản mát trong thùng xốp có đá lạnh để vận chuyển mẫu từ nơi lấy về phòng thí nghiệm. - Bảo quản trong ngăn lạnh của tủ lạnh dân dụng để lưu mẫu tạm thời trong khi đi lấy mẫu dài ngày. - Bảo quản trong tủ lạnh sâu chuyên dụng: đánh giá khả năng lưu mẫu lâu dài chờ xử lý và phân tích độc tố bằng LC-MS/MS. 2.3.2.3. Lựa chọn địa điểm, khoảng thời gian lấy mẫu - Địa điểm: lựa chọn lấy mẫu tại 6 địa phương ven biển: Nam Định, Thanh Hóa, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Bà Rịa – Vũng Tàu. - Khoảng thời gian lấy mẫu: 12 tháng (4/2016 – 3/2017). 2.3.3. Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả 2.3.3.1. Tiến hành phân tích trên mẫu thực 9 Tiến hành phân tích định tính sự có mặt của độc tố (OA, DTX1, DTX2) và định lượng hàm lượng toàn phần và tự do của độc tố (nếu có ở trên mức LOQ) trong các mẫu nhuyễn thể được lấy về. 2.3.3.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn thể Về định tính, chỉ kết luận khi tất cả các lần phân tích độc lập đều cho kết quả định tính khẳng định sự có mặt của độc tố.Về định lượng, lấy kết quả trung bình thu được từ tối thiểu 3 lần phân tích độc lập. 2.3.3.3. Các hướng biện giải, bàn luận kết quả Những trường hợp mẫu nhuyễn thể phát hiện thấy độc tố sẽ được xem xét bàn luận theo các hướng sau:ảnh hưởng của thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, loại nhuyễn thể, mức hàm lượng độc tố phát hiện thấy trong mẫu nhuyễn thể so với giới hạn cho phép trong quy định quản lý chất lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ hiện hành. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích OA, DTX1 và DTX2 3.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích OA, DTX1, DTX2 bằng LC – MS/MS 3.1.1.1. Điều kiện detector MS/MS Bước đầu tiên để xây dựng phương pháp phân tích các độc tố OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể là thiết lập được điều kiện tối ưu cho việc phân tích những độc tố này bằng khối phổ hai lần. Những điều kiện này bao gồm 2 nhóm chính: - Lựa chọn ion sơ cấp cùng điều kiện khối phổ tối ưu để tạo ion sơ cấp. - Lựa chọn điều kiện bắn phá ion sơ cấp cùng các ion thứ cấp sử dụng vào việc định tính và định lượng các độc tố. Với kỹ thuật ion hóa ESI-, ion sơ cấp được chọn là ion [M-H]- (m/z 803 với OA, DTX2 và m/z 817 với DTX1), ion thứ cấp để định lượng là ion m/z 255 (ion thứ cấp có cường độ lớn nhất), ion thứ cấp để định tính là ion m/z 563. Tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 so với ion m/z 255 phải nằm trong khoảng 5 % - 13 %. Các điều kiện của detector MS/MS được lựa chọn sau tối ưu hóa như ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Điều kiện tách chùm ion sơ cấp và tạo ion thứ cấp của độc tố nhóm DSP Độc tố Ion sơ cấp (m/z) Ion thứ cấp (m/z) DP (V) CE(eV) CXP (V) OA 803 255 -85 -60 -17 563 -55 -17 DTX1 817 255 -85 -60 -17 563 -55 -17 DTX2 803 255 -85 -60 -17 563 -55 -17 10 Hình 3.1. Phổ ESI – MS/MS của OA, DTX1 và DTX2 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký Đã tiến hành tối ưu hóa thành phần pha động, điều kiện rửa giải trên 2 loại cột sắc ký để thu được điều kiện cho phép tách hoàn toàn 3 độc tố, nhất là OA và DTX2 (hai độc tố có cùng công thức phân tử, là đồng phân cấu tạo của nhau). a/ Điều kiện sắc ký trên cột UPLC Zorbax Eclipse Plus như sau: - Cột: C18 Zorbax Eclipse Plus (2,1 ´ 50 mm, 1,8 µm). - Pha động: acetonitril – nước (35:65, tt:tt) chứa 0,1 % acid formic và 0,01 M amoni format trong cả acetonitril và nước. - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 5 µl. b/ Điều kiện sắc ký trên cột HPLC Cortecs như sau: - Cột: C18 Cortes (4,6 ´ 100 mm, 3,5 µm). - Pha động: acetonitril – nước chứa 0,1% acid formic trong cả acetonitril và nước, tỷ lệ theo chương trình gradient dung môi ở bảng 3.3. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Bảng 3.3.Chương trình gradient dung môi cho cột Cortecs Thời gian (phút) Tỷ lệ acetonitril (%) Tỷ lệ nước (%) 0 70 30 8 10 90 11 10 90 11,5 70 30 15 70 30 11 3.1.2. Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1, DTX2 từ nhuyễn thể 3.1.2.1. Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố ở dạng tự do a/ Quy trình chiết và làm sạch trên cột chiết pha rắn Khoảng 1 g thịt nhuyễn thể đã được xay nhuyễn và đồng nhất hóa được chiết 2 lần với lần lượt 3 ml methanol và 2 ml methanol. Sau mỗi lần chiết, ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút và lấy dịch trong. Gộp dịch chiết methanol cô cạn dưới luồng khí nitơ và hòa tan trở lại trong 5 ml hỗn hợp methanol – nước (1:5, tt:tt). Cột chiết pha rắn Strata-X được hoạt hóa bằng 2 ml methanol và 2 ml nước khử ion. Nạp dịch hòa tan qua cột Strata- X ở tốc độ khoảng 1 ml/phút, rửa cột bằng 1 ml H2O rồi rửa giải bằng 2 ml methanol, cô cạn dưới luồng nitơ rồi hòa tan lại cắn trong 500 µl methanol rồi khi tiêm vào hệ thống LC – MS/MS. b/ Quy trình chiết và làm sạch bằng ly tâm lạnh Khoảng 1 g thịt nhuyễn thể đã được xay nhuyễn và đồng nhất hóa được chiết 2 lần với lần lượt 3 ml methanol và 2 ml methanol trong ống ly tâm dung tích 15 ml. Sau mỗi lần chiết mẫu nhuyễn thể bằng methanol, để ống chiết trong máy ly tâm lạnh tại 4oC trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 4oC với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút, hút ngay dịch trong. Sau quá trình chiết, cô cạn dịch chiết methanol dưới luồng khí nitơ, hòa tan cắn trong 500 µl methanol rổi tiêm vào hệ thống LC – MS/MS. 3.1.2.2. Điều kiện xử lý mẫu để phân tích độc tố ở dạng toàn phần Đã thiết lập được 2 quy trình thủy phân và xử lý dịch thủy phân: a/ Quy trình sử dụng ly tâm lạnh kết hợp chiết lỏng - lỏng sau thủy phân Khoảng 1 g thịt nhuyễn thể đã được xay nhuyễn và đồng nhất hóa được chiết 2 lần với lần lượt 3 ml methanol và 2 ml methanol. Sau quá trình chiết, cô cạn dịch chiết methanol dười luồng khí nitơ, hóa tan cắn trong 500 µl methanol. Thêm 150 µl NaOH 2,5 M, lắc xoáy 30 giây rồi đun cách thủy ở 76oC trong 30 phút, sau đó thêm 150 µl HCl 2,5 M và lắc xoáy trong 30 giây. Pha loãng dịch sau thuỷ phân với 0,2 ml H2O rồi chiết bằng 2 ml isopropyl acetat. Lấy lớp isopropyl acetat bên trên, sau đó được cô cạn dưới luồng nitơ, cắn được hòa tan trong 500 µl methanol, ly tâm ở 4oC trong 5 phút với tốc độ 14000 vòng/phút, dịch trong dùng đưa vào hệ thống LC–MS/MS. b/ Quy trình xử lý qua cột chiết pha rắn sau thủy phân Khoảng 1 g thịt nhuyễn thể đã được xay nhuyễn và đồng nhất hóa được chiết 2 lần với lần lượt 3 ml methanol và 2 ml methanol trong ống ly tâm dung tích 15 ml. Sau mỗi lần chiết, ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 12 phút và lấy dịch trong. Gộp dịch chiết methanol cô cạn dưới luồng khí nitơ và hòa tan trở lại trong 500 µl methanol. Thêm 150 µl NaOH 2,5 M, lắc xoáy 30 giây rồi đun cách thủy ở 76 oC trong 30 phút, sau đó thêm 150 µl HCl 2,5 M và lắc xoáy trong 30 giây. Cột chiết pha rắn Strata-X được hoạt hóa bằng 2 ml methanol và 2 ml H2O khử ion. Thêm 2,2 ml nước vào dịch thủy phân, loắc xoáy trong 30 giây rồi nạp qua cột Strata-X ở tốc độ khoảng 1 ml/phút, rửa cột bằng 1 ml H2O rồi rửa giải bằng 2 ml methanol. Cô cạn dịch rửa giải dưới luồng khí nitơ và hòa tan trở lại trong 500 µl methanol, tiêm vào hệ thống LC – MS/MS. Trong hai quy trình này, quy trình a đơn giản hơn được lựa chọn để thiết lập phương pháp phân tích OA, DTX1 và DTX2 toàn phần. 3.1.3. Khảo sát thiết lập bảo quản nhuyễn thể Đã thiết lập điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể như sau: - Vận chuyển mẫu nhuyễn thể được thực hiện trong thùng xốp kín có đá khô bảo quản trong thời gian tổng cộng không quá 48 giờ. - Trong trường hợp thực hiện đợt lấy mẫu nhiều ngày, bảo quản mẫu nhuyễn thể trong ngăn đá tủ lạnh trong thời gian tổng cộng không quá 14 ngày chờ vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. - Bảo quản dài ngày mẫu nhuyễn thể để chờ xử lý mẫu và phân tích mẫu trong tủ lạnh âm sâu ở -78 oC. Thời gian bảo quản trong tủ lạnh âm sâu không quá 6 tháng cho tới khi tiến hành xử lý mẫu và phân tích. 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích OA, DTX1 và DTX2 3.2.1. Điều kiện của các phương pháp được thẩm định 3.2.1.1. Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs Sử dụng điều kiện xử lý mẫu ở mục 3.1.2.1.a, điều kiện phân tích sắc ký ở mục 3.1.1.2.b và điều kiện detector MS/MS ở mục 3.1.1.1. 3.2.1.2. Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax Sử dụng điều kiện xử lý mẫu ở mục 3.1.2.1.b khi phân tích độc tố tự do và ở mục 3.1.2.2.a khi phân tích độc tố toàn phần, điều kiện phân tích sắc ký ở mục 3.1.1.2.a và điều kiện detector MS/MS ở mục 3.1.1.1. 3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs 3.2.2.1. Độ đặc hiệu Phương pháp đặc hiệu với OA, DTX1, DTX2 với số điểm IP là 4 cho mỗi độc tố (ion sơ cấp [M-H]- (m/z 803 với OA, DTX2 và m/z 817 với DTX1) và các ion thứ cấp m/z 255 và 563 được tạo ra từ ion sơ cấp khi phân tích mẫu thử bằng LC – MS/MS ở chế độ MRM), quá trình tách sắc ký trên cột Cortecs tách riêng được 3 độc tố, cho phép xác định vị trí pic các độc tố theo thời gian lưu (xem hình 3.18), tỷ lệ đáp ứng của ion m/z 13 563 so với ion m/z 255 trên dung dịch chuẩn khoảng 9 %, trên mẫu thử có độc tố đảm bảo trong khoảng ± 50 % so với trên dung dịch chuẩn. Hình 3.18. Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Cortecs (A: sắc ký đồ mẫu nhuyễn thể không chứa độc tố; B: sắc ký đồ MeOH; C, D: sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp; E, F: sắc ký đồ mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn độc tố). 3.2.2.2. Độ thích hợp hệ thống Kết quả đánh giá trên dung dịch chuẩn của 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 được phân tích lặp lại 6 lần cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về thích hợp hệ thống khi có độ lặp lại tốt về thời gian lưu (RSD ≤ 0,5 %) và diện tích pic (RSD ≤ 0,9 %) với cả 3 độc tố, tỷ lệ đáp ứng giữa ion m/z 563 và ion m/z 255 đều xấp xỉ 9 %, với RSD ≤ 1,4 % khi phân tích lặp lại. 3.2.2.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 với đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 255 được khảo sát trong khoảng nồng độ từ 5 ng/ml – 100 ng/ml (tại 5 nồng độ là 5, 10, 20, 50, 100 ng/ml). Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ này, với cả 3 độc tố có quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ độc tố và đáp ứng diện tích pic trên sắc ký đồ với r > 0,99. 3.2.2.4. Độ chính xác - Độ lặp lại trong ngày: Mẫu vẹm xanh không chứa độc tố được thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 ở 3 mức nồng độ 12,5 ng/g, 25,0 ng/g và 50,0 ng/g, tiến hành xử lý mẫu độc lập 6 lần ở mỗi mức thêm chuẩn trong ngày rồi phân tích. Mức RSD của nồng độ độc tố định lượng được giữa 6 lần phân tích giao động từ 2,0 % đến 4,2 %, đạt yêu cầu về độ chính xác của AOAC. A B C D E F OA OA DTX2 DTX2 DTX1 DTX1 14 - Độ chính xác trung gian: Các mẫu vẹm xanh không chứa độc tố được thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 ở các nồng độ tương tự như khi đánh giá độ lặp lại trong ngày rồi xử lý mẫu và phân tích thành 9 lần độc lập trong 2 ngày khác nhau. Mức RSD của nồng độ độc tố định lượng được giữa 9 lần phân tích giao động từ 2,0 % đến 3,7 %, đạt yêu cầu về độ chính xác của AOAC. - Ảnh hưởng của nền nhuyễn thể lên độ chính xác của phương pháp: thêm 3 độc tố ở mức 25 ng/g vào 4 nền mẫu không chứa độc tố khác nhau (hàu, sò huyết, sò lông, ngao). RSD với cả 3 độc tố dao động từ 3,4 % - 4,8 % trên 4 nền mẫu, đạt yêu cầu độ chính xác của AOAC ở mức nồng độ này. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác khi phân tích 3 độc tố dạng tự do trong nhuyễn thể. 3.2.2.5. Độ đúng - Đánh giá tỷ lệ tìm lại trên mẫu thêm chuẩn như ở mục 3.2.2.4, tỷ lệ thu hồi tính chung trên cả 3 độc tố ở mức 12,5 ng/g là 89,4 % – 99,9 %, ở mức 25,0 ng/g từ 90,0 % – 99,9 %, ở mức 50,0 ng/g từ 90,5 % - 99,7 %, đạt yêu cầu độ đúng của AOAC. - Đánh giá tỷ lệ thu hồi ở mức thêm chuẩn 25,0 ng/g trên 4 loại nền mẫu nhuyễn thể (xem 3.2.2.4), tỷ lệ thu hồi trên cả 3 độc tố nằm trong khoảng 88,2 % - 99,1 %, đạt yêu cầu độ đúng của AOAC. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ đúng khi phân tích 3 độc tố ở dạng tự do trong nhuyễn thể. 3.2.2.6. Độ nhạy Để xác định LOQ và LOD của phương pháp với OA, DTX1, DTX2 hai tiêu chí sau được tính đến: - Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền (S/N) của pic độc tố với ion thứ cấp m/z 255 dùng để định lượng phải đạt trên 10 tại LOQ và trên 3 tại LOD. - Tỷ lệ đáp ứng của ion thứ cấp m/z 563 so với ion thứ cấp m/z 255 phải đạt trong khoảng ± 50 % giá trị trung bình thu được trên mẫu chuẩn để đảm bảo độ tin cậy về định tính. Kết quả thực nghiệm cho thấy với cả 3 độc tố LOQ là 2,5 ng/g và LOD là 1,0 ng/g. 3.2.3. Phương pháp phân tích OA, DTX1, DTX2 tự do và toàn phần trên cột Zorbax Eclipse Plus 3.2.3.1. Độ đặc hiệu Do sử dụng cùng điều kiện MS/MS, phương pháp có độ đặc hiệu về điểm IP, tỷ lệ đáp ứng giữa ion m/z 563 và ion m/z 255 tương tự như ở 3.2.2.1. Quá trình tách sắc ký trên cột Zorbax Eclipse Plus cũng cho phép 15 tách riêng 3 độc tố trên sắc ký đồ, nhờ đó có thể định danh phân biệt nhờ thời gian lưu (xem hình 3.21). Như vậy, phương pháp đủ đặc hiệu để phân tích OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể. Hình 3.21. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax Eclipse Plus (A: MeOH; B: mẫu nhuyễn thể không chứa độc tố; C, D: dung dịch chuẩn độc tố; E, F: mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn độc tố) 3.2.3.2. Độ thích hợp hệ thống Kết quả đánh giá trên dung dịch chuẩn của 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 được phân tích lặp lại 6 lần cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về thích hợp hệ thống khi có độ lặp lại tốt về thời gian lưu (RSD ≤ 0,4 %) và diện tích pic (RSD ≤ 1,6 %) với cả 3 độc tố, tỷ lệ đáp ứng giữa ion m/z 563 và ion m/z 255 đều xấp xỉ 9 %, với RSD ≤ 2,0 % khi phân tích lặp lại. 3.2.3.3. Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 với đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 255 được khảo sát trong khoảng nồng độ từ 5 ng/ml – 100 ng/ml (tại 6 nồng độ là 5, 10, 20, 40, 80 và 100 ng/ml). Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ này, với cả 3 độc tố có quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ độc tố và đáp ứng diện tích pic trên sắc ký đồ với r > 0,99. 3.2.3.4. Độ chính xác a. Phân tích độc tố tự do - Độ lặp lại trong ngày: Mẫu vẹm xanh không chứa độc tố được thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 ở 4 mức nồng độ 2,5 ng/g, 5,0 ng/g 20,0 ng/g và 40,0 ng/g, mẫu chuẩn chứa 1,07 ppm OA, DTX1 và 0,86 ppm DTX2 tiến hành xử lý mẫu độc lập 6 lần trong ngày rồi phân tích. Mức RSD của nồng độ độc tố định lượng được giữa 6 lần phân tích trên mẫu thêm chuẩn giao A B DTX2 C OA D F DTX1 E DTX2 OA DTX1 D F 16 động từ 1,1 % đến 8,0 %, trên mẫu chuẩn dao động từ 2,6 % - 3,6 % tính chung trên cả 3 độc tố, đạt yêu cầu về độ chính xác của AOAC. - Độ chính xác trung gian: Các mẫu vẹm xanh không chứa độc tố được thêm chuẩn OA, DTX1, DTX2 ở các nồng độ tương tự như khi đánh giá độ lặp lại trong ngày rồi xử lý mẫu và phân tích thành 9 lần độc lập trong 2 ngày khác nhau. Mức RSD của nồng độ độc tố định lượng được giữa 9 lần phân tích giao động từ 1,9 % đến 8,1 %, đạt yêu cầu về độ chính xác của AOAC. - Ảnh hưởng của nền nhuyễn thể lên độ chính xác của phương pháp: thêm 3 độc tố ở mức 20 ng/g vào 4 nền mẫu không chứa độc tố khác nhau (hàu, sò huyết, sò lông, ngao). RSD với cả 3 độc tố dao động từ 3,9 % - 5,1 % trên 4 nền mẫu, đạt yêu cầu độ chính xác của AOAC ở mức nồng độ này. b. Phân tích độc tố toàn phần - Độ lặp lại trong ngày: tiến hành thủy phân 6 lần 1 mẫu hàu có OA ở cả dạng tự do và dẫn xuất, 1 mẫu hàu có DTX2 cả ở dạng tự do và dẫn xuất, và mẫu chuẩn có tổng lượng OA 2,4 ppm, DTX1 1,1 ppm và DTX2 2,2 ppm. Tiến hành phân tích tổng lượng độc tố, đánh giá độ giao động kết quả định lượng độc tố giữa 6 lần phân tích. RSD bằng 3,1 % trên mẫu có tổng hàm lượng OA khoảng 9,7 ng/g, RSD bằng 3,3 % trên mẫu có tổng hàm lượng DTX2 khoảng 10,3 ng/g, RSD bằng 4,9 % với OA, 4,4 % với DTX1, 4,3 % với DTX2 trên mẫu chuẩn, đều đạt yêu cầu độ chính xác của AOAC. - Độ chính xác trung gian: tiến hành thủy phân 9 lần 1 mẫu hàu có OA và 1 mẫu hàu có DTX2 cả ở dạng tự do và dẫn xuất trong 2 ngày khác nhau. Tiến hành phân tích tổng lượng độc tố, đánh giá độ giao động kết quả thu được giữa 9 lần phân tích. RSD bằng 2,9 % trên mẫu có hàm lượng OA khoảng 9,7 ng/g, RSD bằng 3,0 % trên mẫu có hàm lượng DTX2 khoảng 10,3 ng/g, đều đạt yêu cầu độ chính xác của AOAC. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác khi phân tích dạng tự do cũng như tổng lượng của độc tố OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể. 3.2.3.5. Độ đúng a. Phân tích độc tố tự do Đánh giá độ đúng được tiến hành trên các mẫu thêm chuẩn, mẫu thêm chuẩn vào các nền nhuyễn thể khác nhau và mẫu chuẩn như ở 3.2.3.4.a. Trên mẫu thêm chuẩn, tỷ lệ thu hồi tính chung trên 3 độc tố ở mức thêm chuẩn 2,5 ng/g từ 73,4 % - 112,9 %, ở mức 5,0 ng/g từ 92,1 % - 109,8 %, ở mức 20,0 ng/g từ 89,4 % - 101,1 %, ở mức 40 ng/g từ 88,7 % - 99,5 %, trên các mẫu thêm chuẩn ở 20,0 ng/g vào nền nhuyễn thể khác 17 nhau từ 87,7 % - 98,4 %, trên mẫu chuẩn từ 89,9 % - 99,5 %. Kết quả này đạt yêu cầu độ đúng của AOAC ở các mức nồng độ tương ứng. b. Phân tích độc tố toàn phần Đánh giá độ đúng được thực hiện trên mẫu chuẩn như ở 3.2.3.4.b. Xét chung trên cả 3 độc tố, tỷ lệ thu hồi từ 88,9 % - 99,8 %, đạt yêu cầu độ đúng của AOAC ở các mức nồng độ tương ứng. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng khi phân tích dạng tự do cũng như tổng lượng của các độc tố OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn thể. 3.2.3.6. Độ nhạy Tiến hành đánh giá độ nhạy theo các tiêu chỉ như đã nêu ở 3.2.2.6, kết quả thực nghiệm cho thấy với cả 3 độc tố LOQ là 2,5 ng/g và LOD là 1,0 ng/g. Hình 3.24. Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng MS/MS (1-4: dung dịch chuẩn hỗn hợp;5: mẫu hàu 1; 6: mẫu vẹm 12;7: mẫu hàu 10; 8: mẫu vẹm không phát hiện có độc tố;9: mẫu sò huyết 5; 10: MeOH; số thứ tự các mẫu nhuyễn thể như trong bảng 3.25) 3.3. PHÂN TÍCH OA, DTX1, DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ Sử dụng các phương pháp đã thẩm định, luận án đã phân tích 188 mẫu nhuyễn thể lấy tại 6 tỉnh khác nhau. Trong đó, 19 mẫu phát hiện thấy độc tố ở dạng tự do (17 mẫu có OA, 2 mẫu có DTX2) và 4 mẫu chỉ phát (1) (3) (5) (7) (9) (2) (4) (6) (8) (10) OA DTX2 OA DTX2 OA OA OA DTX2 18 hiện thấy OA ở dạng dẫn xuất sau khi thủy phân (xem bảng 3.25).Không mẫu nào phát hiện thấy DTX1. Tỷ lệ phát hiện độc tố cao nhất trên sò huyết (22,2 %), rồi tới hàu (20,8 %), sò lông (10,0 %), vẹm (6,8 %), riêng trên ngao không phát hiện mẫu nào nhiễm độc tố. Một số sắc ký đồ đại diện trên mẫu thực được trình bày trong hình 3.24. Bảng 3.25. Tổng hợp kết quả các mẫu phát hiện có độc tố ST T Loài nhuyễn thể Thời điểm lấy mẫu Nơi lấy mẫu Loại độc tố phát hiện thấy Hàm lượng độc tố tự do (ng/g) (TB±SD, n = 3) Hàm lượng độc tố toàn phần ng/g (TB±SD, n = 3) Tỷ lệ đáp ứng ion m/z 563 so với ion m/z 255 (%, TB ±SD, n = 3) 1 Hàu 11/2016 Thanh Hoá OA 9,5 ± 0,1 10,7 ± 0,4 8,6 ± 0,4 2 Hàu 11/2016 Thanh Hoá OA 5,1 ± 0,1 8,2 ± 0,3 8,3 ± 0,3 3 Hàu 9/2016 Thanh Hoá OA 4,7 ± 0,2 9,7 ± 0,3 8,5 ± 0,3 4 Hàu 2/2017 Thanh Hoá OA 4,3 ± 0,1 10,4 ± 0,3 8,8 ± 0,5 5 Sò huyết 12/2016 Nam Định OA 3,9 ± 0,1 11,3 ± 0,7 8,8 ± 0,3 6 Hàu 10/2016 Thanh Hoá OA 3,1 ± 0,2 5,1 ± 0,3 8,5 ± 0,5 7 Sò huyết 9/2016 Nam Định OA 3,1 ± 0,2 4,9 ± 0,3 8,3 ± 0,6 8 Vẹm 12/2016 Bình Định OA - 2,9 ± 0,3 8,6 ± 0,3 9 Hàu 2/2017 Thanh Hoá DTX2 4,4 ± 0,1 5,2 ± 0,3 8,5 ± 0,5 10 Hàu 3/2017 Thanh Hoá DTX2 6,4 ± 0,3 10,3 ± 0,6 8,4 ± 0,4 11 Sò lông 4/2016 Thanh Hoá OA + + 8,0 ± 0,6 12 Vẹm 4/2016 Phú Yên OA + + 8,3 ± 0,4 13 Hàu 6/2016 Thanh Hoá OA + + 8,1 ± 0,7 14 Hàu 9/2016 BR-VT OA + + 8,4 ± 0,4 15 Sò huyết 11/2016 Bình Định OA + + 8,5 ± 0,5 16 Sò huyết 11/2016 Nam Định OA + + 8,3 ± 0,6 17 Sò lông 12/2016 Thanh Hoá OA + + 8,2 ± 0,3 18 Sò huyết 1/2017 Nam Định OA + + 8,6 ± 0,7 19 Sò huyết 3/2017 Nam Định OA + + 8,5 ± 0,8 20 Hàu 3/2017 Thanh Hoá OA + + 8,7 ± 0,9 21 Hàu 4/2016 Thanh Hoá OA - + 7,9 ± 0,6 22 Vẹm 9/2016 Phú Yên OA - + 8,2 ± 0,4 23 Vẹm 12/2016 Phú Yên OA - + 8,7 ± 0,6 Chú thích: “-”: không phát hiện thấy,“+” : phát hiện thấy ở mức thấp hơn LOQ; BR-VT: Bà Rịa - Vũng Tàu Trong 6 địa điểm lấy mẫu, chỉ riêng tại Đà Nẵng (số mẫu lấy là 12 mẫu) không phát hiện thấy mẫu nào có độc tố. Tỷ lệ mẫu nhiễm độc tố cao nhất ở Thanh Hóa (có 12 mẫu trong đó 10 mẫu phát hiện OA và 2 mẫu phát hiện DTX2 trong tổng số 62 mẫu chiếm 19,3 %), rồi tới Nam Định (có 5 mẫu phát hiện OA trong tổng số 42 mẫu chiếm 11,9 %) và Bình Định (có 2