Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang

át hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao. Do đó, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác. Theo Tổ chức Thú y thế giới OIE (2012), chưa có vắc xin đặc hiệu để phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc. Tuy nhiên, vẫn có thể phòng bệnh tiên mao trùng bằng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp. Nhiều loại hóa dược đã được sử dụng để điều trị bệnh tiên mao trùng cho gia súc. Naganin, novarsenobenzol, trypamidium, berenil (azidin)... là những loại hóa dược đã được sử dụng trong nhiều năm ở nước ta nhưng cho kết quả không ổn định. Vì vậy, muốn nâng cao biện pháp điều trị bệnh tiên mao trùng thì cần điều trị bệnh bằng biện pháp tổng hợp, vừa chú ý chăm sóc con vật ốm, vừa dùng một trong những thuốc đặc hiệu mới thu được kết quả tốt (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012). 4 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra trên trâu ở 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa. - Kháng nguyên RoTAT 1.2 của T. evansi. - Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 2.1.2.1. Địa điểm triển khai: tại tỉnh Thái Nguyên và Bắc Giang 2.1.2.2. Địa điểm xét nghiệm mẫu - Đề tài được thực hiện tại các nông hộ ở 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa. - Địa điểm xét nghiệm mẫu: + Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. + Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương. + Khoa Công nghệ sinh học - Viện đại học mở Hà Nội. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2013 - 2017 2.2. Vật liệu nghiên cứu * Các loại mẫu nghiên cứu: Mẫu máu trâu thu thập tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang; Đơn bào T. evansi: phân lập từ máu trâu mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang. * Thiết bị và dụng cụ: Tủ ấm ổn nhiệt; Lò vi sóng: Sanyo (Nhật). Máy PCR (Gen Amp PCR system 9700); Máy phân tích trình 5 tự ADN ABI 3100 - Avant: Applied BioSiences (Mỹ). Máy PCR (Thermo cycle): Bio - Rad (Pháp). Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R): Heraeus (Mỹ). Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320): Thommas Scientific (Mỹ). Máy chụp ảnh Gel - Doc: Dolphin (Mỹ), Tủ lạnh - 20oC, - 80oC; Tủ an toàn sinh học cấp II: Nuaire (Mỹ), xi lanh, kim tiêm, lam kính và lamen... * Hóa chất: Các loại hóa chất do hãng Fementas, Sigma, BioLabs và Applied BioSiences (Mỹ) sản xuất bao gồm: acrylamide, Bis-acrylamide, Tris-HCl, Tris base, Tricine, glycerol, sucrose, ethylene glycol, benzamidine, xanh methylene, X - gal, agarose, peptone, yeast extract, EDTA, PMSF, SDS, APS, TEMED, Tween 20, TMB, IPTG, NaHPO4, NaCl, NaH2PO4, K2HPO4, KH2PO4, NaOH, MgSO4, MgCl2, CaCl2,... * Thuốc điều trị tiên mao trùng: azidin, trypamidium samorin, trypanosoma, cafein natri benzoat 20%, nước sinh lý mặn, vitamin C 5%, vitamin B1 2,5%. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại tỉnh Tuyên Quang. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt. - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ. - Xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang. - Áp dụng phác đồ hiệu quả điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu ở tỉnh Tuyên Quang. 6 2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 2.3.2.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của loài tiên mao trùng T. evansi - Tách ADN tổng số từ tiên mao trùng T. evansi. - Khuếch đại gen RoTAT 1.2 bằng kỹ thuật PCR - Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi. 2.3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi - Tạo dòng vector biểu hiện pET22b (+) mang gen đích RoTAT 1.2. - Chọn dòng mang cấu trúc biểu hiện pET22 - RoTAT 1.2 tái tổ hợp. - Biểu hiện protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp. - Xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli. 2.3.2.3. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng - Nghiên cứu xác định các điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex. - Đánh giá ảnh hưởng của chất nhuộm màu kháng nguyên đến mức độ ngưng kết. - Xác định các điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp. - Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo. - Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit CATT chế tạo để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. - Xác định các điều kiện bảo quản Kit CATT. - Thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. 7 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị - Thu thập mẫu máu trâu ở 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Mẫu được thu thập ngẫu nhiên ở các hộ nuôi trâu. - Xét nghiệm mẫu bằng các phương pháp sau: xem tươi, tiêm truyền chuột nhắt trắng. - Định danh tiên mao trùng bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 18S của tiên mao trùng, đối chiếu hình ảnh bản BLAST với Ngân hàng gen thế giới (genBank) để có kết quả về mức độ tương đồng gen, từ đó xác định được đó là loài tiên mao trùng nào. - Áp dụng 3 phác đồ điều trị trên diện hẹp, mỗi phác đồ điều trị cho 3 trâu. Sau đó, áp dụng 3 phác đồ này trên diện rộng cho trâu nhiễm tiên mao trùng của tỉnh Tuyên Quang để đánh giá hiệu quả. 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 2.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi Từ mẫu máu chuột có chứa T. evansi được phân lập từ trâu bị mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã tiến hành tách ADN tổng số. Kết quả tách ADN tổng số được kiểm tra và đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 của tiên mao trùng được khuếch đại bởi cặp mồi gồm mồi xuôi RoTAT 1.2F: 5’-ATA GAA TTC AGG GGT GTT TAA AGC AA-3’ và mồi ngược RoTAT 1.2R: 5’-AAT GTC GAC TAG TGC GTG TGT TCG-3’. Phản ứng PCR thực hiện với 35 chu kỳ theo các chu trình nhiệt: 95ºC/5 phút, 95ºC/30 giây, 57ºC/30 giây, 72ºC/30 giây. Sau đó phản ứng tiếp tục ở 8 72ºC/5 phút. Sản phẩm PCR được gắn vào vector biểu hiện vector pET22b (+) tại 2 vị trí của enzyme giới hạn EcoRI và SalI để tạo vector tái tổ hợp pET22/RoTAT 1.2. 2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi Hai dòng E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicillin nồng độ 100 µg/ml, ở 37°C trong 12 giờ. Từ dịch nuôi cấy, chúng tôi tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, nuôi cấy lắc trong 4 giờ. Sau 4 giờ bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1 mM. Tiến hành nuôi cấy với tốc độ 115 vòng/phút trong 4 giờ, thu sinh khối, xử lý. Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có SDS, Tricine và phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT 1.2. Với mục đích thu được lượng lớn protein tái tổ hợp RoTAT 1.2, chủng E. coli chứa plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy trong các điều kiện (pH môi trường, nồng độ kháng sinh, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG và thời gian, nhiệt độ cảm ứng) khác nhau để lựa chọn được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất. Sau đó, mẫu được chạy điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra kết quả. Mỗi giếng chạy 10 l mẫu để so sánh sự biểu hiện của gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong các điều kiện khác nhau. 2.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 * Phương pháp tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex để phát bệnh tiên mao trùng Kháng nguyên và hạt latex có bản chất rất khác nhau. Chính vì vậy, để chế tạo được Kit, tiến hành kết hợp thử nghiệm kháng nguyên 9 và hạt latex với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau, ở điều kiện khác nhau. Từ đó, đánh giá và xác định được lượng kháng nguyên - hạt latex và điều kiện phản ứng phù hợp để tạo được phức hợp bền vững nhất. * Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit CATT Gây nhiễm tiên mao trùng T. evansi cho trâu. Kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột để khẳng định trâu nhiễm (+) và không nhiễm (-) tiên mao trùng. Lấy mẫu huyết thanh trâu (+) và (-) để sử dụng Kit, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit. * Phương pháp nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit Tiến hành bổ sung lần lượt các chất ức chế phân giải protein, chất ổn định protein và chất diệt khuẩn và bảo quản Kit ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Sau đó, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng khi sử dụng Kit tại các thời điểm khác nhau. Từ đó, xác định điều kiện phù hợp để bảo quản Kit. 2.4.2.4. Phương pháp thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Thử nghiệm Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên 550 trâu ở các địa phương, sau đó so sánh hiệu quả chẩn đoán của Kit CATT, kỹ thuật ELISA với phương pháp tiêm truyền chuột. Bằng phương pháp tiêm truyền chuột, chúng tôi đã xác định được chính xác trong 550 trâu này có 66 con dương tính, 484 con âm tính với T. evansi. Từ đó, xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính và giá trị dự báo dương tính; so sánh hiệu quả chẩn đoán của các phương pháp trên với phương pháp tiêm truyền chuột. 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện (2008), trên phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Minitab 14.0, các phần mềm tin - sinh học gồm các chương trình ChromasLite, SeqEd1.3, MacVector8.2, GeneDoc2.7 và MEGA6.06. 10 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Bằng phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, chúng tôi đã xác định được tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại Tuyên Quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Địa phƣơng (Huyện) Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các huyện Yên Sơn 257 28 10,89 χ2Yên Sơn, Hàm Yên = 0,684 P = 0,408 χ2 Hàm Yên, Chiêm Hóa = 0,931 P = 0,334 χ2 Chiêm Hóa, Sơn Dương = 1,674 P = 0,196 χ2 Yên Sơn, Sơn Dương = 0,019 P = 0,889 χ2 Hàm Yên, Sơn Dương = 0,286 P = 0,593 χ2 Yên Sơn, Chiêm Hóa = 3,137 P = 0,077 Hàm Yên 264 35 13,26 Chiêm Hóa 252 41 16,27 Sơn Dương 132 15 11,36 Tính chung 905 119 13,15 χ2tính chung = 3,664 P = 0,300 11 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong tổng số 905 trâu kiểm tra tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang có 13,15% số trâu nhiễm tiên mao trùng. Mặc dù tỷ lệ này không cao, song do tính chất nguy hiểm của bệnh tiên mao trùng nên tỷ lệ nhiễm này rất có ý nghĩa trong dịch tễ học của bệnh. 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang Kết quả về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi của trâu trình bày đồ thị hình 3.2. Tỷ lệ nhiễm (%) 6,40 26,36 14,29 10,34 0 5 10 15 20 25 30 ≤ 2 > 2 - 5 > 5 - 8 > 8 (Tuổi) Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi Hình 3.2 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm ở trâu tăng dần theo tuổi. Trâu dưới 2 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ thấp nhất (6,40%), tiếp đến là trâu 2 - 5 năm tuổi (10,34%), trâu 5 - 8 năm tuổi nhiễm với tỷ lệ cao hơn (14,29%), đặc biệt là những trâu trên 8 tuổi tỷ lệ nhiễm rất cao (26,36%). Theo kết quả xử lý thống kê, tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi của trâu sai khác rất rõ rệt. 12 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt Kết quả về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt Tính biệt Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) So sánh tỷ lệ nhiễm giữa trâu đực và trâu cái Đực 536 69 12,87 χ 2 đực, cái = 0,088 P = 0,767 Cái 369 50 13,55 Tính chung 905 119 13,15 Qua kết quả bảng 3.3 cho thấy: Kiểm tra 536 trâu đực có 69 trâu nhiễm tiên mao trùng; trong 369 trâu cái được kiểm tra có 50 trâu bị nhiễm tiên mao trùng. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu đực là 12,87%, tỷ lệ nhiễm ở trâu cái là 13,55%. Theo đó, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu cái cao hơn so với trâu đực. Tuy nhiên, qua xử lý thống kê cho thấy sự sai khác này không rõ rệt (P > 0,05). 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ Kết quả về tỷ lệ nhiễm theo mùa được trình bày ở biểu đồ hình 3.4. 8,21 12,39 14,46 17,21 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Xuân Hè Thu Đông Tỷ lệ nhiễm (%) Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm 13 Biểu đồ hình 3.4 cho thấy, trâu bị nhiễm tiên mao trùng ở cả 4 mùa điều tra và có sự khác nhau giữa các mùa. Mùa xuân, trâu có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (8,21%). Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng tăng dần từ mùa xuân đến hè, thu và cao nhất vào mùa đông (17,21%). 3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang Sau khi phân lập được các chủng tiên mao trùng ký sinh ở trâu nuôi tại 13 xã thuộc 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang, bằng kỹ thuật sinh học phân tử, chúng tôi đã định danh được loài tiên mao trùng gây bệnh. Trên cơ sở các dữ liệu đã thu nhận được, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S của 19 mẫu (bao gồm cả bốn mẫu trong nghiên cứu). Kết quả xây dựng mối quan hệ phả hệ được trình bày ở hình 3.8. T.evansi-DH4-India(KY114580) T.evansi-India(KT023565) T.evansi-Sam-Thailand(AY912269) T.evansi-Cairo-Egypt-Egypt(AB551919) T.evansi-Cairo-Egypt(AB551921) T.evansi-PH1-India(KY114576) T.evansi-PK6-India(KY114578) T.evansi-Cairo-Egypt(AB551920) T.evansi-CB2-India(KY114579) T.evansi-Cairo-Egypt(AB551922) T.evansi-KAI-Thailand(AY912268) T.evansi-B18-Thailand(AY904050) T.evansi-CK5-India(KY114577) T.evansi-Tansui-Taiwan(D89527) T.evansi-Batongtani-Thailand(U75507) TEV-HY-VN TEV-SD-VN TEV-CH-VN TEV-YS-VN66 78 99 96 6766 0.001 Hình 3.8. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide gen 18S của Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN với các mẫu Trypanosoma evansi đã đƣợc đăng ký trong Ngân hàng gen Ghi chú: Ký hiệu (♦) là các mẫu trong nghiên cứu này 14 Hình 3.8 cho thấy: Các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev- SD-VN và Tev-YS-VN đã được định danh chính xác là tiên mao trùng Trypanosoma evansi. 3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 3.1.6.1. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp Để có cơ sở cho việc chọn lựa phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng đạt hiệu quả cao và an toàn, chúng tôi tiến hành điều trị trên diện hẹp cho 9 trâu thí nghiệm. Kết quả được tổng hợp và trình bày tại bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp Phác đồ Số TT trâu Kết quả (-)/(+) Sau 1 - 3 ngày dùng thuốc Sau 4 - 15 ngày dùng thuốc Sau 16 - 25 ngày dùng thuốc Sau 26 - 35 ngày dùng thuốc I 1 + - - - 2 - - - - 3 + - - - II 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - III 1 - - - - 2 + - - - 3 - - - - Kết quả bảng 3.6 cho thấy: Cả 3 phác đồ đều có hiệu lực diệt tiên mao trùng, trong đó, phác đồ II có tác dụng trị tiên mao trùng nhanh và triệt để nhất. Từ sau ngày thứ 4 đến ngày thứ 35 sau điều trị, kiểm tra thấy cả 9 trâu đều sạch tiên mao trùng, không thấy trâu nào có phản ứng cục bộ hoặc toàn thân. 15 3.1.6.2. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng Từ kết quả áp dụng trên diện hẹp, chúng tôi tiến hành áp dụng 3 phác đồ trên diện rộng cho số trâu bị nhiễm tiên mao trùng ở 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng Phác đồ Số trâu điều trị (con) Số trâu (-) sau điều trị (con)* Tỷ lệ (%) I 38 36 94,74 II 42 42 100 III 39 38 97,44 Tính chung 119 116 97,48 Ghi chú: * Kiểm tra không còn tiên mao trùng trong vòng 30 ngày sau điều trị Kết quả bảng 3.7 cho thấy: Thuốc azidin điều trị cho 38 trâu bị nhiễm tiên mao trùng. Sau 30 ngày dùng thuốc, kiểm tra mẫu máu thấy 36/38 trâu không còn tiên mao trùng, hiệu lực đạt 94,74%. Thuốc trypanosoma điều trị 39 trâu bị nhiễm tiên mao trùng có 38/39 trâu sạch tiên mao trùng, hiệu lực điều trị đạt 97,44%. Thuốc trypamidium samorin điều trị cho 42 trâu bị nhiễm tiên mao trùng, hiệu lực điều trị đạt 100%. 3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 3.2.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi 3.2.1.1. Kết quả tách ADN tổng số của T. evansi Từ mẫu máu chuột có chứa T. evansi được phân lập từ trâu bị mắc bệnh tiên mao trùng tại tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã tiến hành tách ADN tổng số. Kết quả tách ADN tổng số được kiểm tra và đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và được ghi lại ở hình 3.9. 16 Hình 3.9 cho thấy, hình ảnh điện di trên gel agarose 1% của ADN tổng số được tách chiết đảm bảo đủ điều kiện để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. 3.2.1.2. Kết quả khuếch đại gen RoTAT 1.2 bằng kỹ thuật PCR Chúng tôi tiến hành khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 phục vụ cho việc tách dòng và biểu hiện gen này trong tế bào vi khuẩn E. coli. Kết quả điện di đồ ở hình 3.10 cho thấy, sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số tách được từ tiên mao trùng đã phân lập có kích thước khoảng 205 bp. Kích thước này là phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen RoTAT 1.2. Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số Ghi chú: (Giếng 1: ADN tổng số tách được; Giếng 2: Marker) Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số Ghi chú: (Giếng 1: marker; Giếng 2, 3: sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số) 17 3.2.1.3. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt đầu bằng vào vector tách dòng pJET1.2/blunt của hãng Fermentas. - Giải trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 đã tạo dòng Plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 được gửi đi xác định trình tự đoạn gen đích tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự đoạn gen trên được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế bằng phần mềm BLAST. Kết quả so sánh cho thấy, trình tự xác định được có độ tương đồng 100% so với các trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T. evansi đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế. Kết quả này khẳng định rằng đoạn gen được gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt chính là đoạn gen đích RoTAT 1.2. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tách dòng thành công gen RoTAT 1.2 mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi. 3.2.2. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi Vector được lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng T. evansi là vector pET22b (+) của hãng Novagen, có chiều dài 5.493 bp. Sản phẩm cắt enzyme của gen RoTAT 1.2 và vector pET22b (+) xuất hiện một băng duy nhất, có kích thước 205 bp và 5,5 kb, tương tự như kích thước lý thuyết của gen RoTAT 1.2 và vector pET22b (+). Kết quả này chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzyme giới hạn EcoRI và SalI có chất lượng tốt và cho phép chúng tôi tiến hành việc nối đoạn gen RoTAT 1.2 vào vector biểu hiện pET22b (+). 18 Sự biểu hiện protein của gen RoTAT 1.2 được khẳng định bằng phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT 1.2. Kết quả lai Western blot được thể hiện ở hình 3.24. Kết quả phản ứng western blot ở hình 3.24 cho thấy: Protein này được nhận biết đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi, vạch phản ứng của protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu với T. evansi tương đương với vạch phản ứng của kháng nguyên hòa tan của T. evansi với kháng thể đặc hiệu. Kết quả này cho phép kết luận rằng, kháng nguyên RoTAT 1.2 đã được chế tạo thành công bằng công nghệ tái tổ hợp gen. * Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli Từ các kết quả thử nghiệm các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi rút ra kết luận: Điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 trong vi khuẩn E. coli là ở 37°C trong thời gian 4 giờ, pH môi trường là 7, vi khuẩn có mật độ OD600 = 0,8; nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 g/ml. Điều kiện cảm ứng IPTG thích hợp để biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 là: nồng độ 0,1 mM, thời gian 5 giờ, nhiệt độ 30°C. 8 kDa 10 kDa Hình 3.24. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 Ghi chú: M: Thang protein chuẩn; 1: Kháng nguyên hòa tan của T. evansi với kháng thể đặc hiệu; 2: Protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu của T. evansi; 3: Đối chứng âm 19 3.2.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 3.2.3.1. Kết quả xác định các điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex Chúng tôi đã làm thí nghiệm với các yếu tố sau: Mật độ hạt latex: sử dụng 5 mật độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5. Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2: 200, 250, 300, 350, 400, 450 và 500 µg/ml. Huyết thanh dương tính chuẩn được lấy từ trâu gây nhiễm T. evansi, pha loãng trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1: 16. Huyết thanh âm tính chuẩn được sử dụng là huyết thanh bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1: 16. Chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex ở điều kiện nhiệt độ 37ºC trong 2 giờ và điều kiện nhiệt độ 37ºC trong 30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC trong 24 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Hàm lượng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 tối ưu trong quá trình tạo Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng là nồng độ 300 µg/ml và mật độ hạt latex: OD600= 0,3. Kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn lên hạt latex tốt nhất ở điều kiện lắc ở 37ºC trong 30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC trong thời gian 24 giờ. 3.2.3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chất nhuộm màu kháng nguyên đến mức độ ngưng kết Việc lựa chọn chất nhuộm màu phản ứng là một trong những bước quan trọng để kết quả phản ứng dễ dàng quan sát được. Các chất nhuộm màu kháng nguyên dùng trong nghiên cứu là xanh methylene, xanh malachite và safranin 0,5%. Kết quả thí nghiệm cho thấy, chất tạo màu phản ứng xanh methylene cho hiệu quả quan sát tốt nhất và là lựa chọn tối ưu để sử dụng cho bộ Kit CATT chẩn đoán tiên mao trùng. 3.2.3.3. Kết quả xác định các điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp Kháng nguyên tái tổ hợp có bản chất là protein. Vì vậy, để bảo quản kháng nguyên này cần phải xác định các điều kiện bảo quản protein, nhằm đảm bảo chất lượng kháng nguyên. 20 Kết quả thử nghiệm lựa chọn các chất ức chế phân giải, chất ổn định protein và chất diệt khuẩn ở các nhiệt độ - 20oC, 4oC, nhiệt độ phòng cho phép chúng tôi nhận xét: Điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp là: bổ sung EDTA, glycerol, sodium azide 0,02% và bảo quản trong 12 tháng ở - 20oC, hoặc trong 6 tháng ở 4oC. 3.2.3.4. Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo Chúng tôi đã nghiên cứu và đã xây dựng được quy trình sử dụng Kit CATT gồm 6 bước sau: Chuyển Kit về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng; Sử dụng pipette, lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết thanh vào ống eppendorf; Lấy 0,1 ml huyết thanh cần chẩn đoán trộn đều vào ống eppendorf có chứa dung dịch pha loãng huyết thanh, pha loãng theo tỷ lệ 1/32; Nhỏ lên các vòng tròn trên card phản ứng, mỗi vòng tròn 20 µl dung dịch kháng nguyên gắn lên hạt latex; Nhỏ các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán, huyết thanh dương tính chuẩn, huyết thanh âm tính chuẩn lần lượt vào các vòng tròn đã chứa kháng nguyên. Mỗi vòng tròn nhỏ 20 µl dung dịch huyết thanh (huyết thanh cần chẩn đoán, hoặc huyết thanh dương tính chuẩn, hoặc huyết thanh âm tính chuẩn)