Tóm tắt Luận án Phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại Việt Nam

Luận án gồm 142 trang: Đặt vấn đề 2 trang, tổng quan tài liệu 33 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 29 trang, kết quả nghiên cứu 49 trang, bàn luận 27 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang. Luận án có 35 bảng, 41 hình, 194 tài liệu tham khảo tiếng Anh, 20 phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Niêm khuẩn thuộc ngành Myxococcota, bộ Myxococcales, thuộc Deltaproteobacteria, là vi khuẩn gram âm, di chuyển bằng cách trượt. Niêm khuẩn có các đặc tính quan trọng là hình thành thể quả chứa các bào tử trong điều kiện môi trường khan hiếm chất dinh dưỡng và ly giải tế bào vi sinh vật khác và phân giải các đại phân tử sinh học. Niêm khuẩn phân bố trong đất, thực vật 4 phân hủy, vỏ cây sống hoặc mục nát, môi trường biển, phân của nhiều loài động vật ăn cỏ. Niêm khuẩn đã được chứng minh là nguồn đầy triển vọng trong tổng hợp các phân tử sinh học với phổ hoạt tính rộng như kháng sinh, kháng sốt rét, kháng virus, ức chế miễn dịch, kháng ung thư, diệt côn trùng. Đến 2011, khoảng 100 cấu trúc gốc và 600 cấu trúc biến thể được tìm ra từ niêm khuẩn. Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm chiếm lần lượt 54% và 29% tổng số các chất phân lập được, khoảng 10% hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư. Hiện nay, các nghiên cứu ở Việt Nam về niêm khuẩn khá hạn chế, đó là tiền đề cho việc xác lập và thực hiện đề tài này. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu Niêm khuẩn được phân lập từ các mẫu đất thu thập tại 20 tỉnh/ thành phố của Việt Nam: Quảng Trị, Thanh Hóa, Ninh Bình, Bình Định, Bình Thuận, Gia Lai, Phú Yên, An Giang, Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu, Cần Thơ, Đồng Nai, Hậu Giang, Hồ Chí Minh, Long An, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh và Vĩnh Long. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập niêm khuẩn Thu thập mẫu đất: Mẫu đất được thu thập từ những khu vực ít chịu sự tác động của con người, vị trí cạnh gốc cây to có bóng râm, có vỏ thân cây mục nát, gần rơm rạ, cách bề mặt khoảng 10 cm. Sau khi lấy, đất được làm khô càng sớm càng tốt 5 Phương pháp phân lập: Phương pháp dùng mồi E. coli trên thạch WCX, phương pháp dùng giấy lọc và dùng phân thỏ Làm thuần: Cấy chuyển thể quả và mép lan của khuẩn lạc nhiều lần trên môi trường VY/2 bằng kim vô trùng; kỹ thuật dùng mồi lần hai. Kiểm tra độ tinh khiết bằng môi trường CEH. 3.2.2. Định danh niêm khuẩn  Đặc điểm hình thái  Thử nghiệm đặc trưng niêm khuẩn (Chuyển động trượt và khả năng ly giải vi sinh vật sống) và thử nghiệm sinh hóa (Kit API Zym và các phản ứng sinh hóa khác)  Phân tích trình tự 16S rDNA (Chiết tách DNA bộ gen và khuếch đại với cặp mồi 27F và 1492R)  Phân tích phát sinh loài: phần mềm MEGA phiên bản 11, chương trình Muscle, phương pháp Maximum likelihood với mô hình Jukes-Cantor và bootstrap 1.000 lần. 3.2.3. Lên men thu cao chiết các chủng niêm khuẩn Lên men trong 400 mL môi trường P, lắc 160 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày, bổ sung 1,5% nhựa Amberlite XAD-16N vào ngày thứ 4. Kết thúc lên men thu hồi nhựa, giải hấp bằng hỗn hợp aceton và methanol. Bay hơi dung môi áp suất giảm, thu cao chiết lỏng. 3.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Sử dụng phương pháp DPPH và ABTS với acid ascorbic và Trolox dược sử dụng làm chứng dương. Xác định giá trị IC50 và tỉ lệ IC50 (thử)/ IC50 (chứng). Mối tương quan giữa 2 thử nghiệm được đánh giá bằng hệ số tương quan R (correlation coefficient). 6 3.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật Sử dụng phương pháp vi pha loãng xác định MIC. 3.2.6. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư Sử dụng phương pháp MTT trên dòng tế bào MDA-MB-231, HepG2, MCF7 và tế bào không ung thư Hek293 và 3T3. Xác định giá trị IC50. Doxorubicin được sử dụng làm chứng dương. 3.2.7. Lên men thu cao toàn phần chủng tiềm năng Tương tự mục 3.2.3. 3.2.8. Phân tích hợp chất thứ cấp bằng sắc ký lỏng kết hợp khối phổ Phân bố lỏng – lỏng cao toàn phần thành các phân đoạn. Xác định phân đoạn tiềm năng dựa trên hoạt tính gây độc dòng tế bào MDA-MB-231 bằng phương pháp MTT). Phân đoạn có hoạt tính cao được phân tích bởi hệ thống LC-ESI-QTOF-MS. Số khối của các mảnh ion tựa phân tử [M+H]+ được tải lên chemcalc.org để tạo công thức phân tử. Giá trị m/z cho các ion [M+H]+ (dự đoán) và ion ghi nhận từ sắc ký đồ được so sánh với sai số ± 5 ppm hoặc ± 3 mDa. 3.2.9. Phân lập hợp chất tinh khiết Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột nhanh, sắc ký cột bán điều chế. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC. 3.2.10. Xác định cấu trúc hợp chất Phương pháp phổ UV-Vis, phổ FT-IR, phổ MS, phổ NMR. 3.2.11. Tối ưu hóa môi trường lên men sản xuất althiomycin từ chủng tiềm năng Thiết kế Plackett-Burman được sử dụng để sàng lọc các yếu 7 tố ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng althiomycin. Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), mô hình Box-Behnken được sử dụng để xác định giá trị tối ưu của các yếu tố này. Cuối cùng, tiến hành đánh giá lại mô hình tối ưu trên thực nghiệm. Althiomycin được định lượng bằng phương pháp HPLC. 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Phân lập niêm khuẩn Từ 138 chủng niêm khuẩn phân lập, thu được 43 chủng niêm khuẩn thuần chủng khác nhau, trong đó, có 15 chủng (34,9%) phân lập bằng phương pháp dùng mồi E. coli, 16 chủng (37,2%) phân lập bằng phân thỏ và 12 chủng (27,9%) phân lập bằng giấy lọc. 4.2. Định danh niêm khuẩn Dựa trên các dữ kiện hình thái đã có, 10 chủng niêm khuẩn được phân loại đến họ, 22 chủng phân loại đến chi, chủ yếu thuộc 2 chi Myxococcus và Corallococcus và có 11 chủng phân loại đến loài. Thử nghiệm đặc trưng và phản ứng sinh hóa: Các chủng đều thể hiện chuyển động trượt và khả năng ly giải tế bào E. coli. Thử nghiệm API Zym cho thấy tất cả các chủng đều dương tính với phosphatase kiềm, phosphatase acid và catalase. Kết quả khảo sát sinh hóa cho thấy sự phù hợp giữa kết quả định danh sơ bộ bằng hình thái với dữ liệu sinh hóa. Trình tự 16S rDNA: 43 chủng được phân loại vào 7 chi, trong đó, 24 chủng được định danh đến mức độ loài, 19 chủng còn lại được định danh ở mức độ chi (Bảng 4.1). 8 Bảng 4.1. Định danh 43 chủng niêm khuẩn Chi (số loài đã phân lập) Phương pháp phân lập Loài Số chủng Tương đồng (%) Ký hiệu chủng Angio- coccus (1) 1W A. disciformis 1 99,86 DN11 Archan- gium (3) 1R, 1W, 1F A. gephyra 2 99,93- 100,0 BP181, QT15 A. disciforme 1 100,00 TV11 Chondro- myces (2) 1W, 1F C. apiculatus 1 100,00 HCM21 C. pediculatus 1 100,00 BRVT1 Corallo- coccus (15) 5R, 8W, 2F C. coralloides 4 99,78- 100,00 AG11, LA43, LA44, TV51 Corallo- coccus sp. 11 99,86- 100,00 BDi23, BT92, BT101, DN23, GL43, PY1, QT72, ST11, TH41, TV22, VL32 Cysto- bacter (1) 1R Cystobacter sp. 1 99,71 LA41 Melittan- gium (1) 1F M. boletus 1 100,00 BDi22 Myxo- coccus (20) 9R, 4W, 7F Myxococcus sp. 7 99,65- 100,00 BP182, CT21, HG225, NB83, TG23, TH48, TH52 M. fulvus 7 99,93- 100,00 BP161, BP213, DN21, NB71, NB81, TG131, VL25 M. stipitatus 5 99,86- 100,00 BD2, BT43, GL41, HG223, VL21 M. virescens 1 99,93 HCM81 Tổng 43 Ghi chú: F: phương pháp giấy lọc; R: phương pháp dùng phân thỏ; W: phương pháp dùng mồi E. coli trên thạch WCX. Kết quả định danh dựa vào trình tự 16S rDNA cho kết quả tương đồng với đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa. 9 4.2.1. Phân tích phát sinh loài Phân tích cũng cho thấy 41/43 chủng phân lập thuộc họ Myxococceae và Cystobacteraceae của phụ bộ Cystobacterineae. Chỉ có hai chủng Chondromyces thuộc họ Polyangiaceae, Sorangiineae (Hình 4.1). Hình 4.1. Cây phát sinh loài 57 chủng niêm khuẩn 10 4.3. Sàng lọc hoạt tính sinh học 4.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa Cao chiết của 43 chủng niêm khuẩn có khả năng trung hòa 50% gốc tự do DPPH• và ABTS+•. Kết quả phân tích sự tương quan cho thấy mối tương quan mạnh (R = 0,892) giữa hoạt tính kháng oxy hóa đo lường bằng phương pháp ABTS và DPPH. Dịch chiết TH41 thể hiện IC50 thấp nhất trong phương pháp DPPH với giá trị IC50 là 27,39 ± 1,74 μg/mL (tỉ lệ IC50 = 2,51) và trong phương pháp ABTS là 65,37 ± 3,61 μg/mL (tỉ lệ IC50 = 8,52), theo sau là dịch chiết từ chủng CT21, TG131 và GL41. 4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật Tất cả các dịch chiết đều có hoạt tính ức chế ít nhất 1/10 vi sinh vật thử nghiệm với MIC từ 1-512 μg/mL. Nhìn chung, tính nhạy cảm của vi khuẩn gram dương trên cao chiết từ niêm khuẩn tốt hơn so với vi khuẩn gram âm và trên nấm sợi tốt hơn so với nấm men C. albicans. Cao chiết chủng GL41 có hiệu quả ức chế cao nhất đối với MRSA, MSSA, S. faecalis, C. albicans và A. niger (MIC = 1 μg/mL), thấp hơn so với chứng dương (amikacin, fluconazol), đặc biệt là trên MRSA, MSSA, S. faecalis và C. albicans. 4.3.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư Bảy cao chiết BD2, BDi22, CT21, GL41, HCM81, HG225 và VL25 thể hiện tỉ lệ (%) ức chế tế bào MDA-MB-231 cao nhất đều có IC50 thấp hơn 25 µg/mL. Giá trị IC50 của cao chiết chủng GL41 là thấp nhất (6,25 ± 0,07 µg/mL), tiếp theo là chủng CT21. 11 4.4. Chủng niêm khuẩn tiềm năng M. stipitatus GL41 Chủng M. stipitatus GL41 sở hữu hoạt tính sinh học tiềm năng được lựa chọn là đối tượng nghiên cứu tiếp theo. 4.4.1. Đặc điểm chủng niêm khuẩn GL41 Chủng GL41 cho khuẩn lạc 4-5 cm có cạnh hình ngọn lửa, tạo sắc tố cam/hồng nhạt,; thể quả là khối chất nhờn hình cầu hoặc bầu dục màu trắng, hồng hoặc cam rất nhạt, riêng lẻ, 100- 600 µm, có thể có cuống ngắn; tế bào sinh dưỡng gram âm, hình que, 0,4-1,0 × 3-8 µm; myxospore hình cầu hoặc que ngắn tập trung thành cụm. Thử nghiệm sinh hóa: dương tính với phosphatase kiềm, esterase (C4), esterase lipase (C8), lipase (C14), cystin arylamidase, phosphatase acid và naphthol-AS-BI phosphohydrolase, catalase, urease và tinh bột dương tính. Trình tự 16S rDNA có số đăng ký ON076907 trên NCBI, tương đồng cao (99,3%) với Myxococcus stipitatus. Phân tích phát sinh loài cho thấy chủng GL41 được phân nhóm vào nhánh chung với chủng tham chiếu M. stipitatus DSM 14675 và tách khỏi các loài khác như M. fulvus ATCC 25199, M. xanthus DSM 435 và M. virescens DSM 4946. 4.4.2. Lên men thu cao toàn phần 8,7 g cao toàn phần được phân đoạn thành: 0,6 g cao n-hexan, 1,8 g cao chloroform, 2,1 g cao ethyl acetat và 3,06 g cao nước. Trong đó, phân đoạn EtOAc thể hiện hoạt tính ức chế tế bào MDA-MB-231 cao nhất. 12 4.4.3. Phân tích hợp chất thứ cấp trong cao ethyl acetat bằng sắc ký lỏng kết hợp khối phổ Dựa trên giá trị m/z của các ion [M+H]+, đề xuất 5 chất tương tự các cấu trúc đã biết gồm myxalamid C, myxochelin A, althiomycin, myxothiazol và DKxanthen-518 và 9 chất chưa xác định với số khối ion [M+H]+ dao động từ 332,1930 đến 815,5858 m/z. 4.4.4. Phân lập và tinh khiết hợp chất 4.4.4.1. Hợp chất C3 Hợp chất C3 là chất bột vô định hình màu trắng; Phổ UV: đỉnh cực đại ở 222, 242 và 285 nm trong methanol Phổ HR-ESI-MS: 422,0563; 440,0672 và 462,0483 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 3,39 (1H, m); 3,59 (1H, m); 3,81 (2H, m); 3,88 (3H, s); 4,33 (2H, m); 4,88 (1H, m); 5,07 (1H, m); 5,43 (1H, d, J = 2,5 Hz); 6,16 (1H, dq, J = 8,5; 1,0 Hz); 8,35 (1H, s); 8,38 (1H, s); 8,42 (1H, dd, J = 18,0, 9,0 Hz); 12,23 (1H, s)  Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 34,6 (C-9); 48,0 (C-15); 53,9 (C-6); 59,2 (C-16); 62,2 (C-7); 78,0 (C-10); 94,4 (C-13); 125,3 (C-3); 143,2 (C-1); 149,7 (C- 4); 159,8 (C-5); 162,6 (C-2); 168,3 (C-11); 169,6 (C-12); 173,3 (C-8); 177,2 (C-14) 13 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất C3 Từ dữ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C3 là althiomycin, (C16H17N5O6S2), kháng sinh thuộc dẫn chất thiazol (Hình 4.2). 4.4.4.2. Hợp chất C7 Hợp chất C7 là chất bột vô định hình màu trắng Phổ UV: đỉnh cực đại ở bước sóng 238, 312 nm trong acetonitril-nước (1:1, tt/tt) Phổ HR-ESI-MS: 173,0710 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 7,67 (1H, dt, J = 7,5; 1,0 Hz); 7,74 (1H, d, J = 4,5 Hz); 7,81 (1H, dt, J = 7,0; 1,5 Hz); 8,07 (1H, d, J = 8,5 Hz); 8,30 (1H, d, J = 8,5 Hz); 8,84 (1H, s); 8,93 (1H, d, 4,5 Hz)  Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 119,4 (C-3); 124,6 (C-4a); 124,8 (C-5); 127,2 (C-6); 129,5 (C-7); 129,6 (C-8); 136,6 (C-4); 146,3 (-CH=N-OH); 148,3 (C- 8a); 150,3 (C-2) Từ dữ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C7 là 4- quinolylaldoxim, với công thức phân tử là C10H8N2O (Hình 4.3). 14 (a) (b) Hình 4.3. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất C7 (a) và C8 (b) 4.4.4.3. Hợp chất C8 Hợp chất C8 là tinh thể hình kim không màu (hơi ngả vàng) Phổ UV: đỉnh cực đại ở bước sóng 244, 260 và 298 nm trong acetonitril-nước (1:1, tt/tt) Phổ HR-ESI-MS: 146,0599 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 7,21 (1H, dt, J = 7,5; 1,0 Hz); 7,26 (1H, d, J = 7,5; 1,5 Hz); 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz); 8,09 (1H, d, J = 7,5 Hz); 8,28 (1H, s); 9,94 (1H, s); 12,12 (1H, s)  Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 112,4 (C-7); 118,2 (C-3); 120,8 (C-4); 122,1 (C-5); 123,4 (C-6); 124,1 (C-3a); 137,0 (C-7a); 138,4 (C-2); 184,9 (C-8) Từ dữ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C8 là indol-3- aldehyd, với công thức phân tử là C9H7NO (Hình 4.3). 4.4.5. Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập Giá trị MIC của althiomycin trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm MRSA, MSSA, S. faecalis, E. coli và P. aeruginosae lần 15 lượt là 4, 4, 16, 32 và 512 µg/mL. Khả năng ức chế vi khuẩn gram dương (MIC từ 4-16 µg/mL) tốt hơn so với vi khuẩn gram âm (MIC từ 32 và 512 µg/mL). Hợp chất này không thể hiện hiệu quả kháng nấm C. albicans và nấm mốc trong khoảng nồng độ khảo sát. Giá trị IC50 của althiomycin trên các dòng tế bào đều lớn hơn 100 µM. 4-quinolylaldoxim chế 10 chủng vi sinh vật thử nghiệm ở nồng độ khảo sát < 512 µg/mL. Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn kháng nấm men và nấm sợi. Cụ thể, khả năng ức chế MRSA, MSSA và E. coli tốt hơn so với cao toàn phần với giá trị lần lượt là 0,5, 1 và 2 µg/mL, hoạt tính kháng S. faecalis tương đương chứng dương amikacin và có cùng giá trị IC50 với althiomycin trên chủng P. aeruginosa. 4-quinolylaldoxim có hoạt tính ức chế HepG2 và MDA-MB-231 yếu (lần lượt là 83,05 ± 18,43 và 93,38 ± 14,18 µM). Indol-3-aldehyd có hoạt tính kháng nấm sợi yếu đến trung bình với MIC ≥ 64 µg/mL, hoạt tính kháng khuẩn và nấm men C. albicans trung bình (MIC từ 32-64 µg/mL) trừ kháng P. aeruginosa yếu (MIC = 128 µg/mL), giá trị MIC thấp nhất trên MRSA, MSSA và C. albicans với MIC = 32 µg/mL. Indol-3- aldehyd có hoạt tính kháng ung thư trung bình, với IC50 trên dòng tế bào MDA-MB-231 và 3T3 lần lượt là 42,89 ± 6,23 và 51,39 ± 5,90 µM, không có hoạt tính trên tế bào HepG2, MCF7 và Hek293. 16 4.4.6. Tối ưu hóa môi trường lên men chủng GL41 sản xuất althiomycin Do hoạt tính kháng trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm chỉ đạt mức trung bình hoặc kém, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn của 3 chất phân lập lại có tiềm năng. Vì vậy, chúng tôi tối ưu hóa thành phần môi trường lên men chủng M. stipitatus GL41 nhằm cải thiện năng suất thu nhận althiomycin - là chất có hoạt tính kháng khuẩn cao tốt và có lượng đủ nhiều để làm chất đối chiếu khi định lượng althiomycin trong dịch nuôi cấy. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng: Thí nghiệm được thiết kế với 11 yếu tố và 12 thí nghiệm. Chuẩn bị môi trường với các thành phần theo ma trận đề xuất, lên men thu dịch chiết và sử dụng để định lượng althiomycin, thu giá trị thực nghiệm. Phân tích thống kê kết quả định lượng althiomycin cho thấy 3 yếu tố gồm tinh bột tan (X1), men bánh mì (X2) và đệm hepes (X8) có giá trị ảnh hưởng dương và đáng kể đến diện tích pic althiomycin trên sắc ký đồ (APA, mAU.s) ở độ tin cậy 95%. Do đó, các yếu tố này được chọn để tối ưu hóa tiếp theo bằng thiết kế thí nghiệm RSM. Tối ưu hóa công thức môi trường lên men: Chuẩn bị môi trường của 15 thí nghiệm nuôi cấy M. stipitatus GL41 trong mô hình Box - Behnken. Phân tích phương sai (ANOVA) ghi nhận giá trị p = 0,0001, f = 88,96, R2 = 0,9889, cho thấy mô hình hồi quy có ý nghĩa thống kê. Các biến số A, B, C, AB, A2, B2 và C2 tương ứng với tinh bột tan (A), men bánh mì (B) và hepes (C) có giá trị "Prob > f" < 0,05, cho thấy tinh bột tan, men bánh mì và hepes cũng như sự tương tác giữa tinh bột tan và men bánh mì là 17 đáng kể (Hình 4.2). Phần mềm Design Expert® 11.0.0. phân tích các dữ liệu về diện tích pic tín hiệu althiomycin phù hợp với mô hình bậc 2: APA (mAU.s) = -1769,68 + 370,80A + 189,63B + 154,27C +12,04AB  33,60A2  36,92B2  3,71C2 Với APA là diện tích pic của althiomycin (mAU.s), A, B và C lần lượt là nồng độ tinh bột tan, men bánh mì và hepes (g/L). (a) (b) Hình 4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến APA Đường biểu diễn 2D (a) và bề mặt đáp ứng 3D (b) thể hiện sự tương tác giữa tinh bột tan (A) và men bánh mì (B) trên APA Với hàm mục tiêu là APA đạt cực đại, phần mềm Design Experts dự đoán các thông số tối ưu: nồng độ tinh bột tan là 6,09 g/L, nồng độ men bánh mì là 4,05 g/L và nồng độ đệm hepes là 20,65 g/L. Đánh giá lại mô hình tối ưu trên thực nghiệm cho thấy độ tương thích giữa mô hình tính toán và trên thực nghiệm bằng 96,4%, chứng tỏ mô hình tương thích tốt với thực nghiệm. Đường chuẩn ước tính nồng độ althiomycin (µg/mL) là y = 7,669x  1,215. Trong đó, y là APA (mAU.s) và x là nồng độ althiomycin (µg/mL). Theo đó, tính toán được nồng độ althiomycin trong dịch chiết là 3,3 mg/L, cao gấp 4,7 lần so với B: Men bánh mì B: Men bánh mì A: Tinh bột tan A: Tinh bột tan 18 môi trường P ban đầu (0,7 mg/L). 5. BÀN LUẬN 5.1. Phân lập niêm khuẩn Ba phương pháp phân lập đều có đặc điểm chung là sử dụng chất nền tối thiểu nhằm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật khác không mong muốn, đồng thời vẫn cung cấp nguồn hữu cơ đặc trưng, chọn lọc cho niêm khuẩn, từ đó kích thích bào tử nảy mầm, phát triển khóm lan rộng trên môi trường và sau đó tạo thành thể quả. Phương pháp dùng phân thỏ có một số khó khăn như (1) thời gian ủ khá dài, (2) lượng đất nhiều tỉ lệ với mật độ các vi sinh vật ngoại nhiễm khá cao, (3) nguồn phân thỏ tự nhiên không sẵn có. Kết hợp tiền xử lý đất bằng nhiệt và dùng hỗn hợp kháng nấm, sự phát triển của nấm mốc được kiểm soát, tạo điều kiện các chủng niêm khuẩn hình thành thể quả và được tách ra. Nhờ vậy, hiệu suất phân lập phương pháp này khác biệt rõ rệt so với các nghiên cứu trước đây. Phương pháp giấy lọc đòi hỏi thời gian ủ dài (2-4 tuần) làm mẫu bị ngoại nhiễm nên số chủng phân lập từ phương pháp này chiếm tỉ lệ thấp nhất (27,9%). Từ kết quả đề tài và so sánh dữ liệu công bố, chúng tôi đề xuất áp dụng cả 3 phương pháp để tối đa hóa và đa dạng hóa số chủng niêm khuẩn có thể phân lập được. Tỉ lệ phân lập trung bình cao (2,2) cho thấy sự phong phú hệ niêm khuẩn trong đất ở nước ta. Tỉ lệ làm thuần thấp (0,3) có thể do (i) các chủng niêm khuẩn giống nhau trong cùng 1 mẫu đất; (ii) quá trình phân lập - thuần chủng bị gián đoạn bởi dịch Covid- 19 và (iii) sự tương đồng hình thái giữa vi khuẩn khác với niêm 19 khuẩn. Không có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu đất phân lập từ 3 miền và loại đất. Đồng thời, không có tương quan rõ ràng giữa loại đất và phương pháp phân lập với các chi niêm khuẩn phân lập được. 5.2. Định danh niêm khuẩn Hiện nay, đặc điểm hình thái học dùng để phân loại phụ bộ gần như không thay đổi. Ở cấp độ chi và loài, sắc tố, hình dạng của thể quả, hình dạng và kích thước của túi bào tử được xem là các thông số quyết định để phân loại. Tuy nhiên, thể quả có thể bị thay đổi hình dạng và cấu trúc, thoái hóa hoặc mất trong quá trình nuôi cấy. Phân loại dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hóa là khó khăn rất lớn khi cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh lý và sinh hóa chưa đáp ứng yêu cầu. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu để xây dựng cây phát sinh loài. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, trình tự 16S rDNA cũng không thể định danh niêm khuẩn đến mức độ loài. Vì ở hầu hết các chi, sự khác biệt trong trình tự gen 16S rDNA giữa các loài là rất nhỏ. Chúng tôi đề xuất có thể dựa vào hình thái và trình tự gen về cơ bản đáp ứng các tiêu chí phân loại và định danh niêm khuẩn. Kết quả định danh cho thấy 43 chủng phân lập thuộc 10 loài, đều nằm trong 30 loài niêm khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất trên thế giới. Nghiên cứu không phân lập được các chi Polyangium, Sorangium và Nannocystis vì thể quả các chi này thường chìm trong giấy lọc phân hủy, khó làm thuần. Tuy nhiên, nghiên cứu đã phân lập được loài ít gặp Chondromyces 20 apiculatus; loài hiếm Chondromyces pediculatus và Melittangium boletus. Như vậy, việc phân lập được các loài thuộc phổ loài phổ biến trong tự nhiên cho thấy điều kiện lấy mẫu, phân lập và làm thuần trong nghiên cứu này là phù hợp và đáp ứng yêu cầu của đề tài, đồng thời việc phân lập được các loài hiếm đã thể hiện sự đa dạng trong phân bố niêm khuẩn trong môi trường đất ở nước ta, và hứa hẹn phổ loài đa dạng hơn nếu mở rộng vùng lấy mẫu trên khu vực địa lý khác nhau. 5.3. Hoạt tính sinh học của niêm khuẩn Các chủng niêm khuẩn đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật và kháng ung thư ở các mức độ khác nhau và tùy thuộc vào nồng độ. Niêm khuẩn có khả năng tổng hợp hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm giúp chúng cạnh tranh với hệ vi sinh vật trong tự nhiên. 5.4. Chủng tiềm năng Myxococcus stipitatus GL41 Phân tích dữ liệu số khối (m/z) của các ion [M+H]+, dự đoán được 5 đỉnh chất chuyển hóa thứ cấp. Sự hiện diện các hợp chất này đề xuất khả năng kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật và kháng ung thư của dịch chiết chủng GL41. Ngoài ra, 9 hợp chất chưa xác định được công thức hoá học cũng có thể là những thành phần đóng góp vào hoạt tính sinh học của cao chiết chủng GL41. Các hợp chất tinh khiết đã phân lập: Hợp chất althiomycin: Althiomycin từng được phân lập từ xạ khuẩn và niêm khuẩn, tuy nhiên, đây là lần đầu tiên được phân lập từ M. stipitatus. Hoạt tính kháng vi sinh vật thấp hơn so với cao chiết toàn phần, hoạt tính kháng nấm kém hơn kháng khuẩn. 21 Althiomycin không thể hiện hoạt tính ức chế trên cả dòng tế bào ung thư và tế bào thường (IC50 > 100 µM). Như vậy, althiomycin là tác nhân tiềm năng cho hoạt tính kháng vi sinh vật vì hoạt tính ức chế chọn lọc trên tế bào prokaryot nhưng không ảnh hưởng đến tế bào eukaryot và có thể nghiên cứu sâu để phát triển thành một kháng sinh sử dụng trên lâm sàng. Hợp chất 4-quinolylaldoxim: Đây là nghiên cứu đầu tiên phân lập được 4-quinolylaldoxim từ M. stipitatus. Bettina Böhlendorf và cộng sự (1996) đã chứng minh 4-quinolylaldoxim được tổng hợp bởi quá trình chuyển hóa của niêm khuẩn, không phải là thành phần hữu cơ từ môi trường nuôi cấy. 4- quinolylaldoxim thể hiện hoạt tính kháng nấm trung bình đến yếu, hoạt tính kháng khuẩn mạnh, hoạt tính kháng ung thư trung bình và tùy thuộc vào từng dòng tế bào cụ thể. Do đó, cần nghiên cứu thêm để xác định ngưỡng hiệu quả và liều gây độc trên các dòng tế bào khác nhau. Hợp chất indol-3-aldehyd: Đây là nghiên cứu đầu tiên phân lập được indol-3-aldehyd từ niêm khuẩn. Indol-3-aldehyd có khả năng kháng khuẩn (trừ P. aeruginosa) và C. albicans trung bình và hoạt tính kháng nấm sợi khá yếu. Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư cao hơn 4-quinolylaldoxim trên dòng tế bào MDA-MB- 231 và 3T3, cho thấy khả năng gây độc tế bào tùy thuộc từng dòng tế bào cụ thể. Theo các nghiên cứu về hiệu quả của hợp chất này, thách thức lớn nhất đặt ra là tính an toàn, theo đó, các nghiên cứu đầu tiên tập trung vào dạng phân phối tại chỗ indol-3- aldehyd nhằm cải thiện tính chọn lọc và hạn chế tác dụng phụ. 22 Như vậy, đánh giá lại hoạt tính và độc tính indol-3-aldehyd là cần thiết, đồng thời vẫn cần xác định liệu indol-3-aldehyd có tiếp tục chuyển hóa thành các phân tử khác khi vào cơ thể hay không. 5.4.1. Tối ưu hóa môi trường lên men chủng GL41 sản xuất althiomycin Kết quả phân tích thống kê ANOVA của thiết kế sàng lọc Plackett-Burman và mô hình tối ưu hóa Box-Behnken ghi nhận giá trị p α0,05 cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê và phù hợp với các kết quả từ thực nghiệm. Tinh bột là nguồn carbon và năng lượng quan trọng trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự tổng hợp các chất kháng sinh thường tăng dần ở giai đoạn bước vào pha ổn định của đường cong tăng trưởng, khi chất dinh dưỡng giảm và sự tăng trưởng tế bào chậm lại, tức là giai đoạn tinh bột được tiêu thụ. Men bánh mì bổ sung peptid và acid amin cho nguồn nitơ, carbon và năng lượng cần thiết cho sự phát triển của hầu hết các chủng niêm khuẩn. Quá trình chuyển hóa dẫn đến sự tích lũy lượng amoniac lớn và kìm hãm sự tăng trưởng