Tóm tắt Luận án Sử dụng thịt đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus Vannamei) để chế biến chế phẩm giàu Protein

xử lý chất thải hay làm công đoạn tiền xử lý nguyên liệu cho quá trình chế biến tiếp theo. Ngô Thị Hoài Dương và ctv. (2008) đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền xử lý bằng axit formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu lượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học (sử dụng bromelanin trong dịch ép vỏ dứa); Phan Thị Bích Trâm và Phạm Thu Cúc (2004) xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Trịnh Ngọc Vinh (2006) tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp giúp quá trình lên men được nhanh hơn, tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lượng cao hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô nhiễm môi trường. Bùi Xuân Đông và Phạm Thị Mỹ (2017) tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ vỏ đầu tôm bằng enzyme alcalase ứng với nhiệt độ môi trường, pH môi trường, tỷ lệ enzyme và cơ chất, thời gian phản ứng enzyme lần lượt là 55oC; 8; 1,5% và thời gian 80 phút thu được hiệu suất thu hồi đạm là 61,28±0,5% được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi. Với phần thịt từ đầu tôm sú chiếm khoảng 15% khối lượng đầu tôm nguyên, khi bổ sung với thịt tôm thứ phẩm theo tỷ lệ 30% thịt đầu và 70% thịt tôm thứ phẩm tạo được khối paste có cấu trúc không khác biệt so với paste được chế biến từ tôm thịt thứ phẩm (Nguyễn Văn Mười và ctv., 2013). Tận dụng nguồn protein này trong chế biến thực phẩm đã mở ra hướng mới trong việc nâng cao giá trị thương phẩm của tôm sú ở đồng bằng sông Cửu Long. Nguyễn Văn Mười và ctv. (2014) đã nghiên cứu chế biến và bảo quản bột thịt đầu tôm sú. Một nghiên cứu tận thu chế phẩm enzyme protease và ứng dụng nó thủy phân hai đối tượng cũng là phế liệu chế biến thủy sản là hỗn hợp máu, gan cá basa và đầu, vỏ tôm (Nguyễn Lệ Hà, 2011), Trần Thanh Trúc và ctv. (2015) 8 thu được sản phẩm dịch thủy phân thịt đầu tôm sú bằng enzyme thương mại alcalase đã xác định được 14 axit amin. Điểm qua tình hình nghiên cứu thực tế hiện nay, có thể thấy rằng việc thu hồi protein từ phụ phẩm tôm thẻ chân trắng để tạo ra chế phẩm dịch protein thủy phân có cả giá trị dinh dưỡng và chức năng sinh học là khả thi. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Địa điểm, thời gian Tiến hành thí nghiệm và thu nhận số liệu cho luận án được thực hiện từ tháng 11/2014 đến tháng 11/2017 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có liên quan. Thiết bị, hoá chất Dụng cụ - thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu: máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc); thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức; Herlme Z323K); máy đo pH 2 số lẻ, độ chính xác 0,01 (HANA pH 212, Trung Quốc); máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật); bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chỉnh đến cận 100°C, độ chính xác 0,1°C) Hóa chất: Na2HPO4, NaH2PO4 (Merck, Đức); Tyrosine; Trichloacetic axit (TCA); Folin; casein dạng bột (Merck, Đức); DPPH (2,2 –Diphenyl–1– picrylhydrazyl) (Merck, Đức),... Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Nguyên liệu thịt đầu tôm thẻ được phân tách tại nhà máy Chế biến thủy sản xuất nhập khẩu Hòa Trung (huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau), bảo đảm mẫu được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới 4ºC và thời gian tối đa 2 giờ từ công đoạn tách đầu đến khi thu nhận thịt đầu tôm. Sau đó, cấp đông ở nhiệt độ -35°C đến -40°C, sau khi đạt nhiệt độ tâm -18°C thì tiến hành trữ đông. Phương pháp trích ly và tinh sạch sơ bộ Sau khi nghiền, mẫu được cân định lượng rồi tiến hành trích ly bằng dung môi glycine-NaOH pH 9,0; nhiệt độ 50°C với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v) trong thời gian 40 phút để rút chiết enzyme (Trần Thanh Trúc và ctv., 2014). Quá trình trích ly enzyme được thực hiện bằng máy khuấy từ liên tục với tốc độ 200 rpm nhằm làm tăng khả năng trích ly. Sau quá trình trích ly, mẫu được ly tâm ở tốc độ 6.000 rpm trong thời gian 20 phút, sau đó loại bỏ phần cặn, thu nhận phần dịch trong, gọi là dịch chiết enzyme protease thô (Castillo-Yaneza et al., 2004). Tiến hành kết tủa bằng ethanol 99,5% và được làm lạnh đến nhiệt độ -18°C, tỷ lệ giữa dịch trích protease thô và dung môi ethanol sử dụng tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa là 1:3 (v/v), lắc nhẹ và để ổn định ở 0 ÷ 4°C trong thời gian 30 phút (Hà Thị Thụy Vy và ctv., 2016). Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly tâm 6.000 rpm trong 20 phút ở 4°C, thu được phần kết tủa. Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm phosphate pH 7,6; nhiệt độ 30 C, với thể tích dung dịch đệm bổ sung vào tủa sao 9 cho bằng thể tích dịch trích sử dụng để kết tủa (Trần Thanh Trúc và ctv., 2014). Xác định hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ. Phương pháp thủy phân Sau khi nghiền, mẫu được cân định lượng rồi tiến hành thủy phân bằng dung môi là nước với tỷ lệ 1:1. Nhiệt độ, pH, nồng độ và thời gian thủy phân bằng enzyme alcalase/enzyme flavourzyme được điều chỉnh tùy theo điều kiện khảo sát. Quá trình thủy phân được thực hiện bằng máy khuấy từ liên tục, tốc độ 200 rpm nhằm tăng khả năng thủy phân. Sau quá trình thủy phân, mẫu được ly tâm ở tốc độ 6.000 rpm trong thời gian 20 phút, loại bỏ phần cặn, thu nhận phần dịch trong, gọi là dịch thủy phân protein. Tiến hành xác định mức độ thủy phân (DH%) và hoạt tính chống oxy hóa (DPPH%) nhằm chọn được điều kiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm tốt nhất Phương pháp phân tích Các phương pháp phân tích được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Phương pháp phân tích STT Chỉ tiêu Phương pháp 1 Độ ẩm (%) Phương pháp NMKL số 57-1994 2 Protein tổng số (%) Kjeldahl method, FAO, 14/7, 1986, p221 3 Lipit tổng số (%) Soxhlet method FAO, 14/7, 1986, p212 4 Chỉ số peroxide TCVN 6127:2010 5 Hàm lượng protein hòa tan (mg/kg) Xác định bằng phương pháp Bradford (Bradford, 1990). 6 Hoạt tính protease (UI/g) Phương pháp Anson cải tiến (Anson, 1938) 7 Hiệu suất thủy phân (%) Phương pháp OPA ((Nielsen, et al, 2001) 8 Hàm lượng N-NH3 Xác định hàm lượng nitơ base bay hơi sử dụng hệ thống chưng cất với chất kiềm hóa là MgO (AOAC 973.46, 1990) 9 Khả năng loại bỏ gốc tự do (%) và IC50 Phương pháp so màu hình thành từ phản ứng với dung dịch DPPH trong methanol (Zhao et al., 2011). 10 Màu (L*, a*, b*) Đo bằng thiết bị đo màu NH300 (Trung Quốc) với hệ màu CIE bằng đèn D65 11 Cảm quan Phương pháp phân tích mô tả định lượng QDA (Stone et al, 1974) với các thuộc tính tham khảo dựa trên TCVN 5277:1990 và TCVN 5090: 90. 12 Chỉ tiêu vi sinh QCVN: 8-3:2012/BYT (Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm) 13 Xác định axit amin Chromatography AB55 (1999) Phương pháp xử lý số liệu Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một, hai hoặc ba nhân tố và được lặp lại ba lần. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm kế tiếp. thí nghiệm được phân tích và thống kê sử dụng chương trình Statgraphics Centrution 16.1; phần mềm Prism 5.0 và Microsoft Excel 2007. Số liệu được phân tích Statgraphics Centrution 16.1phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận sự khác biệt giữa trung bình các nghiệm thức. 10 Nội dung ngiên cứu Thí nghiệm được khảo sát với 5 nội dung chính theo sơ đồ tổng hợp ở hình 3.1. Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Tôm thẻ chân trắng Thịt đầu tôm thẻ (Xác định thành phần hóa lý) Trữ đông (Thí nghiệm 1) Trích ly và tinh sạch sơ bộ protease nội tại Nội dung 2: Kích hoạt protease nội tại (Tối ưu điều kiện tiền xử lý) Lạnh đông Thân tôm Xử lý Vỏ tôm Xuất khẩu Đầu tôm thẻ Vỏ đầu tôm Sản xuất chitosan Vô hoạt enzyme Nội dung 3: Xác định điều kiện thủy phân tối ưu bằng protease ngoại bào Thủy phân protein (Thí nghiệm 4 -5) Alcalase (Thí nghiệm 6-8) Nội dung 1: Xác định tính chất protease nội tại (Thí nghiệm 2 -3) Flavourzyme (Thí nghiệm 9-11) Nội dung 4: Xây dựng quy trình chế biến chế phẩm protein thủy phân và đánh giá khả năng bảo quản sản phẩm (Tối ưu điều kiện thủy phân bằng enzyme nội tại + ngoại bào) (Thí nghiệm 14) Dịch thủy phân Cô đặc (Thí nghiệm 15) Bảo quản (Thí nghiệm 16) Nội dung 5: Ứng dụng chế phẩm dịch protein thủy phân trong sản xuất thực phẩm Tối ưu điều kiện kết hợp 2 enzyme ngoại bào (Thí nghiệm 12 -13) Nước mắm Tỷ lệ chế phẩm bổ sung (Thí nghiệm 17) Khô cá lóc Tỷ lệ chế phẩm bổ sung (Thí nghiệm 18) 11 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tính chất của nguyên liệu và khả năng trữ đông thịt đầu tôm Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm thẻ chân trắng Các thông số hoá lý chính và hoạt tính protease nội tại của nguyên liệu được thể hiện ở Bảng 4.1. Bảng 4.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm Thành phần Giá trị Độ ẩm (% 83,24±0,68 pH 7,78±0,02 Protein tổng (%) 12,80±0,25 Hoạt tính protease (UI/g CKNL*) 0,82±0,09 *CKNL: chất khô nguyên liệu Kết quả từ Bảng 4.1 cho thấy, hàm lượng protein tổng số khá cao và hoạt tính của enzyme nội tại mạnh là điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân thu hồi chế phẩm dịch protein thủy phân. Tuy nhiên, hàm lượng protein cao và pH hơi kiềm là điều kiện thích hợp cho vi sinh vật gây hư hỏng phát triển, làm tăng sự phân giải protein và làm giảm hoạt tính sinh học. Khả năng trữ đông thịt đầu tôm đến sự ổn định của hiệu quả thủy phân protein bằng protease nội tại Sự thay đổi hiệu suất thủy phân và hoạt tính protease theo thời gian bảo quản lạnh đông thịt đầu tôm được thể hiện ở Hình 4.1. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme protease trong đầu tôm ổn định ở điều kiện lạnh đông từ tuần 1 đến tuần 6, dao động từ 0,85÷0,89 UI/gCKNL và không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 9, hoạt tính enzyme nội tại bất đầu giảm (0,73 UI/gCKNL). Sự ổn định hoạt tính enzyme protease trong 6 tuần là điều kiện thuận lợi cho quá trình kích hoạt hoạt động enzyme nội tại để thủy phân protein. Hình 4.1 Hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính enzyme protease nội tại theo thời gian bảo quản 12 Đặc điểm của enzyme protease nội tại Độ bền nhiệt Nhiệt độ cao thường được sử dụng trong các quá trình chế biến thực phẩm nhưng lại là nguyên nhân gây bất hoạt enzyme, ngay cả protease, vì thế ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng enzyme này. Do vậy, bên cạnh việc xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu thì độ bền nhiệt của protease cũng là kênh thông tin không kém phần quan trọng trong việc ứng dụng enzyme này vào thực tiễn (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991). Kết quả từ đồ thị ở Hình 4.2 cho thấy mức độ vô hoạt nhiệt enzyme protease từ thịt đầu tôm thẻ phụ thuộc lớn vào nhiệt độ xử lý. Quá trình xử lý nhiệt càng cao thì enzyme bị vô hoạt càng nhiều. Hình 4.2 Độ bền nhiệt của enzyme protease thịt đầu tôm thẻ sau tinh sạch sơ bộ Tốc độ vô hoạt nhiệt tăng khi nhiệt độ xử lý tăng từ 55 đến 70 °C. Khi tăng nhiệt độ lên 55 °C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 92,47% so với hoạt tính ban đầu và giảm đáng kể ở nhiệt độ 65÷75 °C và gần như hoàn toàn mất hoạt tính ở 80 °C chỉ còn 7,44% so với hoạt tính ban đầu. Động học Km và Vmax Bên cạnh nhiệt độ, pH thì hằng số tốc độ phản ứng Km và tốc độ phản ứng cực đại Vmax là hai thông số đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Cố định các yếu tố hóa học và vật lý có thể tác động đến phản ứng enzyme thì tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Giá trị Vmax có vai trò quan trọng trong việc lựa chọn nồng độ enzyme và cơ chất thích hợp trong các quá trình ứng dụng. Các thông số động học Km, Vmax được xác định theo phương pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f(1/[S]), dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V và 1/[S] được thể hiện trong Hình 4.3. Thông qua phương trình Lineweaver-Burk y = 0,0068.x + 0,0855 (R2 = 0,9885) hay 1/v = 0,0068(1/[S]) + 0,0855 Giá trị Km và Vmax của protease khảo sát được xác định: 1/Vmax = 0,0855; Km/Vmax = 0,0068 13 Hình 4.3 Phương trình Lineweaer- Burk của protease trên cơ chất thịt đầu tôm Như vậy, enzyme protease nội tại từ thịt đầu tôm thẻ có giá trị Vmax đạt 11,70 11,70 µM/phút và Km là 0,0795 g/mL. Giá trị Km là hằng số Michaelis-Menten đặc trưng cho ái lực giữa enzyme và cơ chất, giá trị Km càng nhỏ cho thấy ái lực giữa enzyme và cơ chất càng lớn nên tốc độ xúc tác enzyme càng cao và ngược lại. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả thủy phân protein của thịt đầu tôm bằng việc sử dụng protease nội tại Tối ưu hóa quá trình kích hoạt enzyme protease nội tại Dựa trên các thông số động học thu nhận được ở mục 4.2 cho thấy, các nhân tố nhiệt độ có sự chi phối đáng kể đến hoạt động của enzyme protease, điều này có thể là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến việc thay đổi hiệu quả thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Hà Thị Thụy Vy và ctv. (2018) cho thấy, hoạt tính enzyme protease có giá trị thay đổi theo các giá trị pH đã khảo sát và hoạt tính cao ở khoảng pH 7-8. Điều kiện hoạt động (X1: nhiệt độ kích hoạt (oC) X2: pH và X3: thời gian kích hoạt (phút)) tối ưu của quá trình tiền xử lý với 3 hàm mục tiêu Y1 - Hiệu suất thủy phân (DH (%); Y2 - Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH (%)) và Y3 - IC50 (mg/100 ml), thu được các phương trình hồi qui (1), (2) và (3): Y1 = -396,63 + 3,39X1 + 75,7535X2 + 38,0091X3 – 0,0291308X1^2 – 0,122X1X2 + 0,2135X1X3 – 3,96075 X2^2 – 3,61333X2X3- 3,3255 X3^2 (1), R2 = 98,1994% Y2 = -393,75 + 3,45189X1 + 75,3786X2 + 35,2798X3 - 0,0259798 X1^2 - 0,185847X1X2 + 0,215676X1X3 - 3,510044X2^2 - 3,91411X2X3- 2,72794 X3^2 (2), R2 = 96,2364% Y3 = 399,614 - 2,98549X1- 66,8268X2 - 37,4297X3 + 0,0209468X1^2 + 0,160796X1X2 - 0,129854X1X3 + 3,03517X2^2 + 4,16763X2X3 + 2,19321X2^2 Bảng 4.2 Kết quả tối ưu hóa điều kiện đáp ứng 3 hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 Giá trị tối ưu cao nhất của từng hàm mục tiêu (hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và giá trị IC50) đạt được của quá trình tiền xử lý enzyme nội tại thể Nhân tố Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu Thấp Cao Y1 Y2 Y3 Y1 Y2 Y3 X1 43.2 76.8 57.5 55.3 55.33 36.03 30.41 13.28 X2 5.3 8.8 6.95 7.2 7.17 X3 2.3 5.7 3.78 3.5 3.51 14 hiện Bảng 4.2. Để dịch thủy phân đáp ứng cả 3 hàm mục tiêu, kết quả phân tích thống kê thể hiện qua Hình 4.4 và Bảng 4.3. Hình 4.4 Tương tác của nhiệt độ, pH và thời gian kích hoạt đến cả 3 hàm mục tiêu Bảng 4.3 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y1, Y2 và Y3 Nhân tố Chế độ: Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu Thấp Cao Y1 Y2 Y3 X1 43,18 76,82 56,19 36,00 30,39 14,61 X2 5,32 8,68 7,04 X3 2,32 5,68 3,62 Kết quả thực nghiệm phù hợp tốt với các giá trị dự đoán theo phương trình. Thông số tối ưu cho tiền xử lý nguyên liệu là nhiệt độ 56,19°C; thời gian 3,62 phút ở pH 7,04. Xác định hiệu suất thủy phân của protease nội tại theo thời gian Từ kết quả thể hiện ở Bảng 4.4 cho thấy hiệu suất thủy phân tăng (2,69÷43,07%) khi tăng thời gian thủy phân từ 0 đến 8 giờ, hiệu suất thủy phân tăng nhanh ở giai đoạn đầu của quá trình thủy phân và tăng chậm sau 6 giờ của quá trình thủy phân. Hàm lượng protein hòa tan thu nhận được cũng gia tăng theo thời gian thủy phân từ 0÷6 giờ đầu và giảm ở các thời gian thủy phân kế tiếp (Bảng 4.4). Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi dịch thủy phân Thời gian (giờ) Hiệu suất thủy phân, %DH Hoạt tính chống oxy hóa, %DPPH(*) Protein hòa tan, g/100g CKNL Hàm lượng NH3, mg/100g IC50 (mg/ 100 mL) 0 2,69a±0,73 16,66a±0,20 2,90a±0,78 7,93a±0,60 27,62a±0,33 1 13,61b±1,22 19,87b±0,24 14,67b±1,31 10,75b±0,49 23,16b±0,27 2 18,55c±1,40 22,58c±0,17 19,67c±1,53 14,33c±1,04 20,37c±0,15 3 24,24d±1,09 26,56d±0,34 26,14d±1,18 17,50d±0,55 17,32d±0,16 4 36,08e±0,81 26,37d±0,37 38,89f±0,87 22,97e±0,74 17,45d±0,23 5 38,81f±0,55 31,48e±0,37 41,84g±0,60 24,78f±0,57 14,62e±0,17 6 41,12g±0,63 34,46g±0,03 44,33h±0,98 30,08g±0,88 13,35g±0,01 7 41,48gh±1,34 32,52f±0,37f 33,72e±1,18 36,65h±0,39 14,15f±0,16f 8 43,07h±0,40 31,33e±0,41 26,76d±0,91 44,60i±1,18 14,69e±0,19 Hàm lượng protein hòa tan đạt giá trị cao nhất sau 6 giờ thủy phân (44,33 mg/100 g) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân thu được là 34,46%. Về phương 15 diện cảm quan, với thời gian thủy phân 6 giờ, dịch thủy phân chưa có mùi lạ nhưng nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân mặc dù hiệu suất thủy phân vẫn tăng nhưng dịch thủy phân có mùi hôi và xuất hiện bọt khí. Điều kiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm bằng enzyme protease ngoại bào (alcalase, flavourzyme) phù hợp Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme alcalase đến hiệu quả thủy phân protein 4.4.1.1 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Dựa trên các khảo sát trước về tác động riêng lẻ của từng yếu tố nhiệt độ, pH và thời gian đến khả năng thủy phân của enzyme alcalase cho thấy, các nhân tố này đều có sự chi phối đáng kể đến hoạt động của enzyme alcalase. Điều này có thể là nguyên nhân chính có ảnh hưởng đến việc thay đổi hiệu quả quá trình thủy phân protein từ thịt đầu tôm thẻ. Trong số các enzyme alcalase, pancreatin, trypsin, pepsin, papain, neutrase, protamex, flavourzyme,thì alcalase cho hiệu quả thủy phân protein tốt nhất (Chakrabarti, 2002; Dey and Dora, 2014a). Các thông số tối ưu nhiệt độ và pH để enzyme alcalase thủy phân protein trên đầu tôm thẻ có giá trị X4 trong khoảng từ 0 ÷ 1 (50 ÷ 70 C) và X5 -pH (7,5÷8,5). Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phương trình hồi qui thể hiện sự tương quan của điều kiện thủy phân đến hiệu suất thuỷ phân được thiết lập và sử dụng để dự đoán hiệu quả việc thuỷ phân protein. Hàm mục tiêu Y4 – %DH, Y5 - % DPPH và Y6 – IC50 của quá trình thủy phân bằng enzyme alcalase được xác định bằng cách thay các biến với giá trị thực vào phương trình sau: Y4- DH (%) = -552,328 + 8,00772X4 + 90,7747X5 – 0,0595288X4^2 – 0,127144 X4 X5 – 5,41016 X5^2 (4) Y5-DPPH (%) = -511,237 + 5,60728X4 + 97,6543X5 – 0,0458047X4^2 – 0,0339033X4X5 – 6,28411X5^2 (5) Y6 - IC50 (mg/100ml) = 803,496 - 8,28489 X4 - 142,168 X5 + 0,0690832X4^2 + 0,0354187 X4X5 + 9,13448 X5^2 (6) Giải phương trình (4) (5) và (6) cho giá trị tối ưu đối với DH (%); DPPH(%) và IC50. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.5 và Hình 4.3. Hình 4.3 Tương tác của nhiệt độ và pH đến ba hàm mục tiêu Y4, Y5 và Y6 16 Bảng 4.5 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y4, Y5 và Y6 Nhân tố Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu: Thấp Cao Y4 Y5 Y6 X4 6,5 8,5 7,67 33,27 24,14 18,07 X5 50,0 70,0 57,99 Hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của quá trình thủy phân protein bằng enzyme alcalase đạt được ở điều kiện pH và nhiệt độ tốt nhất là 33,33% và 24,15%. Kết quả thu được phù hợp với kết quả của Dey and Dora (2014a) khi sử dụng mô hình bề mặt đáp ứng RMS để tối ưu hóa điều kiện thủy phân phụ phẩm tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase thương mại, hiệu suất thủy phân đạt 33,13% ở nhiệt độ 59,37 oC và pH 8,25. Huang et al. (2011) khi tiến hành thủy phân protein từ phụ phẩm tôm bằng enzyme alcalase ở điều kiện pH 8, nhiệt độ 50oC đạt giá trị IC50 là 500 μg/mL. 4.4.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase Kết quả thống kê được trình bày ở Bảng 4.6. Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase (UI/g) đến hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và IC50 Nồng độ enzyme alcalase (UI/g) Hiệu suất thủy phân DH (%) Hoạt tính chống oxy hóa DPPH (%) (*) IC50, (mg/100mL) Đối chứng 21,67a±0,94 16,32a±0,33 18,20a±0,57 10 33,59b±0,24 23,81b±0,73 19,33b±0,60 20 35,05c±0,11 32,72c±0,39 14,07c±0,17 30 33,46b±0,29 32,66c±0,87 14,10c±0,39 40 33,33b±0,35 32,06c±0,99 14,36c±0,44 50 33,23b±1,09 31,61c±1,39 14,57c±0,65 Kết quả cho thấy, sử dụng nồng độ enzyme alcalase 20 UI/g là điều kiện thích hợp để đạt hiệu suất thủy phân cao (37,6%) và hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân tốt (31,57%). 4.4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Thời gian thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme alcalase cũng được thể hiện ở Hình 4.4 Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân protein bằng enzyme alcalase 17 Đồ thị Hình 4.4 thể hiện sự phụ thuộc đáng kể của thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân protein và hoạt tính chống oxy hóa từ dịch thủy phân. Khi thời gian thủy phân tăng từ 1 đến 4 giờ, hiệu suất thủy phân tăng từ 19,58% lên 37,60% và hoạt tính chống oxy hóa tăng từ 16,54% lên 31,57%. Tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân đến 5 và 6 giờ, hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa đều giảm dần. Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Tuy nhiên, thời gian thủy phân càng kéo dài khi cơ chất đã hết thì các sản phẩm của quá trình thủy phân tiếp tục phân cắt làm giảm hiệu suất thủy phân (See et al., 2011). Do đó, thời gian thủy phân 4 giờ là thích hợp nhất. Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme flavourzyme đến hiệu quả thủy phân protein 4.4.2.1 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ Enzyme thương mại flavourzyme cũng là một enzyme được sử dụng nhiều trong ứng dụng thủy phân protein có nguồn gốc thủy sản. Đây là enzyme chứa cả thuộc tính exopeptidase và endopeptidase. Tuy nhiên, flavourzyme thường được biết đến trong vai trò là enzyme mang tính chất exopeptidase. Cũng giống như các loại enzyme thương mại khác, flavourzyme có khoảng pH và nhiệt độ hoạt động nhất định. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme flavourzyme bao gồm nhiệt độ =X6 (40 ÷ 60 C) và X7 = pH (6,0÷8,0). Phương trình hồi qui cho các hàm mục tiêu: Hiệu suất thủy phân (Y7); hoạt tính chống oxy hóa (Y8) và IC50 (Y9) lý thuyết) được xác định: Y7 - DH%= - 148,758 + 1,92953X6 + 36,6758X7 – 0,0207833X6^2 + 0,0414167X6X7 – 2,835X7^2, (R2 = 0,9594) (7) Y8 - DPPH%= - 400,987 + 2,46842X6 + 104,281X7 – 0,0311167X6^2+ 0,10675X6X7 – 7,86333X7^2, (R2 = 0,9819) (8) Y9 - IC50 = 481,778 - 113,801X6 - 2,58719X7 + 8,9563X6^2 - 0,21448 X6X7 do + 0,0389991X7^2 (9) Giải các phương trình hồi qui (7); (8) và (9), giá trị các biến tương ứng từng hàm mục tiêu (Y8) và IC50 (Y9). Kết quả được trình bày ở Bảng 4.7. Hình 4.5 Tương tác của nhiệt độ và pH đến ba hàm mục tiêu Y7, Y8 và Y9 18 Bảng 4.7 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân đáp ứng 3 mục tiêu Y7, Y8 và Y9 Nhân tố Chế độ Chế độ tối ưu Giá trị tối ưu Thấp Cao Y7 Y8 Y9 X6 6,0 8,0 6,97 30,18 26,54 16,93 X7 40,0 60,0 51,04 Hiệu suất thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của quá trình thủy phân protein bằng enzyme flavourzyme đạt được ở điều kiện pH 6,97 và nhiệt độ 51,04 oC là 30,18%; 26,54% và IC50 16,93 mg/100 mL. 4.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme flavourzyme Nồng độ enzyme flavourzyme (UI/g) sử dụng thủy phân protein từ đầu tôm được thể hiện ở Hình 4.6. Hình 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase (UI/g) đến hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và IC50 Tại nồng độ enzyme flavourzyme 30 UI/g giúp quá trình thủy phân protein thịt đầu đạt hiệu quả tốt nhất (32,6%). Đồng thời, tại nồng độ này khả năng kháng oxy hóa đạt cao nhất và chỉ số IC50 thấp nhất, tương ứng: 28,58% và 16,13 mg/100 mL. 4.4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Kết quả thống kê được trình bày ở Bảng 4.8. Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân bằng enzyme flavourzyme đến hiệu suất thủy phân, hoạt tính chống oxy hóa và IC50 Thời gian thủy phân (giờ) Hiệu suất thủy phân DH (%) Hoạt tính chống oxy hóa DPPH (%)(*) IC50 (mg/100 mL) 0 17,79a±0,16 16,54a±0,17 27,82a±0,29 1 23,12b±0,68 21,78b±0,57 21,14b±0,55 2 32,56c±0,45 25,94c±0,52 17,74c±0,35 3 35,10d±0,92 29,50d±0,57 15,60d±0,30 4 35,18d±0,79 29,96d±0,65 15,36d±0,33 5 35,16d±1,11 30,01d±0,49 15,33d±0,25 6 35,45d±0,29 30,08d±0,47 15,30d±0,22 (*) DPPH % đã được pha loãng 20 lần 19 Thời gian thủy phân 3 giờ cho hiệu quả tốt nhất, hiệu suất thủy phân đạt đến 35,10% và hoạt tính chống oxy hóa tăng 29,54%, tương ứng với IC50 15,60 mg/100mL. Kết quả tương tác giữa thời gian bổ sung flavourzyme và thời gian kết thúc quá trình thủy phân khi sử dụng kết hợp enzyme alcalase và flavourzyme Rõ ràng rằng việc lựa chọn một loại enzyme thích hợp là rất quan trọng đối với quá trình thuỷ phân để đạt kết quả mong muốn. Tùy vào mục tiêu nghiên cứu sẽ lựa chọn các enzyme thích hợp để phân cắt các liên kết peptit. Các enzyme thủy phân các protein đã được nghiên cứu rộng rãi (Adler-Nissen, 1986). Một trong những thông số quan trọng trong quá trình thủy phân protein là mức độ thủy phân (Kunst, 2003). Điều này hoàn toàn hợp lý bởi vì một enzyme duy nhất không thể thủy phân sâu rộng trong một thời gian hợp lý (Lahl and Braun, 1994). Trong quá trình sử dụng enzyme thương mại để thủy phân protein đậu nành, sự kết hợp enzyme