Tóm tắt Luận án Tách dõng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của Endochitinase từ Bacillus Thuringiensis phân lập ở Việt Nam

,23) 12/18 (66,66) 4/18 (22,22) 2/18 (11,11) - - Kiên Giang/ Đồng bằng sông Mê Kông 6/8 (75.0) 16/36 (0,44) 4/16 (25,0) 12/16 (75.0) - - - Tổng số 195/320 (60,94) 452/1026 (0,44) 176/452 (38,93) 174/452 (38,49) 7/452 (1,54) 74/452 (16,37) 21/452 (4,64) 3.1.2. Phân loại dưới loài các chủng B. thuringiensis phân lập Tiến hành phân loại 452 chủng Bt phân lập thu được kết quả: 29,2% (132 chủng) số chủng thuộc typ huyết thanh 3a, 3b, 3c (dưới loài kurstaki), 16,4% thuộc dưới loài aizawai và 16,4% thuộc dưới loài morrisoni. Dưới loài novosibirsk và pondicheriensis là những chủng khá hiếm ở Việt Nam với tỷ lệ 0,6% mỗi dưới loài, 10 chủng không có phản ứng với kháng thể (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh Số TT Dưới loài Type huyết thanh H Số chủng phản ứng ngưng kết Tỷ lệ (%) 1 alesti 3a, 3c 35 7,7 2 sumiyoshiensis 3a, 3d 6 1,3 3 kurstaki 3a, 3b, 3c 132 29,2 4 fukuokaensis 3a, 3d, 3e 18 3,9 5 gallariae 5a, 5b 7 1,5 6 aizawai 7 74 16,4 7 morrisoni 8a, 8b 74 16,4 8 nigeriensis 8b, 8d 16 3,5 9 tolwothy 9 13 2,8 10 israelensis 14 7 1,5 11 indiana 16 13 2,8 12 yunnanensis 20a, 20b 4 0,8 13 pondicheriensis 20a, 2oC 3 0,6 14 colmeri 21 12 2,6 15 novosibirsk 24a, 24c 3 0,6 16 coreanensis 25 6 1,3 17 leesis 33 8 1,7 18 konkukian 34 11 2,4 Tổng số chủng phản ứng dương 442 97,8 Số chủng phản ứng âm 10 2,2 Hình 3.1. Hình dạng tinh thể và bào tử của một số chủng Bt chụp dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần 1. Hình lưỡng tháp, 2. Hình cầu, 3. Hình cầu, hình lưỡng tháp và hình khối lập phương, 4. Hình lập phương, C. Tinh thể (Crystal), S. Bào tử (Spore). Theo các nghiên cứu trên thế giới, các chủng vi khuẩn thuộc dưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) vừa có khả năng chống lại ấu trùng bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) vừa có khả năng sinh endochitinase – enzyme có khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật và làm tăng hoạt tính diệt côn trùng của Bt (Barboza, 2008; Gomaa, 2012). Vì vậy, các chủng Btk được sử dụng để kiểm tra khả năng thủy phân chitin nhằm tìm ra chủng có hoạt tính mạnh nhất. 3.1.3. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Từ 132 chủng Btk, tiến hành sàng lọc khả năng sinh enzym thủy phân chitin trên môi trường thạch có bổ sung chitin như nguồn các bon (Kamil et al., 2007), thu được 99 chủng sinh chitinase với đường kính vòng phân giải 3 - 29 mm, trong đó chủng MSS1.1 có đường kính vòng phân giải lớn nhất 29 mm và hoạt tính chitinase cao nhất đạt 0,54 U/ml (Hình 3.2A, B). B B Hình 3.2. Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B). 3.1.4. Sàng lọc gen endochitinase (chiA) của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Sử dụng cặp mồi đặc hiệu chi F và chi R để khuếch đại gen chiA (Hình 3.3) từ DNA hệ gen của 99 chủng sinh chitinase, thu được 73 chủng mang gen chiA (chiếm 73,74%). 2kb 3kb 1,5kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 3.3. Kết quả sàng lọc gen chiA từ các chủng Btk phân lập ở Hà Nội. 1-8: các chủng Bt1.43, Bt1.55, Bt1.56, Bt1.58, Bt6.12, CM2.3, CM3.3, CM5.9; 10-17: HN1.2, TQ3.3, MSS1.1, MSS6.1, HDC4.7, RH2.15, MSS6.3, AV125.9, 9: DNA chuẩn (hãng Thermo scientific, kích thước 10kb). 3.1.5. Sàng lọc hoạt tính kháng nấm của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Từ 36 chủng Bt có đường kính vòng thủy phân chitin lớn (17-29 mm), đồng thời có hoạt tính chitinase cao (0,31 - 0,54 U/ml) và có mang gen chiA, tiến hành thử hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani thu được 5 chủng có khả năng kháng nấm. Trong đó, chủng MSS1.1 có đường kính vòng ức chế đối với 2 loại nấm F. oxysporum (Hình 3.4) và R. solani lần lượt là 13 và 8 mm. Chủng MSS1.1 được lựa chọn để khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase, nhân dòng và biểu hiện chitinase tái tổ hợp. Hình 3.4. Ảnh kháng nấm F. oxysporum của một số chủng Btk 3.2. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase của chủng Bacillus thuringiensis MSS1.1 Qua quá trình khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase của chủng Btk MSS1.1 thu được kết quả như sau: Chủng MSS1.1 khi được lên men trong môi trường tối ưu gồm các thành phần (g/l): bột ngô 10, K2HPO4 1, KH2PO4 1, bột đậu tương 10, NaCl 2, MgSO4 0,5, CaCl2 1, MnSO4 0,01, ZnSO4 0,01, FeSO4 0,01; bổ sung chitin huyền phù 0,5%, pH môi trường 7, nhiệt độ nuôi 28oC thì sau 96 giờ lên men hoạt tính chitinase thu được là 0,87 U/ml, tăng 1,36 lần so với môi trường cơ sở ban đầu. 3.3. Nhân dòng gen chiA mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki MSS1.1 Gen chiA được nhân dòng trong vector pGEM®-Teasy. Kết quả đọc trình tự cho thấy, đoạn gen chiA từ DNA của chủng vi khuẩn MSS1.1 có chiều dài 2031 nucleotide, có độ tương đồng 99% so với đoạn gen chiA của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki HD73 trên GenBank có mã số EF581163.2 với 10 vị trí sai khác và xuất hiện vị trí cắt của enzym giới hạn BamHI (GGATCC) trong khoảng giữa đoạn gen do sự sai khác ở vị trí nucleotide C915T. Trình tự amino acid do gen chiA mã hóa có độ tương đồng 99% so với trình tự amino acid của chủng HD73 có mã số ABQ65137.2 với sự thay đổi của 5 amino acid. Phân tích trình tự gen chiA của chủng Bt MSS1.1 cho thấy gen chiA có 34 amino acid đầu N là peptide tín hiệu ( với vị trí cắt ở giữa amino acid thứ 34 và 35. Phân tích cấu trúc dự đoán của protein ChiA từ chủng Bt MSS1.1 cho thấy, chitinase ChiA có cấu trúc 3 vùng đặc trưng cho họ glycosyl hydrolase 18: vùng thủy phân, vùng fibronectin và vùng gắn kết chitin. 3.4. Biểu hiện gen chiA trong vi khuẩn E. coli BL21 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen chiA trong vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) Đoạn gen chiA được gắn vào vector biểu hiện pET28b(+) tại vị trí cắt của EcoRI và XhoI, sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10B khả biến. Plasmid tái tổ hợp có chứa gen chiA được tách, tinh sạch từ chủng DH10B và biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trường LB thạch bổ sung 50 µg/ml kanamycin, nuôi 37oC qua đêm. Khuẩn lạc mang gen chiA được nuôi trong môi trường LB lỏng chứa 50 µg/ml kanamycin, ở 37oC và cảm ứng bởi IPTG nồng độ cuối 0,5 mM. Mức độ biểu hiện protein của dòng tế bào được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide (Hình 3.5A). Kết quả xuất hiện một băng protein khoảng 70 kDa đậm hơn so với mẫu còn lại. Để khẳng định, tiến hành kiểm tra bằng Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng đuôi His - tag. Kết quả (hình 3.5B) cho thấy xuất hiện băng tín hiệu đậm khoảng 70 kDa tương ứng với kết quả biểu hiện. Ngoài ra trên phổ Western blot cũng thấy xuất hiện một số băng tín hiệu thấp hơn so với băng đậm chính (70 kDa) và hoàn toàn không thấy xuất hiện băng nào cao hơn băng đậm chính này. Sự xuất hiện của băng thấp hơn có thể giải thích là do protein chitinase tái tổ hợp bị thủy phân không đặc hiệu bởi protease trong quá trình chuẩn bị mẫu. Xác định hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp qua phản ứng DNS, thu được kết quả 1,10 ± 0,02 U/ml, cao hơn hoạt tính của chủng tự nhiên 1,26 lần. B A Hình 3.5. Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE (A) và phân tích Western blot (B) Hình A. Băng 1: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA sau cảm ứng IPTG; Băng 2: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA không cảm ứng IPTG; Hình B: Băng 1: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA sau cảm ứng; Băng 2: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA không cảm ứng;M: Thang protein chuẩn 3.4.2. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen chiA của chủng tái tổ hợp 3.4.2.1. Nhiệt độ cảm ứng Kết quả thể hiện ở hình 3.6A cho thấy, ở các điều kiện nhiệt độ 28, 30, 34 và 37oC bản điện di đều cho băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Đặc biệt, mức độ biểu hiện ở 30, 34 và 37oC không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, hoạt tính enzym thu được có sự khác biệt đáng kể. Hoạt tính chiA thu được khi biểu hiện ở 30oC là cao nhất (Bảng 3.3), đồng thời protein tái tổ hợp thể tan thu được khi biểu hiện ở 30ºC cũng cao nhất (Hình 3.6B). Bảng 3.3. Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau Nhiệt độ cảm ứng (oC) Mật độ tế bào (OD600nm) Hoạt tính (U/ml) 25 1,45 ± 0,11 0,76 ± 0,03 28 2,13 ± 0,12 1,22 ± 0,08 30 2,07 ± 0,15 2,27 ± 0,02 34 2,99 ± 0,09 2,16 ± 0,07 37 3,41 ± 0,17 1,12 ± 0,19 A B Hình 3.6. Điện di protein rChiA biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau Hình A. Băng 1-5: protein tái tổ hợp biểu hiện ở 25, 28, 30, 34 và 37oC sau 6 giờ cảm ứng. Hình B. Protein tổng số, thể tan và thể vùi khi biểu hiện ở 30, 34 và 37oC; M: Maker protein 3.4.2.2. Nồng độ chất cảm cảm ứng Vector biểu hiện pET28b(+) có chứa promoter T7, quá trình biểu hiện gen ngoại lai cần được cảm ứng bởi IPTG, tuy nhiên cần phải xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp, vừa đủ để trung hòa chất ức chế và không ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M kDa A B Chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA được biểu hiện ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau. Sau đó mẫu được thu hồi và đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính cùng với điện di SDS-PAGE (Hình 3.7A, B). Kết quả cho thấy, ở nồng độ ITPG 0,05 mM thì hoạt tính enzyme đạt được cao nhất (đạt 3,17 U/ml). Hình 3.7. Kết quả di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B). Giếng 1: Mẫu không cảm ứng (nồng độ IPTG là 0); Giếng 2-9: Protein tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3 và 1,5 mM; Giếng M: Thang protein chuẩn. 3.4.2.3. Thời gian cảm ứng Chủng tái tổ hợp được biểu hiện theo mô tả ở phần phương pháp, mẫu được thu sau các khoảng thời gian khác nhau để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng 3 giờ hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp bắt đầu tăng đến 9 giờ sau cảm ứng thì đạt cực đại (4,83 U/ml), kéo dài thời gian sau cảm ứng đến 12 giờ thì hoạt tính bắt đầu giảm (chỉ còn 3,74 U/ml). 3.4.2.4. Mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protein của chủng tái tổ hợp. Kết quả thể hiện hoạt tính enzyme đạt cao nhất (5,73 U/ml) khi mật độ tế bào OD600nm = 0,7. 3.4.2.5. Chất cảm ứng lactose Lactose được nghiên cứu như chất cảm ứng thay thế IPTG. Ở nồng độ lactose 7 mM mật độ tế bào đạt 4,34 đơn vị và hoạt tính chitinase đạt cao nhất là 5,71 U/ml, hoạt tính này thấp hơn không đáng kể so với khi cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,05 mM (hoạt tính 5,73 U/ml) (Hình 3.8A). Mặt khác, điện di protein tái tổ hợp thu được từ mẫu cảm ứng bằng lactose và IPTG trên gel polyacrylamide cho thấy, cả 2 mẫu đều xuất hiện băng protein đậm trong khoảng 70 kDa, tương ứng với trọng lượng của protein ChiA (Hình 3.8B). A B Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase và sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A); Phổ điện di protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B). Hình B. Băng 1: protein rChiA khi cảm ứng bằng ITPG 0,05mM; Băng 2: protein rChiA khi cảm ứng bằng lactose 7mM; M: Thang protein chuẩn. 3.4.3. Tối ưu khả năng biểu hiện rChiA bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Những kết quả trên mới chỉ đánh giá được tác động độc lập của các yếu tố mà chưa đánh giá được tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Với mục tiêu thu được protein ChiA có hoạt tính cao nhất, chúng tôi tìm sự tương tác đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp rChiA như: nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng. Tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng với các miền khảo sát của 3 yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất cảm ứng lactose (A) 5 - 7 mM; Thời gian cảm ứng (B) 6 - 12 giờ và mật độ tế bào (C) (OD600 nm) 0,6 - 1. Bằng phần mềm Design expert 10.0.6, thu được ma trận gồm 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả phân tích hồi quy (Bảng 3.4) cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99%. Chuẩn F cho sự không tương thích của mô hình là 5,01 chứng tỏ sự không tương thích của mô hình là không có ý nghĩa, chỉ có 5,08% (P = 0,0508) cơ hội xuất hiện lỗi do độ nhiễu gây nên. Bảng 3.4. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase Thông số Tổng phương sai Bậc tự do Trung bình phương sai khác Chuẩn Fisher Giá trị P Mô hình 80,22 9 8,91 136,95 < 0,0001 A-Lactose 24,16 1 24,16 371,27 < 0,0001 B-Thời gian cảm ứng 1,05 1 1,05 16,12 0,0025 C-Mật độ tế bào 2,11 1 2,11 32,46 0,0002 AB 0,18 1 0,18 2,72 0,1301 AC 3,11 1 3,11 47,83 < 0,0001 BC 1,250E-005 1 1,250E-005 1,921E-004 0,9892 A2 27,15 1 27,15 417,13 < 0,0001 B2 13,79 1 13,79 211,87 < 0,0001 C2 17,44 1 17,44 268,02 < 0,0001 Độ lệch thực nghiệm và mô hình 0,65 10 0,065 Sự không tương thích mô hình 0,54 5 0,11 5,01 0,0508 Sai số 0,11 5 0,022 Phương sai tổng 80,87 19 Giải bài toán tối ưu bằng cách chập mục tiêu theo thuật toán “hàm mong đợi” dùng phần mềm Design-Expert 10.0.6 với 100 phương án tối ưu được đưa ra. Phương án tối ưu nhất cho sinh tổng hợp chitinase của chủng E. coli tái tổ hợp là: nồng độ lactose 6,15 mM; thời gian cảm ứng 8,12 giờ và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng là OD600nm = 0,87 với giá trị chitinase theo tính toán đạt 7,49 U/ml. Để kiểm tra sự chính xác của mô hình, thí nghiệm xác nhận được tiến hành 3 lần. Kết quả cho thấy: hoạt độ chitinase theo thực nghiệm (7,54 U/ml) và mô hình (7,49 U/ml) không có sự chênh lệch lớn, như vậy mô hình này phù hợp với thực nghiệm. Như vậy, sau khi tối ưu điều kiện lên men chủng E. coli tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng đã làm tăng hoạt tính enzym tái tổ hợp lên 1,32 lần (hoạt tính trước khi tối ưu đạt 5,71 U/ml). 3.4.4. Tinh sạch và xác định hoạt tính của chitinase tái tổ hợp Kết quả điện di (Hình 3.9A) cho thấy, rChiA sau tinh sạch cho một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa (Băng 1) tương ứng với trọng lượng chitinase tái tổ hợp. Hình 3.9B cho thấy, kết quả điện di không biến tính (phương pháp zymogram) thu được vệt sáng ở khoảng kích thước 70 kDa, tương ứng với kích thước của rChiA trước và sau tinh sạch. Do trong sản phẩm rChiA còn một số băng kích thước nhỏ, chúng tôi tiến hành kiểm tra Western blot đối với mẫu protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch. Kết quả hình 3.9C cho thấy, trên phổ Western blot đối với cả mẫu rChiA trước và sau tinh sạch chỉ xuất hiện một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Kết quả này chứng tỏ protein chitinase đã được tinh sạch thành công. Protein tinh sạch có hoạt độ riêng 72,11 U/mg protein, tăng 4,65 lần so với ban đầu. Hiệu suất thu hồi enzym cao đạt 40,32%. B C Hình 3.9. Điện di SDS-PAGE chitinase tinh sạch (A); kiểm tra hoạt tính chitinase bằng zymogram (B) và phân tích Western blot (C). Hình A: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trước tinh sạch. Hình B: 1. Dịch chiết protein không cảm ứng, 2. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm phosphate pH6, 3-5. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm sodium acetate pH6 với hàm lượng protein tương ứng là 1, 5 và 20 µg. Hình C: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trước tinh sạch. 3.5. Nghiên cứu tính chất của chitinase tái tổ hợp 3.5.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của rChiA là 40oC (hoạt tính đạt cực đại 72,12 U/mg), rChiA bền ở dải nhiệt độ dưới 35oC (ở 30oC và 35oC, hoạt tính rChiA giảm không đáng kể, vẫn còn duy trì 94,6 và 91,3% sau khi ủ 24 giờ). 3.5.2. pH tối ưu và độ bền pH pH tối ưu cho hoạt động của rChiA là 7 và hoạt tính rChiA bền nhất khi ở pH7, sau 24 giờ ủ vẫn còn 70,1% hoạt tính 3.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA lên hoạt tính chitinase Một số ion kim loại hóa trị 2: Mn2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ với nồng độ 10 mM đã làm giảm hoạt tính enzyme từ 13,3 – 32,2%. Ngoại trừ ion Hg2+ ở nồng độ 10 mM làm cho rChiA mất hoàn toàn hoạt tính enzyme. Đặc biệt, ion Ca2+ ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme tăng 17,61%. Hoạt tính enzyme của rChiA tăng từ 1- 4% khi bổ sung các ion K+ và Na+ ở nồng độ 1-10 mM. Ion Ag+ ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme giảm 58%. EDTA nồng độ 1-10 mM làm giảm hoạt tính enzyme 17,6 – 47,2%. 3.5.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa Trong số các chất tẩy rửa thì Trixton X100 với nồng độ 2% đã làm hoạt tính enzyme của rChiA tăng 14,6%. Đặc biệt, SDS với nồng độ 2% thì hoạt tính enzyme của rChiA chỉ còn 66,8%. 3.5.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Hoạt tính enzym của rChiA bị ảnh hưởng bởi dung môi hữu cơ ở các nồng độ khác nhau. Khi bổ sung ethanol, acetone, methanol và n-butanol với nồng độ 10% đã làm hoạt tính giảm đi 1,3; 5,4; 6,3 và 8,4%. Đặc biệt, khi xử lý enzym với các dung môi hữu cơ ở nồng độ 30% thì hoạt tính enzym của rChiA giảm khá nhiều từ 16,3% đến 40,2%. 3.5.6. Động học của phản ứng enzyme Các thông số động học Km và Vmax của rChiA với cơ chất chitin và cơ chất 4-MU-(GlcNAc)3 được xác định dựa trên phương trình Linewever-Burk (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau Cơ chất Phương trình Linewever-Burk Vmax Km (mg/ml) Chitin y=14,199x + 1.596 0,63 µM/ phút ± 0,09 8,90 ± 0,34 4-MU-(GlcNAc)3 y= 0,7693x + 1,8731 0,53 nM/phút ± 0,087 0,41 ± 0,06 3.5.7. Sản phẩm của sự thủy phân cơ chất bởi chitinase Sử dụng rChiA tinh sạch và colloidal chitin như nguồn cơ chất, các oligosaccharit với mức trùng hợp 2 (GlcNAc2), 3 (GlcNAc3) và 4 (GlcNAc4) đã được phát hiện. Ngoài ra, còn thấy một lượng không nhỏ N-acetyl-D–glucosamine (GlcNAc) (Hình 3.10). GlcNAc (GlcNAc)2 (GlcNAc)3 (GlcNAc)4 1 2 3 4 Hình 3.10. Phân tích bản mỏng (TLC) các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase 1. Sản phẩm thủy phân chitin huyền phù sau 24 giờ, 2. Chất chuẩn (N-acetyl D glucosamine và các oligomer (Sigma), 3. rChiA tinh sạch, 4. Chitin huyền phù 0,5% 3.6. Khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật và tăng hoạt tính diệt sâu của chitinase tái tổ hợp 3.6.1. Khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp rChiA có khả năng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh thực vật như: F. oxysporum và R. solani. Hoạt tính ức chế được quan sát sau 3 ngày, ở đĩa bổ sung rChiA thì sợi nấm phát triển kém hẳn so với đĩa đối chứng bổ sung enzym đã bất hoạt (Hình 3.11A, B). Đối với nấm Mucor sp. thì sợi nấm ở đĩa bổ sung chitinase vẫn phát triển bình thường giống như ở đĩa đối chứng (Hình 3.11C). Khi quan sát dưới kính hiển vi thì thấy, nấm F. oxysporum và R. solani xử lý với rChiA thì sợi nấm bị thủy phân, biến dạng trong khi sợi nấm xử lý với enzym đã bất hoạt vẫn giữ nguyên hình dạng ban đầu. Ngược lại, sợi nấm Mucor sp. không ảnh hưởng gì khi xử lý với rChiA (Hình 3.12). Khi xử lý nấm gây bệnh thực vật F. oxysporum, R. solani và Mucor sp với rChiA, đã xác định được lượng N-acetyl D-glucosamine giải phóng ra lần lượt là 22,14 µg/ml; 18,36 µg/ml và 0 µg/ml. Như vậy, rChiA có khả năng ức chế 2 loại nấm gây bệnh thực vật là F. oxysporum và R. solani. A 1 2 3 3 3 1 2 3 B 1 2 3 C Hình 3.11. Sự ức chế phát triển nấm F. oxysporum (A), R. solani (B) và Mucor sp. (C) của rChiA sau 3 ngày. Đĩa 1: đối chứng (bổ sung enzym đã bất hoạt), Đĩa 2: bổ sung 100 µl rChiA (tương đương 3,49 U). Đĩa 3: bổ sung 200 µl rChiA (6,98 U) Hình 3.12. Sợi nấm F. oxysporum, R. solani và Mucor sp. khi xử lý với enzym đã bất hoạt (A, C, E) và với rChiA (B, D, F) 3.6.2. Hỗ trợ hoạt tính diệt sâu Bộ cánh vẩy của chitinase tái tổ hợp 3.6.2. Hỗ trợ hoạt tính diệt sâu Bộ cánh vẩy của chitinase tái tổ hợp Khi sử dụng kết hợp chitinase rChiA với protein tinh thể Bt từ chủng SP10.6 đã rút ngắn thời gian gây chết từ 72 giờ xuống còn 48 giờ (gây chết 100% đối với sâu tơ và 84,3% đối với sâu khoang) (Hình 3.13), đồng thời giá trị LC50 giảm 8,04% và 6,80% đối với sâu tơ và sâu khoang (Bảng 3.6). A B Hình 3.13. Thử nghiệm khả năng diệt sâu tơ (A) và sâu khoang (B) của protein tinh thể Cry, rChiA A B A B A B Bảng 3.6. Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Bt và rChiA Mẫu thử nghiệm LC50 sâu tơ (ng/cm2) LC50 sâu khoang (ng/cm2) SP10.6 167,8 ± 8,5 283,5 ± 12,6 SP10.6 + rChiA 154,3 ± 9,4 264,2 ± 7,3 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Phân lập vi khuẩn B. thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam. 4.1.1. Phân lập vi khuẩn B. thuringiensis Chỉ số Bt của các mẫu đất ở Mỹ là 0,25 - 0,31 (Martin và Traverst, 1989); ở NewZealand là 0,2 - 0,5 (Chilcott và Wigley, 1993). Trong khi đó, tần suất xuất hiện Bt ở 7 tỉnh thành Việt Nam là 60,94% và chỉ số Bt là 0,44. Như vậy, so với số liệu công bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện Bt và chỉ số Bt mà chúng tôi phân lập được là khá cao. Chứng tỏ số lượng vi khuẩn Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý. 4.1.2. Phân loại dưới loài kurstaki các chủng Bt phân lập Kết quả phân loại cho thấy, 29,2% số chủng thuộc typ huyết thanh 3a, 3b, 3c (dưới loài kurstaki), chiếm tỷ lệ cao nhất. Kết quả phân loại này khá cao so với ở New Zealand chỉ 25% số chủng thuộc dưới loài kurstaki (Young, 1998). Theo các nghiên cứu trên thế giới, các chủng vi khuẩn thuộc dưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) vừa có khả năng chống lại ấu trùng bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) vừa có khả năng sinh endochitinase – enzyme có khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật và làm tăng hoạt tính diệt côn trùng của Bt (Barboza, 2008; Gomaa, 2012). 4.1.3. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk Số chủng có khả năng sinh chitinase chiếm tỉ lệ 75% trong tổng số chủng Btk được kiểm tra. Kết quả này khá cao so với công bố của Cottrell và cộng sự (2000) khi sàng lọc gen chitinase từ vi khuẩn biển thì số chủng có khả năng sinh chitinase chiếm 73,68% tổng số chủng kiểm tra. Chủng Bt MSS1.1 có đường kính vòng phân giải chitin lớn nhất (29 mm). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp so với kết quả nghiên cứu của Shivalee (Shivalee et al., 2016), đường kính vòng thủy phân chitin lớn nhất của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất là 30 mm và hơi thấp so với nghiên cứu của tác giả Ajayi và cộng sự (2016), đã phân lập được vi khuẩn Bacillus sp. từ da và ruột cá da trơn có đường kính vòng thủy phân là 40 mm. Mặt khác, hoạt tính chitinase của chủng MSS1.1 được xác định là cao nhất, đạt 0,54 U/ml. Kết quả này cao hơn rất nhiều so với chủng Bt được phân lập ở Pakistan (hoạt tính chỉ đạt 0,23 U/ml) (Saleem et al., 2014). Như vây, vi khuẩn phân lập từ các nguồn khác nhau có khả năng thủy phân chitin khác nhau. 4.1.4. Sàng lọc gen endochitinase (chiA) của các chủng Btk Số chủng Bt mang gen chiA chiếm tỷ lệ rất cao (73,74%) so với nghiên cứu của Cottrell và cộng sự (2000) khi sàng lọc gen chitinase từ vi khuẩn biển chỉ có 47,37% chủng mang gen. Đây sẽ là nguồn nguyên liệu dồi dào để khai thác và ứng dụng chitinase trong công - nông nghiệp và y dược. Kết quả này làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo và đồng thời làm phong phú thêm cho Bộ Sưu tập nguồn gen Bt Việt Nam. 4.1.5. Sàng lọc hoạt tính kháng nấm của các chủng Btk Chủng Bt MSS1.1 có khả năng ức chế sinh trưởng của 2 loại nấm gây bệnh thực vật là F. oxysporum và R. solani. Những nghiên cứu trước đây cho thấy, Streptomyces griseus có khả năng sinh chitinase kháng nấm F. oxysporum và R. solani với đường kính vòng phân giải lần lượt là 1 cm và 1,5 cm (Anitha và Rabeeth, 2010). Chitinase từ chủng nấm A. terrus có khả năng kháng nhiều loại nấm, trong đó đường kính vòng ức chế đối với nấm F. oxysporum và R. solani là 5 mm và 7 mm (Aida và Taghreed, 2014). Như vậy, chitinase từ các chủng vi sinh khác nhau có khả năng kháng nhiều loại nấm gây bệnh thực vật với mức độ không giống nhau. 4.2. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase của chủng MSS1.1 Thời gian sinh tổng hợp chitinase dài hay ngắn tùy thuộc vào mỗi loài vi sinh vật khác nhau: Để thu được hoạt tính chitinase cao nhất thì chủng B. subtilis B298 chỉ mất 15 giờ nuôi cấy (Lestari et al., 2017), trong khi đó xạ khuẩn S. sporovirgulis mất 4 ngày nuôi (Brzezinska, 2013). Bên cạnh đó, mỗi chủng vi sinh vật có nhiệt độ sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase không giống nhau: đối với vi khuẩn B. alvei NRC-14 là 28oC (Abdel-Aziz et al., 2012), đối với B. subtilis là 35oC (Chauhan và Singh, 2013). Ngoài ra, trong quá trình sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật cần phải có cơ chất chitin đóng vai trò như chất cảm ứng. Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một loại cơ chất chitin có nguồn gốc và nồng độ khác nhau: xạ khuẩn S. albus FS12 thích hợp nhất với cơ chất là bột vỏ tôm (Santhi, 2016). Chủng B. cereus TKU030 sinh chitinase và