Tóm tắt Luận án Thu thập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loại nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại từ vùng Thất Sơn, An Giang - Hồ Thị Thu Ba

chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng Đ ng trƣớc việc thay đổi khí hậu toàn cầu việc bảo tồn nguồn tài nguyên quí giá này là việc cần phải làm ngay Xuất phát từ những lý do trên, luận án “Thu thập, tuyển chọn và nghiên c u quy trình nuôi trồng hai loại nấm ăn và nấm dƣợc liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang” đƣợc th c hiện 2 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chung: Đƣa vào nuôi trồng một loài nấm ăn và một loài nấm dƣợc liệu thu thập hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang 1.2.2 Mục tiêu cụ thể: 1) Sƣu tầm một số loài nấm lớn ở vùng Thất Sơn An Giang, đi u tra mẫu nấm s dụng đƣợc từ ngƣời dân địa phƣơng, định danh mẫu nấm đƣợc chọn theo hình thái bên ngoài; (2) Xác định độc tính cấp, phân lập giữ giống nấm trên môi trƣờng PDA, định danh phân t các loài nấm không ch a độc tính; (3) Xác định thành phần dinh dƣ ng, dƣợc tính quan trọng các loài nấm Xác định một số thành phần dƣợc tính quan trọng trong nấm dƣợc liệu, th nghiệm độc tính bán trƣờng diễn và tác dụng kháng ung thƣ trên tế bào ung thƣ máu và ung thƣ đại tr c tràng của loại nấm dƣợc liệu; 4) Nghiên c u quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn chỉnh một loại nấm ăn và một loại nấm dƣợc liệu đƣợc chọn 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các loài nấm ăn và nấm dƣợc liệu hoang dại đ đƣợc ngƣời dân s dụng nhƣng chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng thu từ vùng rừng núi Thất Sơn, An Giang. 1.4 Thời gian và địa điểm thí nghiệm Th c hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 tại Trƣờng Đại học Cần Thơ 1.5 Những đóng góp mới của luận án Luận án mang tính mới là nghiên c u v hai loài nấm hoang dại hiện diện ở địa phƣơng là nấm dai Lentinus Squarosolus và nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp Trong đó 3 nấm dai là loài nấm ăn mới đƣợc nhân giống nuôi trồng thành công từ loài nấm hoang dại ngoài thiên nhiên đi u này hƣớng đến việc từng bƣớc ây d ng thƣơng hiệu nấm ăn thuần chủng Việt Nam Luận án cũng nuôi trồng thành công nấm Thƣợng Hoàng là loài nấm dƣợc liệu có giá trị cao không gây độc tính bán trƣờng diễn trên chuột th nghiệm Đây là loài nấm hoang dại mới đƣợc thu thập, phân lập và nghiên c u Đặc biệt nấm Thƣợng Hoàng có khả năng gây c chế s tăng sinh và gây chết đối với dòng tế bào ung thƣ đại tr c tràng Đi u này h a hẹn một ý nghĩa to lớn trong việc đi u trị bệnh ung thƣ nói chung và bệnh ung thƣ đại tr c tràng nói riêng 1.6 Bố cục của luận án Luận án dài 192 trang, gồm các phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phƣơng pháp nghiên c u, kết quả thảo luận, kết luận đ nghị và phụ lục Luận án có 56 bảng, 36 hình và 178 tài liệu tham khảo 4 Chương 3 PH N PHÁP N HI N C U 3.1 Vật liệu thí nghiệm Giống nấm hoang dại thu thập từ thiên nhiên vùng Thất Sơn, An Giang. 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu Luận án th c hiện 4 nội dung nghiên c u tổng quát Trong từng nội dung nghiên c u lớn này có các nội dung th c hiện nhỏ, tƣơng ng với các nội dung chi tiết sẽ đi kèm phƣơng pháp th c hiện Cụ thể đƣợc trình bày trong phần dƣới đây 3.2.1 Thu thập một số loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn An iang. Sau đó tiến hành điều tra khảo sát người dân địa phương tìm ra các loài nấm sử dụng được và định danh các loài nấm này 3.2.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn Mục đích: Sƣu tầm trên 20 loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn An Giang, lập bộ sƣu tập giống Định danh sơ bộ d a vào hình thái bên ngoài, với quy trình cơ bản dành cho đi u tra nấm ngoài thiên nhiên theo chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam Kiệt, 2012; Trịnh Tam Kiệt, 2013) * Chỉ tiêu theo dõi: hình ảnh giá thể nơi phát hiện nấm lớn; phân loại nhóm nấm thu thập đƣợc (nấm đƣợc ếp vào một trong bốn nhóm: Nấm ăn, nấm dƣợc liệu, nấm độc và chƣa biết ếp vào đâu) 3.2.1.2 Điều tra khảo sát các loài nấm người dân đã từng sử dụng 5 Mục đích: Sơ tuyển các loại nấm mới đ đƣợc ngƣời dân địa phƣơng s dụng nhƣng chƣa đƣợc nuôi trồng ở Việt Nam. 3.2.1.3 Định danh theo hình thái các mẫu nấm Các mẫu nấm thu thập đƣợc định danh hình thái bên ngoài, với quy trình cơ bản dành cho đi u tra nấm ngoài thiên nhiên theo chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam Kiệt, 2012; Trịnh Tam Kiệt, 2013) 3.2.2 Xác định độc tính cấp phân lập và giải trình tự ITS các loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại không chứa độc tính 3.2.2.1 Xác định độc tính cấp các mẫu nấm ăn được hoặc có giá trị dược liệu được chọn từ người dân địa phương Quá trình ác định độc tính cấp đƣợc th c hiện theo quy trình xác định độc tính cấp theo Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế: Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý của thuốc từ dƣợc thảo 2006) và d a theo phƣơng pháp ác định độc tính cấp của thuốc theo Đỗ Trung Đàm (1996). Chọn mẫu không ch a độc tính tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2.2 Phân lập các giống nấm không chứa độc tính được chọn Các mẫu nấm không gây độc tính cấp sẽ đƣợc phân lập giống và khảo sát hệ sợi trên môi trƣờng thạch PDA - Potato Dextrose Agar Nguyễn Lân Dũng, 2003). 3.2.2.3 Định danh các mẫu nấm được chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 3.2.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính độc tính bán trường diễn và thử tác động kháng ung thư của loài nấm dược liệu trên dòng tế bào ung thư máu và ung thư đại trực tràng 6 Mục đích: tuyển chọn một loại nấm ăn có giá trị dinh dƣ ng cao và một loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Tất cả các thí nghiệm trong nội dung này đƣợc th c hiện tại Viện Sâm và Dƣợc liệu Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng của loài nấm được tuyển chọn Mục đích: Xác định thành phần dinh dƣ ng có trong loài nấm đ đƣợc sơ tuyển ở nội dung 2 Qua đó, tuyển chọn một loại nấm ăn và một loài nấm dƣợc liệu có dinh dƣ ng cao Cách tiến hành: Định lƣợng các thành phần giá trị hiện diện trong mẫu b ng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp Xác định hàm lƣợng chất b o, chất đạm, các loại vitamin A, thành phần amino acid và các khoáng vi lƣợng can i, sắt, kẽm, kali 3.2.3.2 Xác định hàm lượng dược tính Mục đích: Xác định thành phần có dƣợc tính trong hai loài nấm dƣợc liệu đ đƣợc sơ tuyển ở nội dung 2 Qua đó, tuyển chọn lại một loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Cách tiến hành: Định lƣợng các thành phần giá trị hiện diện trong mẫu nhƣ định lƣợng triterpenoid, hàm lƣợng đƣờng kh đƣờng t do và polysaccharide Chọn ra loại nấm có hàm lƣợng cao hơn tiến hành đánh giá độc tính bán trƣờng diễn. 3.2.3.3 Đánh giá độc tính bán trường diễn của nấm Mục tiêu: ác định dòng nấm hoang dại đƣợc tuyển chọn không có độc tính bán trƣờng diễn để tiếp tục nghiên c u. Cách tiến hành: Xác định các chỉ tiêu cơ bản v dinh dƣ ng và dƣợc lý theo “Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý của thuốc từ Dƣợc thảo” Viện Dƣợc liệu – Bộ Y Tế, 2006). Tuyển chọn 7 một loại nấm ăn có giá trị dinh dƣ ng cao và một loài nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn của loài nấm dƣợc liệu đƣợc tuyển chọn 3.2.3.4 Đánh giá khả năng ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư của dịch cao chiết nấm Mục tiêu: ác định khả năng c chế s tăng trƣởng và gây chết tế bào ung thƣ máu, ung thƣ đại tr c tràng của dịch cao chiết nấm Cách tiến hành: thí nghiệm đƣợc tiến hành trên đĩa 96 giếng với các nồng độ khác nhau của dịch cao chiết nấm Đánh giá theo hình thái tế bào ung thƣ sau khi lý thuốc; khả năng sống của tế bào khi đƣợc lý với các nồng độ khác nhau 3.2.4 Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn ch nh 2 chủng nấm đ được tuyển chọn. Mẫu nấm đƣợc nhân giống cấp I, cấp II, nuôi trồng theo quy trình của Nguyễn Lân Dũng 2003) Mục tiêu: Hoàn thiện quy trình nuôi trồng một loài nấm ăn và một loài nấm dƣợc liệu đƣợc chọn ở trên. Cách tiến hành: thí nghiệm với các loại môi trƣờng cơ chất khác nhau để tìm ra môi trƣờng thích hợp cho quá trình sinh trƣởng, phát triển hệ sợi tơ, hình thành quả thể nhanh nhất và hiệu quả nhất. 3.2.4.1 Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm ăn a) Thí nghiệm 1: Xác định môi trƣờng cấy chuy n nấm ăn tốt nhất Mục đích: chọn đƣợc môi trƣờng cấy chuy n thuần hóa giống nấm ăn tốt nhất Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi s lan tơ của giống nấm trên các môi trƣờng và độ lan tơ trung bình trên các môi trƣờng 8 b ng cách đo độ sâu của s lan tơ cm) theo từng ngày th 3, th 5, th 7 tính từ ngày cấy chuy n Ghi nhận và so sánh thời gian lan tơ của giống nấm Chọn môi trƣờng cho tơ nấm lan nhanh và dày nhất, tiếp tục cho thí nghiệm tiếp theo b) Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng nhân giống nấm ăn Mục đích: Chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống nấm ăn phù hợp nhất Chỉ tiêu theo dõi: số ngày lan tơ 50% và 100% của nấm ăn trên môi trƣờng nhân giống Chọn môi trƣờng cho tơ nấm lan nhanh và dày nhất c) Thí nghiệm 3: Chọn môi trƣờng nuôi trồng tốt nhất Mục đích: tìm ra cơ chất thích hợp để trồng nấm ăn Chỉ tiêu theo dõi: số ngày lan tơ 50% và 100% của nấm ăn trên cơ chất nuôi trồng Chọn môi trƣờng cho tơ nấm lan nhanh và dày nhất 3.2.4.2 Quy trình nuôi trồng nấm dược liệu a) Thí nghiệm 1: Chọn l a môi trƣờng cấy chuy n giống tốt nhất b) Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng nhân giống nấm dƣợc liệu tốt nhất c) Thí nghiệm 3: Chọn l a môi trƣờng nuôi trồng nấm dƣợc liệu tốt nhất Cả ba thí nghiệm này làm tƣơng t thí nghiệm nấm ăn ở trên nhƣng môi trƣờng cơ chất có thay đổi có trình bày cụ thể phần kết quả 9 Chương 4 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 4.1 Thu thập một số loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn An iang điều tra khảo sát người dân địa phương tìm ra các loài nấm sử dụng được định danh các loài nấm này 4.1.1 Thu thập mẫu nấm Luận án đ thu thập đƣợc 28 mẫu nấm hoang dại tại vùng Bảy Núi An Giang núi Phú Cƣờng, núi Dài Năm Giếng, núi K t, núi Cô Tô, núi Nƣớc, núi Dài và núi Cấm) Kết quả, định danh và phân loại sơ bộ các mẫu nấm này gồm 11 loài chƣa đƣợc phân nhóm; 7 loài nấm có dƣợc tính; 5 loài nấm ăn và 5 loài nấm độc Năm loài nấm ăn bao gồm nấm tr ng Amanita caesarea m số 01), nấm tuyết Tremella fuciformis m số 09), nấm dai Lentinus squarosolus m số 14); nấm ngân nhĩ đỏ da cam Tremella cinnabarina m số 18); nấm tràm Tylopilus felleus m số 19). Bảy loài nấm có tính dƣợc gồm nấm lie da cam mỏng Pycnoporus sanguineus (mã số 02), nấm linh chi da trâu Amauroderma subresinosum (mã số 05), nấm Vân Chi Trametes sp m số 10), nấm rỉ vàng Phellenus givus m số 15), Linh Chi Tầng Ganoderma apllanatum m số 20), Phellenus sp m số 22), và linh chi đen Amauroderma niger m số 25) Năm loài nấm độc gồm nấm thuộc chi Scleradermataceae m số 03), hai loài thuộc chi Amanita m số 04 và m số 06), Chi Leucocoprinus (mã số 17), Chi Russula emetica m số 23) Các loài nấm chƣa phân nhóm đƣợc 11 loài) gồm Gymnopilus penetrans m số 07), Lycogala epidendrum m số 08), Mycena niveipes m số 11), Xylaria polymorpha m số 12), chi Thelephora m số 13), Cyathus striatus m số 16), Daldinia concentrica m số 21), Polyporus ciliatus m số 24), Cookeina sinensis m số 26), nấm Mộc Bá Huê chƣa định danh đƣợc m số 27) và chi Coprinopsis m số 28) 10 4.1.2 Điều tra khảo sát các mẫu nấm được chọn Trong 28 mẫu nấm hoang dại thu đƣợc khi khảo sát thông tin từ ngƣời dân địa phƣơng, có năm mẫu nấm có thể ăn đƣợc hoặc s dụng làm dƣợc liệu nấm Linh Chi Tầng , nấm Vân Chi, nấm Thƣợng Hoàng, nấm dai và nấm Mộc Bá Huê). 4.1.3 Định danh các loài nấm được chọn theo hình thái 4.1.3.1 Nấm Linh Chi Tầng Tên địa phƣơng: Linh Chi Tầng Sống trên thân cây, hệ cơ len lỏi trong mô cây đ chết còn tƣơi, phát hiện ở núi Cấm Bào t hình tr ng hơi cụt đầu Hình 4.1: Bào t và Nấm Linh Chi Tầng m số 20) Linh Chi Tầng là loại nấm có nhi u tầng, quả thể có hình quạt hay hình tròn, đƣờng kính từ 6-100 cm, dày từ 3-8 cm Nấm không có vỏ bóng trên mặt mũ nấm, không cuống, màu từ nâu dất đến nâu đen, nâu sẫm, các vân tăng trƣởng đồng tâm có thể nổi rõ hoặc không tạo thành những mấu lồi gồ gh trên mặt mũ nấm Nấm hóa gỗ, hóa sừng, sần sùi tạo nên vẻ cũ kỹ, m p nấm màu đen giống mũ nấm và uốn lƣợn chi u dày từ 0,5-1 cm. 4.1.3.2 Nấm Vân Chi Tên địa phƣơng nấm Vân Chi. Nấm Vân Chi là loại nấm không cuống, phát triển một bên Khi non quả thể dạng nhi u u lồi tròn, mọc thành dạng vành với m p tán màu trắng kem Nấm trƣởng thành có dạng 11 quả giả, chất da hóa gỗ Quả thể hình nan quạt có nhi u vân đồng tâm, chồng chất en kẽ nhau nhƣ ngói lợp, mũ nấm mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm kích thƣớc 40-50 cm Mặt trên tai nấm không có lông, có các vòng màu trắng đục đồng tâm, thịt nấm màu trắng Mặt dƣới nấm có các ống nhỏ, các ống này rất nhỏ khoảng 4-5 ống/mm Miệng ống tròn hay hơi tròn và chƣa thu nhận đƣợc bào t D a trên đặc điểm hình thái bên ngoài của nấm thấy r ng chúng có đặc điểm tƣơng đồng với nấm Vân Chi thuộc chi Trametes đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả trong nấm lớn ở Việt Nam tập 1 Hình 4.2: Nấm Vân Chi m số 10) 4.1.3.3 Nấm Thượng Hoàng Tên địa phƣơng: nấm Thƣợng Hoàng Hình 4.3: Nấm Thƣợng hoàng và bào t m số 22) Nấm Thƣợng Hoàng sống trên thân cây cổ thụ còn sống, ở độ cao khoảng 5 đến 10 m Quả thể không cuống với nhi u lớp ống, mô và ống màu nâu gỉ sắt, sống đơn độc, dạng 12 thon dài, gỗ m m Mặt trên, nâu sẫm tới đen, có r nh, lớp vỏ c ng màu nâu đậm tới đen, đôi chút n t nẻ tƣơng đối sâu Mặt mũ ban đầu phủ một lớp lông măng nhung màu vàng, dần trở nên sẫm màu hơn từ nâu đen tới đen, có nhi u mấu nhỏ, n t thành những vùng nhỏ M p mũ từ màu nâu vàng thịt nấm màu nâu gỉ sắt khi già và màu vàng khi non, thể sinh sản dạng ống, tầng mới sinh ra trên tầng cũ Bào t hình tròn vách hơi dày D a trên các đặc điểm ngoài nhận thấy loài này khá tƣơng đồng với loài Phellinus linteus, loài Phellinus igniarius và Phellinus lamaensis. Theo mô tả của Trịnh Tam Kiệt 2011) có thể kết luận đây là một loài thuộc chi Phellinus nhƣng chƣa thể ác định đƣợc tên loài, tạm thời nhận định loài nấm thu thập hoang dại m số 22 là loài Phellinus sp. 4.1.3.4 Nấm Dai Tên địa phƣơng: nấm Xoài Nấm dai có mũ hình phễu, đƣờng kính 2-15 cm, màu trắng, ở mặt trên phủ vẩy dạng lông màu nâu sáng Thịt nấm màu trắng, phiến nấm màu trắng, men dài uống cuống hẹp; cuống lệch, dài 3-5 cm, màu trắng đục, có phủ vẩy nhƣ mũ, không có vòng và bao gốc Nấm uất hiện vào tháng 3-11. Hình 4.4: Nấm Dai m số 14) và bào t Nấm này mọc từng cây riêng lẻ hay thành cụm lớn trên thân cây gỗ hay trên cây oài mục Khi nấm còn non ăn m m, 13 ngọt Khi nấm già thì ăn dai nên thƣờng chỉ nấu lấy nƣớc làm canh ăn Bào t nấm có dạng hình que D a vào những đặc điểm v hình thái quả thể của nấm mọc tại núi Cấm, thấy r ng chúng có đặc điểm tƣơng đồng với loại nấm dai Lentinus squarosolus đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả trong Nấm lớn ở Việt Nam tập 1 4.1.3.5 Nấm Mộc Bá Huê Tên địa phƣơng: Mộc Bá Huê Hình 4.5: Nấm Mộc Bá Huê m số 27) Là loài nấm sống trên rễ cây, thân n m trong đất, có thân đƣa lên, ung quanh là những quả thể nấm màu vàng nghệ hình trái tim, trên những quả thể có những chấm màu đen nhƣ hạt cát, từ thân nấm mọc ra rễ cũng màu vàng nghệ, chƣa thu nhận đƣợc bào t Đây là loài nấm khá mới chƣa có tác giả nào mô tả v hình thái bên ngoài cũng nhƣ định danh 4.2 Xác định độc tính cấp phân lập giữ giống nấm trên môi trường PDA định danh phân tử các loài nấm không chứa độc tính 4.2.1 Xác định độc tính cấp các mẫu nấm có giá trị được chọn từ người dân địa phương Sau 72 giờ th nghiệm li u tối đa, cả cao chiết nƣớc và cao chiết cồn đ u không gây chết chuột Li u s dụng đối với từng loại cao chiết trên từng loại nấm nhƣ bảng sau: Bảng 4.1: Tổng hợp liều tối đa cho chuột uống cao các loại nấm 14 Tên nấm Dmax(g) g nấm khô/kg thể trọng chuột Cao chiết nƣớc Cao chiết cồn Cao chiết nƣớc Cao chiết cồn Linh chi tầng 23,41 28,66 137,7 391,9 Thƣợng hoàng 22,86 27,97 134,5 383,4 Vân chi 23,42 28,80 132,9 388,2 Nâm Dai 23,51 29,72 111,1 338,9 Mộc bá huê 23,26 29,27 111,3 332,1 Tiếp tục theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi dùng cao chiết, không ghi nhận đƣợc triệu ch ng bất thƣờng nào, cho thấy các loài nấm không gây độc tính cấp trên chuột th nghiệm Các mẫu nấm này đƣợc phân lập để giữ giống. 4.2.2 Phân lập các loài nấm được chọn lọc ở nội dung 4.2.1 Môi trƣờng PDA đƣợc s dụng để phân lập các loại nấm thu đƣợc với cùng đi u kiện nhiệt độ và thời gian Kết quả cho thấy môi trƣờng PDA thích hợp để phân lập nấm Linh Chi Tầng, Thƣợng Hoàng, Vân Chi và nấm Dai nhƣng không phù hợp để phân lập nấm Mộc Bá Huê. Sau đó, tiến hành giải trình t ITS để định danh 4 loài nấm phân lập đƣợc 4.2.3 iải trình tự ITS xác định loài 4.2.3.1 Nấm Vân Chi Đoạn gen giải trình t dài 666 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 93% với một số loài trong chi Trametes trên cơ sở dữ liệu NCBI. Cùng với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012). Bƣớc đầu đánh giá mẫu nấm thu thập đƣợc thuộc chi Trametes. 4.2.3.2 Nấm Dai Đoạn gen giải trình t dài 567 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 96% với loài Lentinus squarrosulus trên cơ sở dữ liệu NCBI. 15 Cùng với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) mẫu nấm có thể Lentinus squarrosulus. 4.2.3.3 Linh Chi Tầng Đoạn gen giải trình t dài 631 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 97%, với loài Ganoderma applanatum. Kết hợp với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) có thể mẫu nấm này là Ganoderma applanatum. 4.2.3.4 Nấm Thượng Hoàng Đoạn gen giải trình t dài 653 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 92%, độ phủ 91% với loài Phellinus linteus trên cơ sở dữ liệu NCBI. Cùng với đánh giá hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) có thể tạm thời kết luận đây là một loài thuộc chi Phellinus. Tạm thời gọi tên là Phellinus sp. Qua hai nội dung nghiên c u lớn, bốn loài nấm đƣợc chọn để tiếp tục tiến hành nghiên c u là nấm dai Lentinus squarrosolus, nấm Linh Chi Tầng Ganoderma applanatum, nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp. và nấm Mộc Bá Huê. 4.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính độc tính bán trường diễn và thử tác động kháng ung thư của loài nấm dược liệu trên dòng tê bào ung thư máu và ung thư đại trực tràng 4.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng và dược tính các loài nấm được tuyển chọn Bảng tổng hợp thành phần các chất dinh dƣ ng có trong nấm b ng sắc ký lỏng cao áp đƣợc tổng hợp trong bảng sau: 16 Bảng 4.2: Thành phần dinh dưỡng và dược tính các loài nấm Thành phần Tên loài nấm % hàm lƣợng ác định /kg nấm Mộc bá huê Nấm dai Thƣợng hoàng Linh chi tầng Béo 7,01 vết Không xác định Không ác định mg/kg Protein 0,79 0,75 Không xác định Không ác định mg/kg 4- Hydroxyprolin 193 Không phát hiện 376 186 mg/kg Acid aspartic 624 695 2510 891 mg/kg Acid glutamic 759 693 1780 767 mg/kg Alanin 68,8 72,8 1460 623 mg/kg Cystine 1470 Không phát hiện 355 338 mg/kg Glycin 419 331 1810 566 mg/kg Histidin 176 169 520 259 mg/kg Isoleucin 106 113 829 421 mg/kg Leucin 439 432 1480 671 mg/kg Lysin 172 309 540 349 mg/kg Methionine 237 262 Không phát hiện 103 mg/kg Phenylalanin 244 245 658 470 mg/kg Prolin 649 495 1470 550 mg/kg Serin 245 313 1550 623 mg/kg Threonin 507 537 1610 563 mg/kg Tyrosin 117 165 158 193 mg/kg Valin 298 248 1190 494 mg/kg 17 Tro tổng 3,31 0,28 5,78 2,20 mg/kg Canxi 216 602 5370 2060 mg/kg Sắt 312 13,5 1650 2210 mg/kg Kali 3880 255 Không xác định Không ác định mg/kg Kẽm 20,8 23,4 25,9 36,4 mg/kg Vitamin A Không xác định Không xác định 1,04 0,91 mg/kg 4.3.2 Xác định thành phần dược tính có trong hai mẫu nấm Linh Chi Tầng và Thượng Hoàng Bảng 4.3. Thành phần dược tính của hai loài nấm dược liệu Mẫu nấm Hàm lƣợng triterpenoid có trong mẫu (%) Hàm lƣợng polysaccharid có trong mẫu (%) Hàm lƣợng đƣờng t do trung bình (%) Hàm lƣợng đƣờng kh trung bình (%) Linh chi tầng 1,10 0,46 29,42 22,07 Thƣợng hoàng 2,11 4,0 40,17 57,14 Khi so sánh một số giá trị dƣợc tính kết hợp bảng đánh giá thành phần dinh dƣ ng Bảng 4 2) hiện diện trong mẫu nghiên c u có thể chọn nấm Dai và Thƣợng Hoàng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo 4.3.3 Xác định độc tính bán trường diễn nấm Thượng Hoàng Chuột đƣợc th nghiệm là chuột đ c và chuột cái, 6 tuần tuổi Chuột đƣợc cho uống cao nấm Thƣợng Hoàng với li u 0,4 g/kg mỗi ngày, liên tục trong 1 tháng Thể trọng của chuột ở lô ch ng và lô uống cao nấm Thƣợng Hoàng tăng so với trƣớc th nghiệm; đồng thời, không có s khác biệt v s tăng trọng lƣợng cơ thể giữa hai lô, cho 18 thấy cao nấm Thƣợng Hoàng không ảnh hƣởng đến s phát triển của chuột trong thời gian cho uống Các thông số huyết học đƣợc so sánh ở cả hai nhóm chuột bao gồm: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công th c bạch cầu, tiểu cầu, các chỉ số liên quan đến hồng cầu nhƣ MCV, MCH, MCHC, RDW), thông số thuộc ch c năng gan GOT, GPT), protein toàn phần, triglyceride, thông số thuộc ch c năng thận creatinin, urea), khảo sát vi thể gan và thận Kết quả cho thấy, các thông số v huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc v ch c năng gan - thận n m trong giới hạn bình thƣờng ở cả hai lô chuột Kết quả giải phẫu vi thể mô gan, mô thận ở cả hai lô chuột đ u không ghi nhận đƣợc s bất thƣờng 4.3.4 Xác định khả năng tác dụng với tế bào ung thư của nấm Thượng Hoàng Phellinus sp. Sau 72 giờ tiếp úc với dịch cao chiết của nấm thƣợng hoàng Phellinus sp., tế bào ung thƣ máu dòng K562 không có thể hiện đáp ng Nồng độ cao chiết đƣợc s dụng trong thí nghiệm lần lƣợt là 5000 µg/ml; 2500 µg/ml, 1250 µg/ml; 625 µg/ml; 312 µg/ml; 156 µg/ml và 78 µg/ml Ở tất cả các nồng độ cao chiết s dụng, tế bào ung thƣ máu gần nhƣ vẫn phát triển bình thƣờng nhƣ nhóm đối ch ng Đối với tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116, sau 72 giờ tiếp úc với dịch cao chiết của nấm thƣợng hoàng Phellinus sp., tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116 đ có những biểu hiện bị c chế s sống Kết quả cho thấy hiệu quả c chế rõ rệt ngay ở nồng độ 16 µg/mL Từ nồng độ 250 µg/mL trở lên thấy đƣợc s c chế gia tăng rõ rệt Độ hợp dòng của tế bào HTC116 khi lý với cao chiết Phellinus sp. 16 µg/mL; 31 µg/mL; 62,5 µg/mL; 125 µg/mL; 250 µg/mL; 500 19 µg/mL và 1000 µg/mL lần lƣợt là 50%, 40%, 45%, 40%, 20%, 15% và 10%. Các kết quả thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với nghiên c u của các tác giả khác trên dòng tế bào ung thƣ máu và ung thƣ đại tr c tràng Alla,2010; Ji Hun, 2015) Tùy từng loại tế bào khác nhau mà biểu hiện thay đổi khác nhau, s thay đổi do cao chiết do Phellinus sp tác động có thể gây apoptosis trƣờng hợp HCT116) hoặc hỗ trợ gây apoptosis ở các tế bào trƣờng hợp K562). Hình 4.6: Đáp ng của dòng tế bào K562 đối với cao chiết của Phellinus sp Quan sát trên kính hiển vi đảo ngƣợc độ phóng đại 10X. a) tế bào K562, b) đĩa ch a tế bào K562 thêm CCPL nồng độ 500 µg/mL, c) thêm CCPL nồng độ 250 µg/mL, d) nồng độ 125 µg/mL, e) nồng độ 61,5 µg/mL 20 Hình 4.7: Đáp ng của HCT 116 với cao chiết Phellinus sp dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc, độ phóng đại 10X. a) đối ch ng b) HCT 116 thêm CCPL nồng độ 16 µg/mL c) nồng độ 31 µg/mL d) nồng độ 62,5 µg/mL e nồng độ 125 µg/mL f) nồng độ 250 µg/mL g) nồng độ 500 µg/mL h) nồng độ 1000 µg/mL. 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn ch nh 2 chủng nấm đ được tuyển chọn Trên môi trƣờng cấy chuy n, số liệu đƣợc ghi nhận b ng cách đo độ lan tơ cm) sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày trên môi trƣờng ống thạch nghiêng Đối với môi trƣờng nhân giống và môi trƣờng nuôi trồng sẽ ghi nhận số ngày tơ lan 50% và 100% ở cả hai loài trên. Số liệu đo đƣợc đƣợc lý b ng phần 21 m m SAS 9 1 3 và kết quả trung bình đƣợc thể hiện trong các bảng b ng phƣơng pháp DUNCAN với độ tin cậy 95% 4.4.1 Nghiên cứu quy trình trồng nấm dai L. squarrosolus Môi trƣờng PDD PDA bổ sung nƣớc dừa) đƣợc chọn để cấy chuy n nấm Dai. Môi trƣờng hạt lúa – cám gạo 5% là phù hợp cho tơ nấm Dai phát triển Môi trƣờng mùn cƣa bổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 70 ngày Sau những thí nghiệm trên tổng hợp qui trình nuôi trồng và thuần hóa nấm dai L. squarrosolus hoang dại nhƣ sau: Hình 4.8: Qui trình nuôi trồng nấm dai Lentinus squarrosolus. 22 4.4.2 Nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng Phellinus sp. Môi trƣờng PDA là môi trƣờng để nhân giống cấp 1 nấm Thƣợng Hoàng. Môi trƣờng hạt lúa bổ sung 5% cám là môi trƣờng đƣợc l a chọn để nhân giống cấp 2 nấm Thƣợng Hoàng. Môi trƣờng mùn cƣa bổ sung 5% bột bắp và 5% cám gạo có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 50 ngày và 70 ngày sau ra quả thể. Sau quá trình nghiên c u, qui trình nuôi trồng và thuần hóa giống Thƣợng Hoàng Phellinus sp. hoang dại nhƣ sau: Hình 4.9: Quy trình nhân giống nấm Thượng Hoàng (Phellinus sp.) 23 CH N 5: KẾT LUẬN V KIẾN N HỊ 5.1 Kết luận Luận án thu thập đƣợc 28 mẫu nấm hoang dại từ t nhiên trong đó có 5 mẫu nấm ăn, 7 mẫu