Ứng dụng chỉ thị phân tử ADN xác định gen phục vụ chọn tạo giống lúa thơm

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN XÁC ĐỊNH GEN PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng cho các nước đang phát triển, đặc biệt là Việt Nam. Nhìn vào thị trường tiêu thụ lúa gạo hiện nay, chúng ta cần phải đầu tư hơn nữa trong việc nâng cao chất lượng gạo, thông qua nhiều con đường để rút ngắn được thời gian và cung cấp kịp thời các giống cho sản xuất Trong những đặc tính lý hoá liên quan tới chất lượng gạo thì mùi thơm là một trong những đặc tính quan trọng. Sự biểu hiện tính trạng thơm trong lúa gạo thường bị tác động bởi điều kiện môi trường nên việc đánh giá để chọn lọc ra các dòng giống lúa thơm thường phải tiến hành trên nhiều vụ và chỉ tiến hành được khi đã thu hoạch lúa. Việc làm này không những tốn kém về tiền bạc mà còn cả về thời gian. Việc sử dụng chỉ thị phân tử (marker) để xác định các gen mong muốn ở các cá thể từ thế hệ sớm sẽ giúp cho công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và giống lúa nói riêng một cách hiệu quả hơn. Cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các chất tạo mùi thơm ở lúa cũng như bản chất di truyền của gen tạo mùi thơm. Người ta đã chứng minh rằng, chất thơm trong lúa được hợp thành từ hơn một trăm hợp chất dễ bay hơi như hydrocarbons, alcohol, aldehydes, ketones, acid, esters, phenols, pyridines, pyrazines và những hợp chất khác (Yajima và cộng sự, 1978). Trong đó, chất 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) được xem là hợp chất quan trọng nhất tạo mùi thơm ở tất cả các giống lúa Theo số liệu thống kê, hàm lượng 2AP ở những giống lúa thơm đạt tới 0,09 mg/kg, cao gấp 10 lần so với các các giống lúa không thơm (0,006-0,008 mg/kg) (Buttery và cộng sự, 1983). Chất tạo mùi 2AP được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây, trừ phần rễ (Lorieux và cộng sự, 1996). Di truyền tính trạng thơm ở lúa đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Khi nghiên cứu tỷ lệ phân ly giữa cá thể thơm và không thơm trong quần thể F2 của nhiều tổ hợp lai, một số nhà nghiên cứu cho rằng, có một số gen khác nhau (trội hoặc lặn) liên quan tới tính trạng thơm. Tuy nhiên, người ta đã khẳng định rằng, trong hầu hết các giống lúa thơm, gen đơn lặn (fgr) nằm trên nhiễm sắc thể số 8 chịu trách nhiệm sinh tổng hợp hợp chất 2AP là hợp chất chính của mùi thơm (Ahn và cộng sự, 1992). Gen này có khoảng cách di truyền với RFLP marker RG28 là 4,5 cm. Bằng việc sử dụng một số SSR markers khác như L02, L06, độ dài và vị trí của gen fgr cũng được xác định chính xác hơn. Gen fgr được xác định trên nhiễm sắc thể số 8, có độ dài khoảng 69 kb (Chen và cộng sự, 2006). Vanavichit và cộng sự (2004) đã xác định gen quy định mùi thơm bằng việc sử dụng nhiều SSR markers như RM223, RM339, RM342… và kỹ thuật fine mapping để xác định ra một đoạn nhiễm sắc thể khoảng 27,6 kb được đặt tên là Os2AP chứa 15 exon nằm trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển tính trạng không thơm ở lúa. Sự mất đoạn 8 bp trong exon thứ 7 đã kìm hãm hoạt động đồng hoá chất proline thành các hợp chất không thơm của đoạn gen trên và cung cấp nguồn proline cùng các chất trung gian khác để tạo ra chất thơm 2 acetyl-1 pyroline. Dựa trên những kết quả này thì Bralbury và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương pháp ASA (Allele Specific Amplication) với 4 cặp mồi: ESP, EAP, IFAP và INSP giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa đồng hợp tử thơm (cho băng 257 bp), dị hợp tử thơm (cho 2 băng dài 355 bp và 257 bp) và giống không thơm (cho băng dài 355 bp). Nguyên lý hoạt động của 4 mồi ESP, EAP, INSP, IFAP như sau: Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng một số chỉ thị phân tử ADN quy định gen mùi thơm fgr và đã chọn tạo được một số dòng lúa thơm. NỘI DUNG 1.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP - Trên 40 dòng, giống lúa thơm và không thơm đang được gieo trồng rộng rãi trong sản xuất Các chỉ thị phân tử là RG 28 (F và R), RM342 (F và R), L05 (F và R) và chỉ thị BADH2 gồm 4 mồi EAP, ESP, IFAP và INSP, cùng các hóa chất sử dụng trong tách chiết ADN và chạy điện di được sử dụng cho nghiên cứu. Các giống lúa được trồng trong điều kiện đồng ruộng tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vụ xuân và vụ mùa năm 2007-2008 Mẫu lá được thu khi cây được 30-35 ngày tuổi và được bảo quản trong điều kiện - 80oC đến tận khi phân tích. Phương pháp Tách chiết ADN 100 mg mẫu lá được nghiền nhỏ trong 800 µl dung dịch đệm chiết (NaCl 0,05 M, SDS 1%, EDTA 0,05 M, Tris HCl 0,01 M) bằng cối chày sứ. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 65 độ C trong 30 phút, rồi thêm 100 µl CH3COOK 5 M, trộn đều và để trên đá -20 độ C trong 20 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Thu và chuyển phần dung dịch phía trên sang ống 1,5 ml mới. Thêm vào ống 300 µl dung dịch Isopropanol, để ở nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút rồi thu chất kết tủa và rửa bằng Ethanol 80%, để khô trong 10 phút. Hoà tan ADN trong 200 µl TE, thêm vào 1 µl Rnase, ủ trong khoảng thời gian 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa phần kết tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào hòa tan ADN để sử dụng.phút ở 37 độ C, thêm vào 10 µl CH3COONa và 200 µl Ethanol 100%, trộn đều và để ở nhiệt độ phòng 30 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút rồi thu kết tủa ADN ở đáy ống nghiệm. Rửa phần kết tủa bằng Ethanol 70%, để khô và cho TE vào hòa tan ADN để sử dụng. Phản ứng PCR Đối với primer RG28, RM342, L05 mỗi một 10 µl phản ứng nhân gen chứa 20 ng ADN của mẫu, 0,5 đơn vị Taq polymerase, 10 X PCR buffer, 20 mM MgCl2, 1 mM dNTPs và 5 uM primer. Phản ứng nhân gen được tiến hành trên máy Bio-rad 9800 với các chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Giữ ở 94 độ C trong 5 phút; bước 2: 94 độ C trong 30 giây; bước 3: 550C trong 30 giây; bước 4: 72 độ C trong 1 phút 30 giây; bước 5: 72 độ C trong 5 phút; và bước 6: Giữ ở 4 độ C. Chu kỳ nhiệt từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 35 chu kỳ. Đối với primer BADH2 mỗi một 25 µl phản ứng nhân gen chứa 10 ng ADN mẫu, 0,2 đơn vị Taq polymerase, 10 X PCR buffer, 10 mM MgCl2, 1 mM dNTPs và 2 uM primer. Phản ứng nhân gen được tiến hành trên máy Bio-rad 9800 với chu kỳ nhiệt như sau: Bước 1: 94 độ C trong 2 phút; bước 2: 94 độ C trong 30 giây; bước 3: 58 độ C trong 30 giây; bước 4: 72 độ C trong 30 giây; bước 5: 72 độ C trong 5 phút; bước 6: Giữ ở 4 độ C. Chu kỳ nhiệt từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên agarose 1,5% và ladder 100 kb được nhuộm bằng Ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, sau đó được soi và chụp ảnh bằng hệ thống chụp và phân tích hình ảnh Gel Doc 2000. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định chỉ thị phân tử ADN liên kết với gen thơm fgr trong lúa Kết quả đánh giá sự đa hình của sản phẩm điện di ADN của các giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị RG28 và RM342 Kết quả cho thấy: Đối với chỉ thị RG28 và RM342, các sản phẩm điện di ADN của các giống không cho sự đa hình . Điều này cho thấy, sử dụng chỉ thị RG28 và RM342 chưa phân biệt được các giống lúa mang gen thơm và không mang gen thơm. Kết quả đánh giá sự đa hình của sản phẩm điện di PCR của các giống lúa thơm và không thơm sử dụng chỉ thị L05 và chỉ thị BADH2 Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử L05 và BADH2 trong phân loại các giống mang gen thơm và không mang gen thơm. Đối với chỉ thị L05, sản phẩm điện di ADN của các giống khác nhau có sự đa hình: Các giống lúa không thơm như Q5 và 94-30 sản phẩm điện di ADN ở khoảng gần 300 bp và các giống còn lại (trong đó có 3 giống lúa thơm là AC5, Bắc thơm, Hương thơm số 1 và 1 giống lúa không thơm KD) cho sản phẩm điện di ở khoảng 250 bp. Như vậy, sử dụng chỉ thị L05 đã phân biệt được các giống lúa mang gen thơm với một số giống lúa không mang gen thơm fgr nhưng ở mức độ chính xác không cao. Đối với chỉ thị BADH2, sản phẩm điện di ADN của các giống khác nhau cho đa hình rất rõ nét. Có thể thấy ở tất cả các giống đều xuất hiện băng ADN như nhau ở khoảng xấp xỉ 600 bp. Tuy nhiên, đối với các giống lúa không thơm như Q5, KD, 94-30 (băng 3, 4 và 8) thì sản phẩm điện di ADN xuất hiện thêm băng ở khoảng 350 bp, còn đối với các giống lúa thơm AC5, BT, HTS1 (băng 5, 6 và 7) thì sản phẩm điện di xuất hiện thêm băng ở khoảng 250 bp. Như vậy, chỉ thị phân tử BADH2 đã xác định được chính xác sự khác nhau giữa giống lúa mang gen thơm và giống lúa không mang gen thơm. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử BADH2 để xác định các giống lúa mang gen thơm trong tập đoàn bố mẹ gồm 42 giống được trình bày ở bảng dưới. Có thể thấy việc sử dụng chỉ thị BADH2 đã xác định được toàn bộ các giống lúa thơm có mang gen thơm fgr với các giống lúa không thơm. Điều đó cho thấy chỉ thị phân tử BADH2 có độ tin cậy và chính xác rất cao trong việc phân biệt các giống lúa mang gen thơm fgr (lúa thơm) và không mang gen thơm fgr (lúa không thơm). Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử để xác định các dòng lúa mang gen thơm từ các thế hệ sớm Việc sử dụng chỉ thị phân tử BADH2 để xác định các dòng lúa mang gen thơm từ các thế hệ sớm đã được tiến hành trong năm 2008. Mỗi dòng được xác định trên 15 cá thể. Kết quả điện di sản phẩm ADN được đưa ra đại diện trong hình 3 cho thấy các dòng số 1, 5, 7, 10, 13, 14, 16 (tương ứng với giếng 3, 7, 9, 12, 15, 16 và 18) là các giống lúa không chứa gen thơm fgr (có vệt băng khoảng 355 bp); các dòng số 2 và số 3 (tương ứng với giếng số 4 và số 5) là những dòng mang gen thơm fgr dị hợp tử (vệt băng 257 bp và 355 bp); các dòng còn lại là dòng số 4, 6, 8, 9, 11, 12, 15 (tương ứng với giếng số 6, 8, 10, 11,13, 14 và 17) là những dòng mang gen thơm fgr đồng hợp tử (vệt băng 257 bp). Kết quả xác định gen thơm trong tập đoàn từ F4 tới F6 và một số dòng DH (dòng thuần được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn) được chọn lọc từ các tổ hợp lai giữa các giống lúa thơm và không thơm cho thấy: Trong 420 dòng lúa được đánh giá có 73 dòng mang gen thơm đồng hợp tử (chiếm 17,4%), 91 dòng mang gen thơm dị hợp tử (chiếm 21,7%) và 256 dòng không mang gen thơm (chiếm 60,9%). Các dòng lúa mang gen thơm đồng hợp tử là các dòng đã thuần về tính trạng gen thơm fgr sẽ được đánh giá và đưa vào so sánh, đánh giá các tính trạng nông học khác; các dòng mang gen thơm dị hợp tử sẽ được tiếp tục lựa chọn để chọn ra các dòng thuần về gen thơm. Tuy nhiên, tỷ lệ rất cao của các dòng không mang gen thơm trong tập đoàn các dòng lúa mới cho thấy việc cần thiết phải chọn các cá thể và dòng mang gen thơm từ các thế hệ sớm hơn như F2, F3 để giảm khối lượng các dòng cần phải đưa vào đánh giá và chọn lọc trong các thế hệ về sau. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết quả xác định và đánh giá độ tin cậy của các chỉ thị phân tử liên kết với gen quy định mùi thơm fgr đã được tiến hành trên 40 dòng, giống lúa thơm và không thơm cho thấy: Các chỉ thị phân tử RG28, RM342 không phân biệt được các giống lúa mang gen thơm và không mang gen thơm; chỉ thị phân tử L05 có thể phân biệt được giữa các giống lúa thơm và không thơm, nhưng độ chính xác không cao; chỉ thị phân tử BADH2 đã phân biệt chính xác 100% các giống lúa thơm và không thơm. Đây là chỉ thị cần được sử dụng trong công tác chọn tạo giống lúa thơm trong thời gian tới. Kết quả của việc sử dụng chỉ thị phân tử BADH2 để xác định sự có mặt của gen thơm fgr trong tập đoàn 420 dòng lúa mới ở các thế hệ từ F4-F6: Đã xác định được 73 dòng mang gen thơm fgr đồng hợp tử và 91 dòng mang gen thơm fgr dị hợp tử. Các dòng lúa này cần được tiếp tục chọn lọc, đánh giá và so sánh để chọn ra các dòng thuần mang gen thơm cùng các đặc tính nông học quan trọng khác. Những tiến bộ kỹ thuật về chuyển nạp gen, ứng dụng marker phân tử trong chọn lọc giống lúa cho phép chúng ta nghĩ đến một giống lúa dạng hình mới đột phá ngưỡng năng suất hiện nay, có khả năng chống chịu sâu bệnh hại ổn định, chống chịu phèn, khô hạn tốt, có phẩm chất gạo tốt về xay chà, phẩm chất cơm, phẩm chất dinh dưỡng. Những tiến bộ kỹ thuật hiện nay và tương lai gần cho phép chúng ta thực hiện việc đa dạng sinh học trong sản xuất lương thực Một số hình ảnh