Urease và protease trong thể tiết của helicobacter pylori, chủng VNH -85

UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦA Helicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85 Nguyễn Hoàng Uyên & Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công Nghệ Sinh học I. MỞ ĐẦU Các dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của Helicobacter pylori mang một số protein là yếu tố bệnh lý như VacA [1], CagA và HP1125 [2, 3]. Các protein đã được xác định là những độc tính gây bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu ở điều kiện invitro cho thấy, các dịch thể có thể xâm nhập vào bên trong tế bào ung thư dạ dày AGS, gây nên sự cường tiết của interleukin IL-8 [4]. Có đến 80% số tế bào AGS bị chết dưới ảnh hưởng của các độc chất chứa trong dịch thể. Những tế bào sống sót đã tăng sinh gấp hai lần [5]. Urease là một trong những yếu tố giúp cho vi khuẩn Helicobacter pylori sống trong dạ dày của ngưòi, do phân huỷ urea và nâng cao độ pH của dịch dạ dày [6,7]. Urease tổng hợp trong tế bào vi khuẩn và có thể được đưa ra bên ngòai theo cơ chế tự autolysis [6, 7]. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo phát hiện urease và protease trong các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-85 phân lập từ một bệnh nhân Việt Nam bị loét dạ dày. Đây là 2 protein, sau cagA, VacA và HP1125 được tìm thấy trong các thể dịch của vi khuẩn. Như vậy, sự có mặt của nhiều protein trong dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori mang các hoạt tính sinh học khác nhau nhấn mạnh các vai trò chưa biết của chúng trong quá trình phát triển bệnh ở người. II. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu - Phân lập chủng vi khuẩn Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VHN - 85 được phân lập và nuôi cấy như đã miêu tả [8]. Sau khi nuôi ở điều kiện chuẩn trong ba ngày, vi khuẩn được thu thập cho các nghiên cứu tiếp. 2. Phương pháp - Tách chiết các dịch thể Các dịch thể được thu nhận như đã miêu tả [9]. Chế phẩm được bảo quản ở –200C trong vòng một năm. - Xác định hoạt tính urease a) Các dịch thể được ủ trong 0,.2 ml dung dịch đệm phosphate pH = 6 (Urea 2%; NaH2PO4 0.428% và Na2HPO4 1% ) trong 30 phút ở 370 C. 10 l của phản ứng được lấy ra ở các thời điểm khác nhau để xác định hàm lượngNH3 b) bằng phương pháp Berthellot. NH3 được xác định theo phương pháp của Berthellot như sau: Chuẩn bị ba dung dịch có thành phần: 1) 2% Na - phenolate 2)50 gram Na Nitroprusside trong 1 lit nước cất 3)15% NaOCl Các dung dịch được chuẩn bị và bảo quản lạnh. Phản ứng định lượng màu được tiến hành như sau: Cho 0.1 - 1 l mẫu vào ống nghiêm sạch và 2 ml nước cất. Cho thêm vào ống nghiệm 3 dung dịch đã chuẩn bị như trên theo thứ tự 1ml dung dịch 1; 0. 5 ml dung dịch hai và ba. Lắc ống nghiệm sau mỗi lần cho chất vào. Các ống nghiệm được ủ ở nhiệt độ phòng khỏang 30 phút, sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 630nm. Đường chuẩn được xây dưng cho các hàm lượng NH3 là 0-5 g. Phương pháp cho phép xác định lượng NH3 nhỏ nhất là 0.5 g. - Xác định hoạt tính protease của các dịch thể Sự có mặt của các protease trong dịch thể được xác định bằng phương pháp SDS-PAGE zymogram protease. Tủa dịch thể trong cồn tuyệt đối (1:1) ở –200C. Ly tâm tủa ở 4oC trong 15 phút, sau đó hoà tủa trong nước cất để chạy điện di SDS-PAGE 70V trong 2 giờ. Sau SDS-PAGE, ủ gel trong dung dịch 3% casein đệm Tris-HCl 50 mM, pH 8 ở 400C trong vòng 30 phút, sau đó rửa sạch gel trong nước cất và nhuộm bằng dung dịch 40% ethanol, 10% acid acetic, 0.1 % Coomasie Blue trong 4 giờ. Sau khi tẩy trong dung dịch 40% ethanol., 10% acid acetic, băng protein có hoạt tính protease hiện lên màu trắng. Protein albumin chuẩn được sử dụng làm đối chứng. III - KẾT QUẢ 1. Phát hiện sự thay đổi pH của dịch đệm Các dịch thể sau khi được tách chiết từ dịch nổi nuôi cấy của vi khuẩn Helicobacter pylori bằng phương pháp siêu ly tâm được ủ trong dung dịch đệm có pH = 6,9. Sau một vài phút, màu của dung dịch đã đổi từ vàng sang đỏ, chứng tỏ có sự thay đổi pH từ vùng acid sang vùng kiềm ( hình 1). Tính chất nói trên được bảo toàn khi tiến hành thí nghiệm với các chế phẩm được bảo quản ở - 20oC trong nhiều năm. 2. Xác định NH3 giải phóng ra trong phản ứng sinh hoá Sự dịch chuyển pH của dung dịch đệm có thể do một chất nào đó có bản chất kiềm đã xuất hiện trong quá trình ủ dịch thể với urea. Trong trường hợp, dung dịch đệm không chứa urea, hiện tượng chuyển dịch pH đã không xẩy ra. Như thế, các kết quả cho phép kết luận urea chính là cơ chất của phản ứng sinh hoá mà chúng tôi vừa trình bầy. Các phân tích sử dụng phương pháp của Berthellot để xác định NH3 cho thấy NH3 đã được giải phóng trong quá trình men học nói trên (hình 2a và 2b). Trên biểu đồ, thời gian cần thiết (lag time) để bắt đầu phản ứng hoá học là 15 phút. Tốc độ giải phóng NH3 tỷ lệ thuận với thời gian của phản ứng. 3. Xác định hoạt tính protease của các dịch thể. Hoạt tính protease của các dịch thể được phát hiện khi gel được tẩy bằng dung dịch 40% ethanol và 10% acid acetic (hình 3). Trên ảnh chụp, ít nhất một băng protein có phân tử lượng khoảng 50 kDa đã xuất hiện trên zymoram đồ. Như vậy, các protein urease và protease, ngoài cagA, HP1125 và vacA đã được phát hiện trong thể tiết của chủng vi khuẩn Helicobacter pylori VNH-85 (Việt Nam). Các dịch thể, do vậy chứa nhiều các protein bệnh lý quan trọng của vi khuẩn. Do các dịch thể có thể xâm nhập vào bên trong tế bào ung thư AGS gây nên các thay đổi nhất định bên trong tế bào trong điều kiện invitro, nên chúng có thể là một trong các phương tiện tương tác của vi khuẩn HP và vật chủ. ý nghĩa của từng loại protein có trong dịch thể và ảnh hưởng của nó đối với con người trong điều kiện invivo chưa được biết rõ. Hình 1- Sự thay đổi pH của dung dịch đệm khi ủ với các dịch thể. 5 g dịch thể được ử trong 200 l dung dịch đệm phosphate pH 6,9. a) mẫu thí nghiệm b) mẫu đối chứng không có dịch thể. Hình 2- Xác định NH3 được giải phóng trong phản ứng sinh hoá. A - Đường chuẩn đo hàm lượng NH3 Trục tung chỉ OD, còn trục hoành biểu diễn hàm lượng NH3 trong mẫu. 1: 0.5.; 2: 1; 3: 1,5... g NH3 ) Hình 3. Một protease có phân tử lượng khoảng 50 kDa (được chỉ bằng mũi tên) được tìm thấy trong thể dịch của Helicobacter pylori. 1. Mẫu dịch thể 2. Protein chuẩn có phân tử lượng 97, 66, 45,30, 20 và 16 kDa theo thứ tự từ trên xuống dưới, IV- KẾT LUẬN 1. Bằng các phương pháp sinh hoá, chúng tôi đã phát hiện sự có mặt của men urease trong các dịch thể tiết của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-85 phân lập từ một bệnh nhân Việt Nam bị loét dạ dày. 2. Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và sử dụng casein làm cơ chất, chúng tôi đã phát hiện một protease có phân tử lượng khoảng 50 kDa trong dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-85. 3. Các dịch thể, do mang nhiều protein bệnh lý là có thể là phương tiện tương tác của vi khuẩn với người bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 - Fiocca, R; Necchi, V; Sommi, P., Ricci, V; Telford, J; Cover, T.L; Solicia, E (1999). Release of Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin by both a specific secrection pathway and budding of outer membrane vesicles. Uptake of released toxin and vesicles by gastric epithelium. J. Pathol. 188 : 220-226. 2 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Các protein trong các thể tiết cuả vi khuẩn Helicobacter pylori. Tạp chí Y học dự phòng. Tập XIII, số 2+3 (60). Tr 21-24. 3 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Lê Băng Sơn, Juanita, L. M. và cs . Sự hình thành các dịch thể từ màng ngoài của vi khuẩn Helicobacter pylori (đang in). 4 - Juanita, .M; Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Protein cagA xâm nhập tế bào ung thư dạ dày AGS qua con đường dịch thể của Helicobacter pylori (đang in). 5 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Ảnh hưởng của dịch thể của vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VNH-85 lên sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày AGS ( đang in). 6 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi (2001). Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori khiếm khuyết gene urease B ở các bệnh nhân viêm loét và ung thư dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa học hoá sinh y dược năm 2001- Các báo cáo khoa học. Trang106 - 113. 7 - Segal E. D ; Shon J; Tompkins L. S (1992). Characterization of Helicobacter pylori urease mutants. 1: Infect Immun 60 (5): 1883 - 9. 8 - Trần Công Tước., Trần Quỳnh Hoa., Nguyễn Thị Hồng Hạnh., Nguyễn Vân Phủng và Bùi Phương Thuân (2000). Sự có mặt của vi khuẩn Helicobacter pylori mang CagA+ trong các sinh thiết dạdày của người Việt Nam. Tạp chí Sinh học 23 (2) : 51 - 54. 9 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Các protein trong các thể tiết cuả vi khuẩn Helicobacter pylori. Tạp chí Y học dự phòng. Tập XIII, số 2+3 (60). Tr 21 - 24. 10 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Protein hp1125 tạo phức nhị phân trong màng nguyên sinh của vi khuẩn Helicobacter85 (đang pylori VHN in). SUMMARY THE UREASE AND THE PROTEASE CONTAINED IN THE VESICLES RELEASED BY HELICOBACTER PYLORI Nguyen Hoang Uyen & Nguyen Thi Hong Hanh Institute of Biotechnology Bacterium Helicobacter pylori colonize in the stomach of human being as well as of the other animals. They are the causative agents of different gastric disease such as ulceration of the stomach and duodenal…The bacterium possede different virulent factors such as CagA, VacA, urease…The vesicles released from outer membrane of Helicobacter pylori VNH - 85 contain several proteins such as VacA, CagA and HP1125 protein. In this paper we showed that the bacterium vesicles of the bacterium contain in addition at least two other proteins, namely urease and protease. Therefore, at least five proteins were detected in the vesicles of the bacterium. The finding raised the question about biological roles of these virulent factors contained in the vesicles for the pathology of the bacteria. Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Nguyễn Chí Thuận.