Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT - PCR

ễn Đ Luận văn Th 15 ự phân bố của các kiểu gen [4 ộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV ên quan chặt chẽ với nhau. Trong đ ng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con s ư 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng h ình truyền máu và dùng chung kim tiêm gi òng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớ Đây là những kiểu gen được gặp ph ới nhất đã được thu thậ ương pháp điều trị virus khác). Trong ố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân b ủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung Kông và Việt Nam [42,44]. Kiểu gen 1a được phân b bắc Âu và Mỹ, các nướ nghiệp hóa. Kiểu gen 1b th b Type 4a phân b Type 5a thường tìm thấy duy nhất ở Nam Phi Việt Nam, các Hồng Kông và Autralia Âu ấy Địa ông ạc sĩ khoa học 4]. đều có chứa ó, sự khác biệt của ố này là ơn cả, điều này có ữa những người n là phân bố ở các ổ biến nhất trong p trên các phản ứng đó 1a phân bố ố địa trung hải đông, type 5 ở ố rộng rãi ở c có nền công ường thường phân ố toàn thế giới ố rộng rãi ở Trung Đông Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 16 Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực châu Phi và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ thể. Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến. Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng sự có mặt của các kiểu gen này có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44]. Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành. Thật vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42]. Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6. Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42]. Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia [42,44]. Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42] và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2- 3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42]. Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á. Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với 54,9%)[2] Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV: +Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV mạn cao (>80%) Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 17 + Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm + Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới) 1.3. Bệnh học viêm gan virut C 1.3.1. Dịch tễ học HCV lây truyền bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, dây cầm máu, ống hút, ống píp,vv Kim dùng xăm mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV, dùng chung các vật dụng cá nhân như dao cạo, bàn chải đánh răng hay dũa móng tay tuy ít nguy cơ nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh. Trước năm 1992, nhiều người đã bị nhiễm HCV qua máu hoặc do nhận máu của người khác. Đến năm 1992, cách thử máu đáng tin cậy để xác định kháng thể HCV được sử dụng và từ đó các nguồn cung cấp máu được thử nghiệm. Ngày nay, tỉ lệ lây nhiễm HCV do truyền máu bị nhiễm rất thấp dưới 0.01 % một số ít (khoảng 1%- 3% người có quan hệ tình dục khác phái, một vợ một chồng) có thể bị lây nhiễm HCV do có quan hệ tình dục không an toàn. Những người thuộc nhóm có “nguy cơ mắc bệnh cao” (như đàn ông đồng tính, mãi dâm, người có nhiều bạn tình, người mang bệnh lây qua đường tình dục) thường dễ bị nhiễm HCV qua đường tình dục hơn. Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm như bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thêt tránh được có thể tiếp xúc trực tiếp với máu của người mang bệnh. Khoảng 5% những bà mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước hoặc trong khi sinh nở. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu của người mẹ. Có đến 10% người có HCV không xác định được tại sao họ bị mắc Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 18 bệnh. HCV không lây truyền qua những tiếp xúc thông thường hang ngày như ăn chung bàn, uống chung ly nước, ôm, hắt hơi hoặc ho. 1.3.2. Diễn biến của bệnh nhân nhiễm virut viêm gan C Viêm gan C cấp tính Khỏi (10-30%) Mang các dấu ấn của HCV mạn tính (70-90%) Mang dấu ấn âm tính không triệu chứng 50% VGMT tối thiểu 50% Xơ gan 10% Ung thư gan 2% Các triệu chứng thường gặp: Nhiều người không có hoặc có một ít triệu chứng trong giai đoạn nhiễm HCV cấp tính. Phần lớn các người mang bệnh HCV kinh niên cũng không có triệu chứng nào và vẫn sống gần như bình thường. Tuy nhiên, những người khác có triệu chứng giống như bị cảm cúm nhẹ như buồn nôn, mệt mỏi, sốt, nhức đầu, ăn không ngon, đau vùng bụng, và nhức bắp thịt hay ở khớp. Một số người lại có những triệu chứng như bị cảm cúm nặng, cũng như vàng da và mắt bị đục, nước tiểu đậm. Sau một thời gian (thường là nhiều năm hoặc vài chục năm), người có bệnh HCV kinh niên có thể có những triệu chứng liên quan đến hư gan. Viêm Gan C kinh niên có thể liên quan đến nhiều triệu chứng khác. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 19 1.3.3. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh viêm gan virut C 1.3.3.1. Các xét nghiệm kháng thể HCV + ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV + RIBA là cuộc thử nghiệm kháng thể thứ nhì, có thể được dung sau cuộc thử nghiệm Elisa,để xác nhận sự hiện diện của kháng thể HCV 1.3.3.2. Xét nghiệm số lượng siêu vi C Cuộc xét nghiệm đo số lượng HCV lưu truyền trong máu. Đơn vị đo lường siêu vi HCV là số lượng mỗi mili-lít(ml) máu hoặc đơn vị đo lường tiêu chuẩn được gọi là Đơn Vị Quốc Tế (International Units). 1.3.3.3. Xét nghiệm chức năng và sinh hóa của gan Có một số cuộc thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan. Bảng thử nghiệm gan (hepatic panel) gồm các số đo lường chức năng của gan. Số đo lường phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate aminotransferase - mà trước đây gọi là SGPT và SGOT). ALT và AST là những chất men (enzymes) được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở người bị nhiễm HCV. Nhiều người có HCV có chỉ số cao của hai loại men gan này, thường là dấu hiệu đầu tiên là họ đã bị nhiễm bệnh. Những cách đo lường khác là ALK và GGT. (alkaline phosphatase & gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được sử dụng trong việc thử nghiệm. 1.3.3.4 Sinh thiết gan Sinh thiết ( hay thử mẫu tế bào) gan được dùng để đo lường mức độ viêm, số lượng sẹo, và tình trạng sức khỏe của gan. Việc này cũng có thể dùng để xác định cách chữatrị. Cách thức thông thường nhất là làm tê da và bắp thịt rồi nhanh chóng Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 20 đưa một kim dài và nhỏ vào gan và rút ra để lấy mẫu thử nghiệm. Cách thức này làm nhiều người sợ, nhưng rất hiếm có biến chứng. 1.3.3.5 Xét nghiệm phân định loại HCV (Genotype HCV) Cuộc xét nghiệm phân định loại HCV được dùng để xác định bạn bị nhiễm loại HCV nào. Ðiều này rất hữu ích cho việc quyết định cách chữa trị, như là chọn lựa loại thuốc, và cần điều trị bao lâu. 1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ thuật Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing). 1.4.1. Kỹ thuật Real-time PCR Real-time PCR là kỹ thuật PCR( Polymerase chain reaction-Phản ứng chuỗi polymerase) mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là Real-time. Như vậy, có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 21 1.4.1.1. Lịch sử phát hiện kỹ thuật PCR Vào một buổi tối cuối tuần tháng 4 năm 1983, trong lúc đang lái xe trên đường ở gần vùng đồi núi của California, một ý tưởng lóe lên trong đầu của Kary Mullis khi ông phải lùi xe lại do chạy lố đường, hình ảnh hai làn bánh xe mới tách khỏi hai làn bánh xe cũ:” Dùng nhiệt độ tách đôi sợi AND thành hai mạch đơn’’. Lúc đó Kary Mullis chỉ là một nhà hóa sinh học bình thường, đang làm việc tại một phòng thí nghiệm nhỏ. Từ ý tưởng đó, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR ( phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hóa học nhờ phát minh này. 1.4.1.2. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ một đoạn ADN chọn lọc, nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn nữa trong một thời gian ngắn. Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào. Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức bị tách thành hai nhánh đơn. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzyme ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp. Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN mồi (primer) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn. Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi đông, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp. Mồi khởi động mang tính đặc thù riêng cho mỗi AND có trình tự nhất định. Với mỗi loại mồi khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 22 Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như thế để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn. Hình 1.7 : Minh họa kỹ thuật PCR ( P1 và P2: các đoạn mồi primer ) 1.4.1.3. Nguyên lý kỹ thuật RT-PCR Phương pháp dựa sự phiên mã ngược của bộ gên RNA của HCV thành cDNA bằng mồi ngẫu nhiên rồi sau đó sử dụng PCR để khuếch đại một đoạn đặc hiệu dài khoảng 240bp trên vùng 5’NC của HCV-cDNA. Trong khi chạy PCR,một khi có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị thủy giải bởi men taq polymerase ( nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài. Sự thủy giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real time của máy. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 23 Hình 1.8: Nguyên lý kĩ thuật Real time PCR sử dụng Taqman Probe (phát hiện , đinh lượng và định type HCV). 1.4.1.4. Máy Real-time PCR [10] Điều kiện đầu tiên để có thể thực hiện được Real-time PCR (RT - PCR) là phải có máy RT - PCR. Máy này cũng có một buồng ủ nhiệt chạy được chương trình Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 24 luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị được gọi là thiết bị real-time. Đây là một thiết bị quang học có hai chức năng: + Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các tube phản ứng RT- PCR. + Có được camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các tube phản ứng RT- PCR khi các tube phản ứng này được chiếu các tia sáng kích thích. 1.4.2. Kỹ thuật Sequencing Nguyên lý: Kỹ thuật Sequencing dựa trên phương pháp enzyme Sanger (phương pháp đầu tận cùng của chuỗi). Chìa khóa của phản ứng này là sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp ADN. Do đó khi enzyme AND polymerase gắn chúng vào sợi AND thì quá trình tổng hợp bị ngừng lại. Vì vậy phương pháp này còn được gọi là phương pháp dideoxy[5]. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 25 Hình 1.9 : Qúa trình tổng hợp chuỗi AND khi có mặt của didNTP Hình 1.10: Xác định trình tự nucleotid Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 26 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012. Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai. Tổng số mẫu xét nghiệm antiHCV (+) là 239 mẫu trong đó có 228 mẫu có số lượng virut >102copies/ml máu mới xác định kiểu gen bằng kỹ thuật RT- PCR. Bệnh nhân có các tiêu chuẩn sau: + Đã xác định Anti HCV (+). + Không đồng nhiễm với các virut gây viêm gan khác như HBV, HGV. + Không đồng nhiễm với HIV. + Số lượng virut >102copies/ml máu. 2.2. Dụng cụ và hóa sinh phẩm 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị Dụng cụ: Kim tiêm các loại,Tube các loại, Pipet các loại, Đầu côn các loại. Trang thiết bị: Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM, Máy ủ nhiệt khô MS0030, Máy li tâm Microfuge 16, Máy li tâm, Máy Vortex Biocote, Máy Spindow, Pipet Man Nichipet EX, Máy hút chân không 7A-230, Tủ lạnh, máy giải trình tự gen 3130XL do Công ty Nam Khoa thực hiện. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 27 2.2.2. Hóa chất sinh phẩm Bộ hóa chất do Công Ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp bao gồm: +Sinh phẩm dùng để tách chiết ARN:Bộ thuốc thử NK RNA PREP. + Sinh phẩm dùng để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên:Bộ thuốc thử NKcDNAsynthesys kit (cung cấp cho 50 mẫu thử). + Sinh phẩm dùng để phát hiện và định lượng HCV-RNA:Bộ thuốc thử NK HCV-TQPCRHEX kit. + Sinh phẩm dùng để định type HCV + Hệ thống mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào trình tự các gen trên vùng 5’NC trên bộ gen HCV được công bố trên ngân hàng gen được tổng hợp và cung cấp bởi công ty Nam Khoa và có trình tự như sau: Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 28 Bảng 2.1. Mồi và mẫu dò trên vùng 5’ NC của HCV Tên Chức năng Trình tự Chiều dài (bp) Kích thước sản phẩm PCR (bp) Primer F Mồi xuôi 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99 Primer R Mồi ngược 5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ 17 Probe1 Mẫu dò 5’-FAM-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG- BHQ1-3’ 22 Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAGGACCCAGTCTTCCCGGCAATTC- BHQ2-3’ 25 Probe 3 Mẫu dò 5’-ROX-ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC- BHQ2-3’ 23 Probe 6 Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT- BHQ1-3’ 26 Hóa chất để thực hiện giải trình tự gen do Công ty Nam Khoa thực hiện: Bygdye Terminal V1.3, mồi HCV thiết kế trên NS5B. 2.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA của các mẫu bệnh nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 29 PCR dựa trên các cặp mồi đặc hiệu. Những mẫu có nồng độ > 102copies/ml máu sẽ được lựa chọn để định type. 2.3.1. Kĩ thuật tách chiết ARN Kỹ thuật dựa trên phương pháp do Chomczynski và Sacchi sáng chế. Nguyên tắc là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay li tâm lắng tách. RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗ trợ của tRNA và glycogen. Các bước tiến hành: Bước 1: 20µl IC-HCV ARN ,100µl huyết thanh, 300µl R1 ủ 10 phút nhiệt độ phòng. Bước 2: 80µl R2 úp ngửa 5-6 lần ủ 10 phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm 15 phút. Bước 3: Hút 200 dịch nổi chứa ARN vào tube có 200µl R3 úp ngửa 5-6 lần ủ 10 phút nhiệt độ phòng sau đó li tâm 10 phút. Bước 4: Hút bỏ hết dịch nổi cho 700µl R4 li tâm 5 phút. Bước 5: Hút bỏ dịch nổi ủ 560C trong 10 phút cho 300µl R5 sau đó mix nhẹ sau đó ủ ở 560C trong 10 phút. Qua năm bước trên ta có được dung dịch cần tách chiết. 2.3.2. Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Phương pháp này sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamer primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử thành cDNA từ ARN nhờ men Reverse Transciptase. Ngoài ra trong hệ thống phản Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 30 ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ ARN bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA. RNA 250C RNAse H 420C cDNA RNAse H 420C RNAse H 850C cDNA Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Các bước tiến hành Trong 1 tube PCR 0.2 có chứa sẵn 5µl NKRT+RTmix đang ngâm trong đá, cho vào mẫu trích biệt RNA 15µl. Sau đó, thực hiện tổng hợp cDNA bằng cách ủ ống phản ứng trong máy luân nhiệt theo các bước sau: 5 phút 30 phút 5 phút Giữ 250C, 420C 850C 40C Sản phẩm cDNA (2-20 µl) được dùng để thực hiện phản ứng PCR. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 31 2.3.3. Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh lượng HCV-RNA. Các bước tiến hành Sau khi tách chiết RNA ta tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNAsynthesis kit để thực hiện phản ứng revers transcription với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong các dịch trích biệt RNA ở trên (mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm) thành cDNA. Cho vào PCR mix để chuẩn bị chạy PCR. Phải thực hiện giai đoạn này với các PCR mix giữ trong khay lạnh hay đá bào Cho PCR mix vào low-profile white PCR tube: Tính toán số phản ứng cần phải thực hiện để lấy đủ số tube chứa master mix vào tube PCR. Để các tube Master mix ở 40C-100C trong tối cho đến khi rã đông hoàn toàn; lăc nhẹ để trộn sau đó li tâm nhẹ để lắng. Cho vào các tube PCR, mỗi tube 20
l NKHCV-TQPCRHEX mix. Giữ các tube này trong đá bào hay các giá lạnh. Đối với mỗi mẫu cDNA từ bệnh phẩm và mẫu chứng âm: cho 5
 mẫu cDNA vào một tube PCR chứa 20
 NKHCV-TQPCRHEX mix. Đối với các NKHCVDNA chuẩn : cho vào 3 tube PCR khác chứa 20
 NKHCV- TQPCRHEX mix, mỗi tube 5
 một độ pha loãng NKHCVDNA chuẩn. Chạy real-time PCR Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình luân nhiệt. Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy real-time PCR. Chọn plate set-up để chọn vị trí các giếng mà các tube phản ứng được đặt vào. Chọn hai kênh huỳnh quang là “ FAM” và “HEX” phát được huỳnh quang khi các taqman probe tương ứng bị thủy giải, và máy chọn được các kính lọc huỳnh quang tương ứng các camera của máy ghi nhận được các ánh sáng huỳnh quang phát ra. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 32 Chọn thể tích phản ứng là 25
. Sau đó chạy chương trình luân nhiệt real-time PCR như sau: 1 chu kỳ 400C trong 10 phút 1 chu kỳ 950C trong 5 phút 40 chu kỳ 940C trong 15 giây 650C trong 1 phút Chụp hình Real-time ở giai đoạn này. 2.3.4. Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen HCV Sản phẩm cDNA sau khi đem định lượng, nếu mẫu nào có số lượng >102copies/ml ta đem xác định kiểu gen. Tiến hành: Cho 20µl đã Mix sẵn vào tube loại nhỏ, sau đó cho 3µl cDNA của bệnh nhân đã định ARN-HCV (+) cho vào máy Real-time PCR để định type. 2.3.5. Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV 2.4. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng. Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa chọn. Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 33 Sơ đồ nghiên cứu: Định lượng HCV-ARN bằng kỹ thuật Real-time PCR trên máy CFX96TM Bệnh nhân chẩn đoán với virut viêm gan C bằng test nhanh Chọn mẫu bệnh phẩm anti- HCV dương tính Tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Chạy Eliza Tách chiết ARN Chọn mẫu có HCV-ARN >= 102 copies/ml máu Mẫu có HCV-ARN < 102 theo dõi kiểm tra lại sau 6 tháng Định type bằng kỹ thuật Real- time PCR trên máy CFX 96TM Type 1 Type 2 Type 6 Không xácđịnh Type 3 Giải trình tự gen trên máy 3130XL Chọn ngẫu nhiên 30 mẫu Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 34 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu Độ tuổi trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu thấp nhất là 21 tuổi và cao nhất là 75 tuổi, tuổi trung bình trong nhóm nghiên cứu là 41 tuổi. 3.1.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính Trong thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 01/2012 có tổng số 239 mẫu huyết thanh xét nghiệm dương tính với HCV bằng phương pháp Eliza và không bị đồng nhiễm HIV, HBV,HGV. Trong đó số bệnh nhân nam được xác định là 171 trường hợp, bệnh nhân nữ là 68 trường hợp (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính Anti-HCV* Nam Nữ Tổng Số lượng 171 68 239 Tỉ lệ % 71.55% 28.45% 100% Anti-HCV*: Anti-HCV dương tính ( Anti-HCV (+)) Trong tổng số 239 mẫu huyết thanh đã xác định là anti-HCV(+) thì có 171 mẫu huyết thanh là bệnh nhân nam chiếm tỉ lệ 71,55%, chỉ có 68 mẫu huyết thanh chiếm 28,45% là của bệnh nhân nữ. Vậy số lượng bệnh nhân nam nhiễm HCV (+) cao hơn số lượng bệnh nhân nữ, điều này có thể do sự khác biệt về lối sống theo giới tính hoặc có thể do sự lây nhiễm ở nam giới cao hơn ở nữ giới do sự khác nhau về kiểu gen. Tuy nhiên hiện nay chưa đủ bằng chứng để chứng minh và giải thích vấn đề trên. Phương Thị Hà Tỉ lệ này được biểu di Hình 3.1. T 3.1.2. Tỉ lệ bệnh nhân Qua xét nghiệm hiện và định lượng số mới đọc được ta kí hiệ máy không đọc được ta kí hi Bảng 3.2 HCV-ARN Giới tính Nam Nữ Tổng số Tỉ lệ % Nhận xét: qua bảng 3.2 t và chỉ có 4,6 % là có HCV chẩn đoán viêm gan C m tễ học đưa ra [17,33,36 Luận văn Th 35 ễn ở hình 3.1 ỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo gi chẩn đoán viêm gan C mạn Real-time PCR (RT-PCR)dùng mồi Taqman probe lượng copies/1ml máu, nếu số lượng HCV u là HCV-ARN (+), còn nếu số lượng HCV ệu là HCV-ARN (-), ta có bảng sau đ Kết quả bệnh nhân chẩn đoán HCV HCV-ARN dương tính HCV- ARN âm tính 163 8 65 3 228 11 95,4% 4,6% ỉ lệ xác định HCV-ARN (+) là rất cao chi -ARN (-) (người lành mang bệnh). V ạn là rất cao, tỉ lệ này tương đồng với t ]. Nam, 71.55% Nữ, 28.45% ạc sĩ khoa học ới tính để phát -ARN≥ 102 thì máy -ARN < 102 thì ây: -ARN Tổng số 171 68 239 100% ếm tới 95,4% ậy tỉ lệ bệnh nhân ỉ lệ mà các nhà dịch Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 36 Cũng qua bảng 3.2 ta thấy rằng trong tổng số 239 mẫu huyết thanh xác định với antiHCV(+), ta đem định lượng số lượng copies thì có 228 mẫu có số lượng HCV- ARN(+) và có 11 mẫu có HCV-ARN(-), theo khuyến cáo của nhà sản xuất và cung cấp bộ kit xác định genotype thì những mẫu có HCV-ARN(-) thì không định được type tuy nhiên để kiểm định khuyến cáo trên, nhóm đã thực hiện trong số 11 mẫu huyết thanh HCV-ARN (-) chọn ngẫu nhiên lấy 3 mẫu đem xác định kiểu gen, qua xét nghiệm Revers transcription RT - PCR dùng mồi taqman probe đặc hiệu 5’NC ta không xác định được kiểu gen trong 3 mẫu ngẫu nhiên đó.Như vậy số lượng HCV-ARN (+) thì ta mới có thể xác định được kiểu gen HCV bằng kỹ thuật RT- PCR. 3.2. Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR 3.2.1. Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type Trong số 228 mẫu bệnh phẩm đã định lượng HCV-ARN (+) đem định type ta được kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype được trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.3 Kết quả định genotype so với kết quả định lượng Kết quả định lượng Số mẫu Type 1 2 6 Không xác định 100-999 17 13 0 3 1 1000-9.999 47 29 1 16 1 10.000-99.999 61 33 1 27 0 100.000-999.999 75 55 2 21 0 >=1.000.000 28 24 1 3 0 Từ kết quả định lượng so với kết quả định type ta thấy rằng tại ngưỡng định lượng nào thì type 1 cũng có số lượng nhiều nhất sau đó là type 6 và cuối cùng là type 2, kết quả được biểu diễn trong hình 3.2. Phương Thị Hà Hình 3.2 Lượng siêu