Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000

Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000 Identification of SSR macker Satt 431 associated with rust resistance (Phakopsora pachyrhizi Sydow) in cultivar DT 2000 Nguyễn Thị Bình1, Nguyễn Thị Thanh Tuyết1, Trần Thị Trường2 Phạm Tùng Anh 3, Glen Lee Hartman3 Abtract The soybean cultivar DT 2000 was identified to have a consistent and high resistance level to soybean rust in field evaluations in Vietnam. In order to utilize this resistance effectively for the marker-assisted selection (MAS) and molecular breeding, a mapping QTL project was conducted on a F3 population developed from the cross DT12 by DT 2000, and SSR marker Satt 431 on linkage group J had an association with the resistance in the form of low area under disease progress curve (AUPDC) and disease severity values. The finding of the marker Satt 431 is significant and useful for MAS in breeding programs to get rust resistant cultivars in Vietnam. I. Đặt vấn đề 1. Viện Bảo vệ thực vật 2. Viện cây lương thực cây thực phẩm 3. Trường Đại học tổng hợp Illinois-USA Cây đậu tương là cây trồng có giá trị quan trọng thứ hai trong các cây họ đậu. Tuy nhiên sản lượng vẫn còn thấp so với nhu cầu tiêu dùng. Một trong những yếu tố hạn chế năng suất là sâu bệnh hại trong đó có bệnh gỉ sắt. Bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow, thuộc họ Melampsoracea, bộ Uredinales, lớp Urediniomycetes gây ra. Đây là loài ký sinh chuyên tính (Green 1984). Nấm gỉ sắt đậu tương đầu tiên được phát hiện ở Nhật bản năm 1902. Bệnh lan rộng, phổ biến ở hầu hết các vùng trồng đậu trên thế giới. ở đông bán cầu bệnh có thể làm giảm năng suất trung bình từ 10 – 30 %, có vùng năng suất giảm trên 50% (Bromfield 1980; Green 1984). ở Việt nam có những vụ bị hại nặng mất mùa đến 81% (Trung tâm đậu đỗ Định Trường 1985). Nghiên cứu tính kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn đậu tương địa phương và nhập nội, chúng tôi đã xác định được một số giống kháng bệnh, trong đó có giống đậu tương ĐT 2000 . Đây là một giống có tính kháng bền vững qua nhiều vụ đánh giá. Với sự phát triển mạnh trong một vài năm gần đây về sinh học phân tử, việc xác định các marker phân tử có ích phục vụ cho chọn giống kháng bệnh là con đường đi ngắn , có hiệu quả cho việc chọn tạo giống mới kháng bệnh năng suất cao. Vì vậy cần lập bản đồ gen kháng của những giống kháng bệnh điển hình như giống ĐT 2000, trên cơ sở tìm kiếm các chỉ thị phân tử có liên kết chặt với gen kháng. Phương pháp macker phân tử giúp chọn giống đậu tương kháng bệnh và có tiềm năng năng suất cao nhanh và hiệu quả, đáp ứng nhu cầu cấp bách của thực tiễn sản xuất hiện nay. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1.Vật liệu nghiên cứu Quần thể F2, F3 của cặp lai ĐT12 và ĐT2000. ADN cuả 154 cây thế hệ F2. Các hoá chất để chiết tách ADN: Tris - HCL, EDTA, NaCL, Ethanol... 384 macker SSR: Các marker này được chọn từ 20 nhóm liên kết và cách nhau một khoảng cách là 20cM. Các hoá chất và thiết bị phục vụ nghiên cứu macker đa hình và thu thập số liệu kiểu gen: máy chạy phản ứng PCR, máy soi gel bằng tia UV, hoá chất : agarose, ethidium bromide, Tag polymerase, dNTPs, PCR buffer, peptone... 2. Phương pháp nghiên cứu Tạo quần thể lai phương pháp lai hữu tính. Tách chiết ADN từ mẫu lá non thu thập trên cây của giống bố mẹ ĐT 12 và ĐT 2000, và ADN của các cây F2 theo phương pháp CTAB (Keim et al, 1988). Xác định các marker đa hình và thu thập số liệu kiểu gen bằng phương pháp công nghệ sinh học và được tiến hành tại phòng thí nghiệm bệnh cây của khoa Nông học trường Đại học tổng hợp Illinois-Hoa kỳ. Số liệu kiểu hình của quần thể F2 được thu thập bằng cách đánh giá mức độ nhiễm bệnh và mức độ nhiễm bệnh tích luỹ theo thời gian (chỉ số AUDPC) của 12 cây F3 phát triển từ hạt giống thu thập trên cây F2 tương ứng. Thí nghiệm được thực hiện ở vườn thực nghiệm của viện Bảo vệ thực vật trong vụ Đông năm 2006. Dùng phần mềm SAS để kiểm tra tính phân bố chuẩn của số liệu về chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian (AUDPC) và mức độ nhiễm bệnh trung bình của các dòng trong quần thể lai F3. Sử dụng phần mềm MapQTL để tìm marker có liên kết chặt với gen kháng bệnh sử dụng số liệu kiểu gen và kiểu hình của quần thể F2. III. kết quả nghiên cứu 1. Kết quả tạo các quần thể lai Dựa vào kết quả đánh giá tính kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn đậu tương địa phương và nhập nội đã tiến hành từ năm 2000-2005, chúng tôi đã tiến hành lai tạo được 3 tổ hợp lai giữa giống ĐT 2000 và 3 giống nhiễm bệnh nặng: ĐT 12 x ĐT2000. V74 x ĐT2000. Williams x ĐT2000. 2. Kết quả xác định các marker đa hình Chiết tách ADN của 4 giống cây bố mẹ: ĐT12, V74, Williams 82, ĐT2000 và hai giống đối chứng là PI 230970 và PI 437323, với hàm lượng 5000 mg/ml/cá thể, tiến hành thí nghiệm cho bắt cặp lần lượt 384 marker SSR với ADN của các giống bố mẹ để chọn macker SSR đa hình. Marker nào cho kết quả băng ADN của hai giống bố mẹ lệch nhau thì macker đó là đa hình, còn macker nào cho kết quả băng ADN của giống bố mẹ chạy ngang bằng nhau thì đó là marker không đa hình (hình 1). 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 1. Marker SSR gây đa hình trên ADN của các bố mẹ Chú thích: Băng ADN của 6 giống đậu tương bố mẹ thu được sau phản ứng PCR với các marker SSR. Đối với mỗi marker, sáu mẫu ADN được sắp xếp theo trình tự như sau: V 74, ĐT 2000, ĐT 12, Williams 82, PI 230 970, và PI 437323. Hàng 1 (trên): Sử dụng 8 marker: trong đó marker 1(Satt 306), 2 (Satt 303), 3 (Satt 319), 4 (Satt 321) cho kết quả không gây đa hình đối với ADN của bố mẹ, các marker còn lại: 5 (Sat 384), 6 (Sat 385), 7 (Satt 165), và 8 (Satt 276) cho kết quả gây đa hình đối với ADN của bố mẹ. Hàng 2 (dưới): Marker 6 (Satt 330) cho kết quả không gây đa hình đối với ADN của bố mẹ. Các marker còn lại gây đa hình: 1 (Satt 300), 2 (Sat 217), 3 (Sat 271), 4 (Sat 294), 5 (Sat 406), 7 (Sat 409), và 8 (Satt 455). Kết quả chọn được 140 macker đa hình với ADN của các bố mẹ nói trên và 85 macker đa hình với ADN của cặp lai ĐT12 và ĐT2000 thuộc 19 nhóm liên kết (bảng 1). Trong đó nhiều nhất là các macker ở nhóm D1b, ít nhất là nhóm A2 và nhóm K. Bảng 1. Các marker đa hình đối với cặp lai ĐT12 x ĐT2000 (2006 – 2007) Nhóm liên kết Macker Nhóm liên kết Macker Nhóm liên kết Macker Sat 217 D1b Sat 227 J Sat 339 Satt276 Satt 546 Sat 350 A1 Satt300 Sat 284 Sat 215 Satt 599 Sat 292 Sat 249 Sat 674 A2 Sat 250 D2 Sat 326 Sat 693 Sat 294 Sat 333 Satt 669 K Sat 293 Sat 406 Sat 325 B1 Sat 409 Satt 384 Sat 441 Sat 149 E Sat 381 Sat 431 Sat 172 Satt 070 Sat 380 L Sat 405 B2 Sat 083 Sat 156 Sat 189 F Satt 335 Sat 373 Sat 120 Sat 523 Sat 238 Sat 133 C1 Satt 294 Sat 154 M Sat 250 Satt 565 Sat 240 Sat 323 Sat 234 Sat 435 Sat 402 Sat 536 C2 Satt 129 G Sat 064 Sat 636 Satt 286 Sat 141 Satt 640 Sat 185 N Sat 091 Sat 358 Sat 660v Sat 036 D1a Sat 106 H Sat 118 O Sat 242 Sat 160 Sat 158 Sat 274v Satt 408 Sat 049 Sat 291 Satt 436 Sat 279 Sat 477 Satt 603 Sat 478 I Sat 105 Sat 089 Sat 155 Sat 096 Sat 170 D1b Sat 139 Sat 614 Sat 189 Sat 700 3. Kết quả bước đầu tìm các marker có liên kết chặt với gen kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000 * Thu thập số liệu kiểu gen Dựa vào kết quả của phần 2 , 85 marker đa hình sẽ được tiến hành phản ứng PCR với 154 mẫu ADN của các cá thể trong 1 quần thể F2 thuộc tổ hợp lai ĐT12 x ĐT2000. Các băng ADN đa hình ở các cá thể này sẽ được ghi lại thành số liệu kiểu gen: a là ký hiệu đối với cá thể có băng ADN cao hơn . b là ký hiệu đối với cá thể có băng ADN thấp hơn.. h là ký hiệu đối với cá thể có cả băng ADN cao và băng ADN thấp. * Thu thập số liệu kiểu hình Chỉ số nhiễm bệnh ở giai đoạn sinh trưởng R6 và chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian AUDPC của của mỗi dòng (12 cá thể) trong quần thể F3 là số liệu kiểu hình đại diện cho mỗi cá thể trong quần thể F2. Dùng phần mềm SAS để kiểm tra tính phân bố chuẩn của số liệu kiểu hình, kết quả được thể hiện trên hình 2 và hình 3 cho thấy mức độ nhiễm bệnh (severity) và chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian (AUDPC) có sự dao động lớn. Mức độ nhiễm bệnh và chỉ số AUDPC đều có phân bố chuẩn, như vậy số liệu của 2 tính trạng này có sự phân bố bình thường (normal distribution). Điều này cũng cho thấy cả mức độ nhiễm bệnh và chỉ số AUDPC đều là tính trạng số lượng (qualitative trait) do nhiều QTL quy định. Mức độ nhiễm bệnh của quần thể F3 dao động trong khoảng 20 đến 75, chỉ số bệnh trung bình của các dòng là 38. Chỉ số AUDPC trung bình của các dòng là 492.8 và dao động trong khoảng 255 đến 1109 Tần suất Chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian(AUDPC ) Hình 2. Sự phân bố tính trạng chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian của các dòng lai của quần thể F3 (ĐT 12 x ĐT 2000) Kết quả phân tích số liệu kiểu gen và kiểu hình bằng phần mềm MapQTL để tìm marker liên kết với gen kháng ở giống đậu tương ĐT2000 cho thấy đối với tính trạng kiểu hình của vết bệnh TAN/RB (kháng / nhiễm), marker Satt 619 thuộc nhóm liên kết A1 đã có chỉ số LOD (chỉ số biểu hiện mức độ liên kết có ý nghĩa đối với gene được nghiên cứu) bằng 2.4. Vì chỉ số LOD phải lớn hơn 2.5 mới cho thấy marker liên kết có ý nghĩa với gene quy định tính trạng nghiên cứu. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn nêu kết quả này vì 2.4 là tương đối cao. Đây sẽ là tiền đề cho nghiên cứu trong thời gian tới, tiếp tục tìm kiếm ở các vùng lân cận nằm quanh marker này để tìm ra marker SSR cho chỉ số LOD cao hơn, hoặc dùng các marker khác hiện đại và chính xác hơn như SNP, nhằm tìm ra marker liên kết với gen quy định tính trạng kiểu vết bệnh. Chỉ số nhiễm bệnh trung bình Tần suất Hình 3. Sự phân bố tính trạng mức độ nhiễm bệnh trung bình của các dòng lai F3 (ĐT 12 x ĐT 2000) Bảng 3. Kết quả tìm các macker có liên kết chặt với gen kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000 Tính trạng Marker SSR Nhóm liên kết LOD Mức độ đa dạng của các cá thể trong quần thể % Phản ứng với bệnh (RB, TAN) Satt 619 A1 2.4 8.6 Mức độ nhiễm bệnh Satt 431 J 5.7 19.6 Chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian (AUDPC) Satt431 J 4.4 14.4 Marker Satt 431 ở nhóm liên kết J được phát hiện là có liên kết với (một hoặc nhiều) gene quy định hai tính trạng là mức độ nhiễm bệnh và AUDPC với chỉ số LOD lần lượt là 5.7 và 4.4. Đây là 2 tính trạng thể hiện tính kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000. Như vậy bước đầu có thể kết luận gen kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000 thuộc nhóm liên kết J. Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được vị trí của gene kháng bệnh Rpp1, Rpp2 và Rpp4. Rpp1 nằm ở nhóm liên kết G và có liên kết chặt với marker Sct_187 và cách marker này 0.8 cM (Hyten et al. 2007). Rpp2 cũng đã xác định ở nhóm liên kết J (tài liệu đang xuất bản). Gene liên kết với tính trạng mức độ nhiễm bệnh và chỉ số AUDPC của ĐT 2000 mà chúng tôi tìm được liên hệ chặt với marker Satt431 cũng ở nhóm liên kết J. Tuy nhiên, do khoảng cách giữa hai marker lớn hơn 20 cM nên đây có thể là hai gene (QTL) khác nhau. IV. kết luận và đề nghị 1. Kết luận 1.1. Đã tạo được 24 quần thể lai F2 và 2 quần thể F3 của 3 tổ hợp lai giữa giống làm mẹ là giống đậu tương ĐT12, Williams82, V74 nhiễm bệnh gỉ sắt nặng và giống đậu tương ĐT2000 kháng bệnh làm vật liệu nghiên cứu. 1.2. Đã tuyển chọn được 85 macker SSR gây đa hình ở ADN của giống bố mẹ để nghiên cứu thu thập số liệu kiểu gen ở các cá thể F2. 1.3. Xác định được gen kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT 2000 nằm ở nhóm liên kết J vì marker Satt 431 có liên kết chặt với gen kháng thuộc nhóm liên kết J. 2. Đề nghị Cần nghiên cứu tìm thêm các macker khác có liên kết với gen kháng bệnh ở giống đậu tương ĐT2000 để phục vụ chọn giống kháng bệnh. Tài liệu tham khảo 1. Trung tâm Đậu đỗ Định Tường 1983. Bệnh gỉ sắt đậu tương(Phakopsora pachyrhizi Sydow). Báo cáo khoa học năm 1983. 2. Frederik, R., Synder,C., Peterson, G., and Bonde, M. 2002. Polymeraza chain reaction assays for the detection and discrimination of the soyabean rust pathogen P. Pachyrihizi and P. Meibromiea. Phytopathology 92:217-227. 3. Hartman, G. L., Miles, M. R., and Fredrick, R. D., 2005. Breeding for resistance to soybean rust. Plant Dis. 89:664-666.