Xác định sự xâm nhiễm của nấm corticium salmonicolor trên 4 dòng cao su bằng phương pháp lây nhiễm in vitro

XáC ĐịNH Sự XÂM NHIễM CủA NấM Corticium Salmonicolor TRÊN 4 DòNG CAO SU BằNG PHƯƠNG PHáP lây nhiễm IN VITRO In vitro assessment of the penetration of Corticium salmonicolor into wood and bark slivers of four Hevea clones Nguyễn Thái Hoan1*, Lê Đình Đôn2 và Phan Thành Dũng1 Abstract The penetration of Corticium salmonicolor into slivers of Hevea wood and bark was assessed in vitro on three types of materials consisting of wood, bark attached to wood and bark at three levels of maturity including very young, premature and mature on four Hevea clones RRIM 600, PB 235, RRIV 4 and VM 515. The penetration of fungus into slivers was strongest on wood, very young stage and clone RRIM 600 and weakest on bark, mature stage and clone VM 515. I. ĐặT VấN Đề 1 Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam 2 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Nấm Corticium salmonicolor gây ra bệnh nấm hồng trên rất nhiều loại cây khác nhau. Trong các loại cây bị nấm gây hại, hầu hết là những cây thân gỗ và có tầm quan trọng về kinh tế bao gồm cả cây ăn quả lẫn cây công nghiệp. Trên cây cao su, bệnh nấm hồng xuất hiện và gây hại nặng trên các vườn cây từ 3 đến 9 năm tuổi. Vết bệnh tập trung chủ yếu tại điểm phân cành trên thân chính và các cành cấp 1. Lượng mưa cao, tính chất địa phương và tính mẫn cảm của dòng vô tính là 3 yếu tố chính dẫn đến sự phát sinh, phát triển bệnh. Cho đến nay, việc xác định tính kháng bệnh của các dòng vô tính cao su chủ yếu dựa vào các kết quả điều tra ngoài đồng ruộng khi cây cao su đã lớn. Điều này sinh nhiều hạn chế như tốn kém chi phí hoặc khi phát hiện ra dòng vô tính mẫn cảm thì đã quá trễ. Hơn nữa, khi tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm bệnh nấm hồng trong nhà lưới thì vấn đề chọn vật liệu lây nhiễm đóng vai trò quan trọng quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiệm. Chính vì lý do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phần nào giải quyết được những tồn tại nêu trên. II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Chuẩn bị vật liệu: Dùng gỗ và vỏ cây cao su còn tươi một năm tuổi của 4 dòng vô tính ở 3 mức độ thành thục: non, bánh tẻ và già (Hình 1 - A). Cắt thành những mảnh nhỏ có diện tích 2 cm2 (2 cm x 1 cm), sau đó khử trùng các mảnh gỗ và vỏ bằng HgCl2 0,1% và nước cất. Phương pháp lây nhiễm: Đặt các mảnh gỗ đã được khử trùng lên bề mặt môi trường MEA trong đĩa petri có cấy sẵn nấm C. salmonicolor với số lượng 6 mảnh/đĩa. Nấm được phân lập từ các dòng vô tính cao su tương ứng với các dòng vô tính tham gia thí nghiệm. Các dòng vô tính cao su được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm RRIM 600,PB 235, RRIV 4 và VM 515. Các mức độ thành thục của vỏ và gỗ là non, bánh tẻ và già. Các thành phần mẫu lây nhiễm gồm gỗ, vỏ, gỗ và vỏ. ở mỗi mức độ thành thục của gỗ và vỏ của mỗi dòng vô tính gồm 10 đĩa petri, trong mỗi đĩa petri chứa đủ cả 3 thành phần mẫu (gỗ, gỗ và vỏ, vỏ) với mỗi thành phần gồm 2 mảnh (Hình 1 - B). Theo dõi thí nghiệm: Ghi nhận phần trăm diện tích nấm bao phủ trên các mảnh gỗ và vỏ 1 tuần/lần cho đến khi các mảnh gỗ và vỏ của một trong các nghiệm thức bị nấm bao phủ hoàn toàn. Sau lần theo dõi cuối cùng, kiểm tra sự xâm nhiễm của nấm bằng cách lấy ngẫu nhiên trong mỗi mức độ thành thục non, bánh tẻ và già một đĩa petri với đủ cả 3 thành phần mẫu lây nhiễm. Lấy các mảnh gỗ và vỏ ra rồi rửa sạch agar bằng nước cất. Tiếp theo, khử trùng bằng HgCl2 0,1% từ 15 - 30 giây, rửa lại bằng nước cất và đặt vào đĩa petri có chứa môi trường MEA với 5 mảnh/ đĩa cho mỗi thành phần mẫu lây nhiễm. Sau 7 - 10 ngày, ghi nhận sự mọc lại của nấm từ các mảnh gỗ, vỏ, gỗ và vỏ. Xử lý số liệu: Phân tích bảng ANOVA bằng phần mềm PC - SAS (personal computer - statistical analysis system) Version 6.04 for DOS. A B Hình 1: Phương pháp lây nhiễm bệnh in vitro. A: Các mức độ thành thục của gỗ và vỏ trên cây cao su. B: Phương pháp lây nhiễm in vitro. III. KếT QUả Và THảO LUậN Trong thí nghiệm này, việc đánh giá tỷ lệ diện tích các mảnh gỗ và vỏ cây cao su bị nấm bao phủ được tiến hành trên 3 yếu tố là các dòng vô tính, các mức độ thành thục của vỏ và gỗ và các thành phần mẫu lây nhiễm. Nhìn chung, ở Bảng 1, phần trăm diện tích nấm bao phủ trên các mảnh gỗ và vỏ tăng dần theo thời gian từ tuần đầu tiên sau khi lây nhiễm cho đến tuần thứ 5 khi toàn bộ các mảnh gỗ và vỏ bị nấm bao phủ. Trong đó, phần trăm diện tích nấm bao phủ luôn đạt cao nhất ở các nghiệm thức gỗ của dòng vô tính RRIM 600 và thấp nhất ở các nghiệm thức vỏ của dòng vô tính VM 515 qua 5 lần theo dõi. Bảng 1. Phần trăm diện tích nấm bao phủ trên vật liệu lây nhiễm theo các dòng vô tính cao su, các mức độ thành thục và thành phần mẫu lây nhiễm Dòngvô tính Mức độ thành thục của gỗ và vỏ Thành phần mẫu lây nhiễm Tuần sau chủng nấm 01 02 03 04 05 RRIM 600 Non Gỗ 77,5 81,3 83,8 92,5 100,0 Gỗ và vỏ 67,8 76,3 78,5 87,5 97,0 Vỏ 52,8 63,8 68,5 74,5 89,3 Bánh tẻ Gỗ 71,5 80,5 81,0 84,3 93,0 Gỗ và vỏ 72,8 81,8 81,8 84,3 92,8 Vỏ 50,8 62,0 63,5 69,0 84,5 Già Gỗ 77,3 87,5 96,3 96,3 100,0 Gỗ và vỏ 57,5 65,5 73,0 82,3 98,3 Vỏ 49,8 58,5 64,0 74,0 88,8 PB 235 Non Gỗ 67,0 71,5 84,5 89,5 90,5 Gỗ và vỏ 67,0 69,5 79,8 80,5 88,5 Vỏ 38,5 57,0 82,8 86,0 93,0 Bánh tẻ Gỗ 62,0 66,8 75,0 83,0 86,0 Gỗ và vỏ 44,7 53,0 62,5 65,5 75,5 Vỏ 30,3 44,3 72,3 81,3 88,8 Già Gỗ 36,5 45,0 60,8 65,3 72,5 Gỗ và vỏ 25,0 37,5 72,0 76,3 91,3 Vỏ 11,5 33,5 67,8 80,0 92,3 RRIV 4 Non Gỗ 38,3 43,5 62,8 70,8 79,5 Gỗ và vỏ 40,3 48,0 66,8 74,5 85,3 Vỏ 20,5 35,5 60,8 75,5 87,5 Bánh tẻ Gỗ 45,5 82,5 91,5 95,0 97,5 Gỗ và vỏ 19,8 50,5 68,0 76,5 88,8 Vỏ 17,0 58,8 68,5 76,3 89,0 Già Gỗ 31,3 62,3 77,5 82,5 83,8 Gỗ và vỏ 10,3 38,8 56,0 63,0 66,8 Vỏ 14,3 54,5 74,8 89,8 92,8 VM 515 Non Gỗ 42,3 70,0 77,5 81,5 84,5 Gỗ và vỏ 36,5 56,0 63,3 67,8 72,5 Vỏ 17,3 41,5 51,0 58,3 67,8 Bánh tẻ Gỗ 67,8 72,8 77,8 78,3 79,0 Gỗ và vỏ 36,3 54,3 68,8 73,0 77,3 Vỏ 8,5 22,5 37,0 49,8 61,5 Già Gỗ 6,8 19,5 27,3 37,3 48,3 Gỗ và vỏ 9,5 18,3 28,8 38,0 47,5 Vỏ 5,0 12,0 18,3 29,0 50,0 Qua kết quả được trình bày ở Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ diện tích nấm bao phủ luôn đạt ở mức cao nhất trên dòng vô tính RRIM 600 và khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng vô tính khác (64,2 - 93,7%). Trong khi đó, trên dòng vô tính VM 515 tỷ lệ diện tích nấm bao phủ luôn đạt ở mức thấp nhất (25,5 - 65,4%). Trên hai dòng vô tính PB 235 và RRIV 4, nấm chỉ xâm nhiễm ở mức trung bình và tỷ lệ diện tích nấm bao phủ giữa hai dòng vô tính này chỉ khác biệt có ý nghĩa ở giai đoạn một tuần sau lây nhiễm (42,5% và 26,3%). Theo các kết quả điều tra trên đồng ruộng, các dòng vô tính RRIM 600, PB 235 và VM 515 cho đến nay vẫn được xác định là những dòng vô tính rất mẫn cảm đối với bệnh nấm hồng (P.T. Dũng, 2000; N.T. Hoan và ctv, 2001). Đối với dòng vô tính VM 515, mặc dù trong thí nghiệm này bị nấm xâm nhiễm ở tỷ lệ thấp nhất nhưng thực tế ngoài sản xuất mức độ nhiễm bệnh nấm hồng thường tương đương hoặc thậm chí cao hơn so với hai dòng vô tính RRIM 600 và PB 235. Sự khác biệt giữa kết quả thí nghiệm trong phòng và thực tế ngoài đồng ruộng chưa thể lý giải được trong thí nghiệm này. Bảng 2. Phần trăm diện tích nấm bao phủ trên vật liệu lây nhiễm theo dòng vô tính cao su Dòng vô tính Tuần (sau lây nhiễm) 01 02 03 04 05 RRIM 600 64,2 a 73,0 a 76,7 a 82,7 a 93,7 a PB 235 42,5 b 53,1 b 73,0 a 78,6 a 86,5 b RRIV 4 26,3 c 52,7 b 69,6 a 78,2 a 85,6 b VM 515 25,5 c 40,8 c 49,9 b 57,0 b 65,4 c Trong cùng một cột số liệu, các trung bình có cùng kí tự không khác biệt có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm đa đoạn Duncan (n = 360; á = 0,01). Kết quả ở Bảng 3 cho thấy, trên gỗ và vỏ non nấm bao phủ với tỷ lệ cao nhất (47,1 - 86,3%), kế đến là gỗ và vỏ bánh tẻ (43,9 - 84,5%), tuy nhiên tỷ lệ diện tích nấm bao phủ giữa 2 mức độ thành thục này không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trên gỗ và vỏ già, tỷ lệ diện tích nấm bao phủ đạt ở mức thấp nhất (27,9 - 77,7%) và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với gỗ, vỏ non và bánh tẻ. Bảng 3. Phần trăm diện tích nấm bao phủ trên vật liệu lây nhiễm theo mức độ thành thục của gỗ và vỏ cây Mức độ thành thục của gỗ và vỏ Tuần (sau lây nhiễm) 01 02 03 04 05 Non 47,1 a 59,5 a 71,6 a 78,2 a 86,3 a Bánh tẻ 43,9 a 60,8 a 70,6 a 76,3 a 84,5 a Già 27,9 b 44,4 b 59,7 b 67,8 b 77,7 b Trong cùng một cột số liệu, các trung bình có cùng kí tự không khác biệt có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm đa đoạn Duncan (n = 360; á = 0,01). Để chọn các mức độ thành thục của gỗ và vỏ làm vật liệu lây nhiễm thích hợp cho các thí nghiệm lây nhiễm bệnh trong nhà lưới, nếu chọn ở mức độ non thì vật liệu lây nhiễm sẽ mau bị chết và do đó thời gian duy trì mẫu nấm trên cây kí chủ sẽ giảm đi hoặc nếu chọn ở mức độ già thì lượng sợi nấm trên các mảnh gỗ ít và chất lượng của vật liệu lây nhiễm sẽ không tốt dẫn đến khả năng gây bệnh cho cây kí chủ kém. Vì vậy, từ kết quả của thí nghiệm cho thấy, gỗ bánh tẻ là vật liệu tốt nhất có thể dùng để thực hiện các thí nghiệm lây nhiễm bệnh trong nhà lưới. Việc đánh giá tỷ lệ diện tích các mảnh gỗ và vỏ cây cao su bị nấm bao phủ trên các thành phần mẫu lây nhiễm được xem xét trong Bảng 4, tỷ lệ diện tích nấm bao phủ đạt cao nhất trên gỗ (52,0 - 84,5%) và thấp nhất trên vỏ (26,3 - 82,1%). Trên gỗ và vỏ, tỷ lệ diện tích nấm bao phủ đạt ở mức trung bình (40,6 - 81,8%). Xét trên phương diện thống kê, có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các thành phần mẫu lây nhiễm ở giai đoạn từ 1 - 4 tuần sau khi lây nhiễm nấm nhưng không có sự khác biệt ở tuần thứ 5. Sau khi kết thúc thí nghiệm, các mảnh gỗ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% và đặt lại trên môi trường MEA nhằm kiểm tra xem nấm có thực sự xâm nhiễm vào bên trong hay chỉ bao phủ bên ngoài các mảnh gỗ. Kết quả sau khi đặt gỗ 10 ngày cho thấy, nấm mọc ra và phát triển rất mạnh từ các mảnh gỗ, gỗ và vỏ, vỏ (Hình 2). Như vậy, nấm đã thực sự xâm nhiễm sâu vào bên trong các mảnh gỗ và vỏ. Bảng 4. Phần trăm diện tích nấm bao phủ trên thành phần vật liệu lây nhiễm Thành phần mẫu lây nhiễm Tuần (sau lây nhiễm) 01 02 03 04 05 Gỗ 52,0 a 65,3 a 74,6 a 79,7 a 84,5 a Gỗ và vỏ 40,6 b 54,1 b 66,6 b 72,4 b 81,8 a Vỏ 26,3 c 45,3 c 60,8 b 70,3 b 82,1 a Trong cùng một cột số liệu, các trung bình có cùng kí tự không khác biệt có ý nghĩa thống kê theo trắc nghiệm đa đoạn Duncan (n = 360; a = 0,01). A B C Hình 2. Sự phát triển lại của nấm C. salmonicolor từ các mảnh gỗ và vỏ cây cao su bị bệnh trong thí nghiệm. Mẫu đã được xử lý HgCl2 0,1% và đặt trên môi trường MEA, ở nhiệt độ 25oC. Thời gian theo dõi sau khi đặt gỗ 10 ngày. A: Gỗ có nấm lây nhiễm, B: Gỗ và vỏ có lây nhiễm, C: Vỏ có lây nhiễm. IV. KếT LUậN Trong điều kiện in vitro, nấm Corticium salmonicolor xâm nhiễm và phát triển mạnh trên gỗ cây cao su, nhưng khi gỗ có kèm theo lớp vỏ hoặc chỉ có lớp vỏ thì khả năng xâm nhiễm của nấm yếu. Gỗ non và gỗ bánh tẻ bị nấm xâm nhiễm mạnh nhưng trên gỗ già nấm xâm nhiễm rất yếu. Nấm gây hại mạnh trên các mảnh gỗ và vỏ của dòng vô tính cao su RRIM 600 nhưng gây hại yếu trên các mảnh gỗ và vỏ của dòng vô tính VM 515. TàI LIệU THAM KHảO Phan Thành Dũng (2000). Điều tra các bệnh hại chính trên cây cao su tại Việt Nam. Báo cáo khoa học năm 2000. Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, 16 trang. Nguyễn Thái Hoan, Phan Thành Dũng và Trần ánh Pha (2001). Kết quả điều tra - phân vùng bệnh hại trên dòng vô tính cao su PB 235 tại miền Đông Nam Bộ. Báo cáo khoa học năm 2001. Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, 44 trang. Hilton R.N. (1958). Pink Disease of Hevea Caused by Corticium salmonicolor Berk. et Br. Journal of the Rubber Research Institute Malaysia 15: 275 - 292. IRRDB (International Rubber Research and Development Board) (1994). “Pink disease”, Diseases of Hevea, 2 pages. Mordue J.E.M. and Gibson I.A.S. (1976). Corticium salmonicolor. CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria No. 511. Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey, United Kingdom, 2 pages. Sharples A. (1936). Diseases and pests of the rubber tree. Macmillan and Co., Limited, ST. Martin’s street, London, pp. 271 - 277.