Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật Elisa và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT-PCR

và một protein phi cấu trúc thứ 2 (NSs). (Nguồn: Elliott và cộng sự,2000). 10 Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV 2.2.3.3. Phân loại TSWV TSWV thuộc họ Bunyaviridae, họ Bunyaviridae có 5 giống là: Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó Tospovirus là một trong mƣời virus gây bệnh cây phổ biến nhất. TSWV đƣợc phân là đại diện duy nhất của nhóm đơn thân xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989, TSWV đƣợc chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I; đến giữa những năm 1989 – 1992, hai dòng này đƣợc xác định có đặc tính huyết thanh học khác nhau và chúng đƣợc đổi tên thành TSWV (TSWVdòng L) và INSV (TSWV dòng I). Hiện nay, TSWV đƣợc phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Ngƣời ta dựa trên đặc tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I). Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II). Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III). Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV). Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V). Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV. 11 2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng, chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và nhiều cây trồng khác nhau trên toàn thế giới. Hiện nay danh sách ký chủ của TSWV khoảng 1000 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn (German và cộng sự, 1992). Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm các loại cây trồng quan trọng nhƣ ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, cần tây, rau diếp và nhiều loại cây cảnh. Ở những vùng có mùa đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa đông mát mẻ thì cây ký chủ hằng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng. 2.2.3.5. Con đƣờng truyền bệnh TSWV đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua các loài bọ trĩ. Chúng là những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5 mm) sống cả ở trên hoa, lá và đất. Có chín loài bọ trĩ đƣợc xem là vector truyền TSWV, trong đó những loài Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F. schultzei (Trybom), F. fusca (Hind), Thrips tabaci Lind đƣợc xem là vector chính truyền bệnh vì khả năng phân bố rộng rãi của chúng. Bọ trĩ trƣởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh sản không cần con đực. Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa, ấu trùng vừa nở ra bắt đầu ăn ngay. Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm chúng thu virus vào bên trong, thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên đến khi ấu trùng phát triển hoàn thiện chúng sẽ chui vào đất và trở thành nhộng. Sau đó chúng trƣởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất. Ấu trùng bọ trĩ chƣa lan truyền bệnh cho cây ngay đƣợc mà phải chờ đến khi chúng trƣởng thành. Những con bọ trĩ trƣởng thành có thể mang virus suốt đời nhƣng không truyền cho giai đoạn trứng. Thế hệ kế tiếp mang virus bằng việc ăn cây bị nhiễm. Thời gian từ trứng đến giai đoạn trƣởng thành có thể thay đổi do nhiều yếu tố. 12 Hình 2.2. Chu trình sống của bọ trĩ (Nguồn: T.A. Zitter and M.L. Daughtrey, 1989) 2.2.3.6. Hình thức tấn công và gây bệnh Con đƣờng xâm nhập và nhân bản của virus đƣợc thể hiện qua các giai đoạn sau. Đầu tiên là sự tấn công của hạt virion. Hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus và màng nhân. Ba là quá trình sao mã sơ cấp. Bốn là quá trình dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng. Năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Sáu là sự tái bản genome tiếp theo là sự sao mã thứ cấp. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa 13 khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành (Lindsey Irons và Emily Sims) 2.2.3.7. Điều kiện phát triển Theo Best bệnh thích nghi với thời tiết ấm áp, thời tiết ấm và khô là điều kiện tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản. Nhiệt độ trung bình trong ngày vào khoảng 25oC kết hợp với lƣợng mƣa giảm là điều kiện tối ƣu cho bọ trĩ lẫn TSWV phát triển. Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng của cây, giai đoạn mà virus đƣợc bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác dễ dàng. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ. Mƣa nhiều và to trong mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp, vì vậy dịch bệnh thời điểm này cũng giảm đi. Virus TSWV có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dƣới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân đến, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây. 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy theo tuổi cây, điều kiện canh tác, mức độ nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên, lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. 14 Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả, làm năng suất giảm và giảm giá trị cảm quan. (Nguồn: Ken Pernezny và cộng sự, 2003). Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV Hiện nay hai phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của TSWV. 15  Sử dụng cây kháng Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho) và cây kháng TSWV. Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trên thị trƣờng: Giống Amelia (HMX – 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm Fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt. Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn. Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm Fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444.  Chiến lƣợc quản lý TSWV Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ – ký sinh – vectơ đã giúp chúng ta phát triển những biện pháp canh tác nhằm làm giảm đáng kể thiệt hại do TSWV gây ra trên những cây trồng nhạy cảm. Nếu sử dụng riêng lẻ từng biện pháp thì hiệu quả sẽ không cao. Vì vậy ngƣời ta thƣờng kết hợp nhiều biện pháp với nhau để giảm đến mức tối thiểu thiệt hại do virus gây ra. Biện pháp quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, bao gồm các kỹ thuật: Bảo vệ cây con: cây con rất dễ bị nhiễm TSWV vì vậy cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV, trồng trong nhà kính hoặc sử 16 dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn để làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm. Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Tránh trồng độc canh, nên hạn chế trồng cùng một loại cây trồng nhiều lần trên một ruộng đất. Trồng luân canh giữa các loại cây trồng nhạy cảm và không nhạy cảm với TSWV để loại bỏ mầm bệnh. Trồng với mật độ thích hợp sẽ hạn chế đƣợc bệnh. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Loại bỏ những nguồn chứa TSWV, cày đất nơi thu hoạch, loại bỏ các loài cỏ dại là ký chủ của TSWV chung quanh đồng ruộng. Nên bỏ hoang các đồng ruộng bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lƣợng và thời gian hợp lý để tiêu diệt đƣợc nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Khống chế bọ trĩ bằng biện pháp sinh học là có hiệu quả và có lợi nhất lại không ảnh hƣởng đến môi trƣờng. 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng (Vũ Triệu Mân, 2003) Triệu chứng là những biểu hiện bên ngoài, phản ánh đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Đối với bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phƣơng pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận cây bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp cũng dẫn đến nhầm lẫn, nhất là trong trƣờng hợp chẩn đoán các bệnh có triệu chứng bên ngoài tƣơng tự nhau nhƣng do các tác nhân khác nhau gây ra. Triệu chứng bên ngoài vẫn có thể biến đổi ít nhiều 17 tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây, kỹ thuật canh tác và yếu tố ngoại cảnh. Do đó, trong những trƣờng hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phƣơng pháp bổ sung khác. 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị (Vũ Triệu Mân, 2003) Cây chỉ thị là những cây ký chủ nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Đối với virus cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 2003) Trong tế bào ký chủ, virus thƣờng ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh, ngƣời ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra ngƣời ta còn dùng lát cắt mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh đƣợc cắt. 18 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA (Vũ Triệu Mân, 2003) Phƣơng pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện và định lƣợng các thành phần nhƣ là: peptide, kháng nguyên, kháng thể, enzyme, hormone…1978 Clark và Adam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật ELISA để chuẩn đoán bệnh virus hại khoai tây và từ đó kỹ thuật này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh học thông thƣờng. Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn nhƣng vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. Thành phần cơ bản của phản ứng ELISA gồm: kháng nguyên, kháng thể, và cơ chất tạo màu. Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cho tất cả các dạng ELISA là: ELISA trực tiếp (Direct ELISA): Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phƣơng pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 19 Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (kháng thể sơ cấp) và kháng thể phát hiện (kháng thể thứ cấp). Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999) Khi DNA polymerase hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: Biến tính phân tử DNA (Denature) Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) Tổng hợp mạch mới (Extension) Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. 20 2.3.5.2. Nested PCR (Mc Pherson M.J., 2000) Đây là dạng cải biến của phƣơng pháp PCR, trong đó phản ứng sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi, sau đó các mồi còn lại sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu. Phƣơng pháp nested – PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested – PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested – PCR (HN – PCR). Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Tuy nhiên sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR . 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) Cùng với các phƣơng pháp: Real Time PCR, Nested PCR thì RT – PCR là một cải biến của phƣơng pháp PCR thông thƣờng nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật RT – PCR. Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc . Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi “ngƣợc” của PCR giai đoạn sau, có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT – PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp cổ điển nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 21 RT – PCR một bƣớc: trong kỹ thuật RT – PCR một bƣớc quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng. Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc RT – PCR hai bƣớc: trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau. Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc 22  Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus. Tổng hợp cDNA reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA. (1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích. (3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả.  Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau: Biến tính: chuyển dây đôi thành dây đơn Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ xung với nó trên cDNA khuôn mẫu. Kéo dài: kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase. Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thƣờng: 94oC, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần. Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT – PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc 23 tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame. 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài Sonya Broughton, Roger Jones và Brenda Coutts (2004) nghiên cứu về biện pháp quản lý bọ trĩ và bệnh TSWV. John M. Sherman, James W. Moyer, và Margaret E. Daub (1998) khảo sát khả năng chống chịu của cây hoa cúc với sự biểu hiện gene N (Nucleocapsid) của virus TSWV. M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky (2002) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV và sử dụng Acibenzolar – S – methyl nhằm quản lý TSWV. M. D. Bandla, L. R. Campbell, D. E. Ullman, và J. L. Sherwood (1997) sử dụng kỹ thuật điện di protein và phản ứng huyết thanh có đánh dấu huỳnh quang để nghiên cứu về sự tƣơng tác giữa Glycoprotein của TSWV với thụ thể tiếp nhận ở thành dạ dày bọ trĩ. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là những nghiên cứu ở các trƣờng Đại học. Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM (2003) bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus (TSWV, CMV, TMV) bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM (2005) điều tra bệnh TSWV trên cây thuốc lá trong vƣờn nhân giống cây con tại tỉnh Tây Ninh. 24 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu cà chua có triệu chứng bệnh TSWV tại tỉnh Tiền Giang tiến hành thu mẫu và trữ ở -200C cho đến khi phân tích. Việc phân tích đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1.1. Dụng cụ Cối, chày sứ Lọ đựng hóa chất Eppendorf Hộp đựng đầu tip Micropipette Đầu tip Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng Ống đong Khay đổ gel Bồn chứa ethium bromide Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA 25 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị Máy cất nƣớc Cân phân tích Máy li tâm Tủ cấy Tủ mát Tủ định ôn Bồn ủ nhiệt Máy rửa ELISA Bồn ủ ELISA Máy đọc ELISA Máy vortex (IKA Works) Máy PCR Lò viba (Electrolux) Máy điện di Máy đọc gel 3.2.2. Hoá chất 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA Sử dụng kit ELISA do Agdia cung cấp gồm các thành phần sau: Dịch trích mẫu (SEB1 extract buffer 1X) Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) Kháng thể (Capture antibody) Dịch rửa (PBST wash buffer) Đối chứng dƣơng (Positive control) Đối chứng âm (Negative control) Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (ECI enzyme conjugate buffer) 26 Kháng thể gắn enzyme alkaline – phosphatase (Conjugate antibodies) Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu (PNP substrate buffer) Chất chỉ thị màu p – NPP Ngoài ra còn sử dụng thêm: Cồn 70 % Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR  Hóa chất dùng trong ly trích RNA: sử dụng kit ly trích SV total RNA Isolation System do Promega cung cấp. Những hóa chất có sẵn trong kit: Dịch trích mẫu (RNA lysis buffer) Dịch pha loãng RNA (RNA dilution buffer) Dịch rửa (RNA wash solution) DNase I dạng bột DNase stop solution Dịch pha loãng DNase I (Yellow core buffer và MnCl2) Nuclease free water Bên cạnh đó cần sử dụng thêm các hoá chất đã có sẵn trong phòng thí nghiệm: β – mercaptoethanol 14,2 M Ethanol 95 – 100 % NaOH 0,1 M EDTA 1M DEPC (Diethyl pyrocarbonate)  Hóa chất dùng chạy RT – PCR  RT – PCR một bƣớc Reverse transcription 10X buffer MgSO4, 25 mM dNTP mix, 10 mM M – MLV reverse transcriptase 27 Taq DNA polymerase Primer xuôi Primer ngƣợc RNasin Nuclease free water  RT – PCR hai bƣớc Dùng tạo cDNA: sử dụng kit tổng hợp cDNA (Reverse transcription system) do Promega cung cấp với các thành phần sau: AMV reverse transcriptase Recombinant RNasinR ribonuclease inhibitor Oligo(dT)15 primer (0,5 µg/µl) Radom primers (0,5 µg/µl) 1,2 kb kanamycin positive control RNA (0,5 µg/µl) dNTP mix, 10 mM Reverse transcription 10X buffer MgCl2, 25 mM Nuclease free water Hoá chất sử dụng phản ứng PCR: do Promega cung cấp gồm có: Green GoTaq flexi bufer 5X MgCl2 (25 mM) dNTPmix (10 mM) GoTag DNA polymerase (0,5 U/µl) Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease – free water) Primer: Cặp mồi 1: L1 (4377 – 4396) R 5’ – AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC – 3’ Tm = 53,7 L2 (4121 – 4140) F 5’ – ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA – 3’ Tm = 56,5 (J.Morris) 28 Cặp mồi 2 : P28 (3977 – 3996) 5’ – AGA GTG ATC CAT CGG AAG CC – 3’ Tm = 54 M6 (4700 – 4723) 5’ – GCA ATA GAG AGG AAT AAT CGC TCC – 3’ Tm = 55  Hóa chất sử dụng trong điện di Agarose TAE 0,5X Loading dye Ethium bromide Ladder 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu Lấy mẫu cà chua có triệu chứng TSWV tại tỉnh Tiền Giang để tiến hành phân tích. Tiến hành phản ứng ELISA với mẫu bệnh thu đƣợc. Thống kê và so sánh tỉ lệ nhiễm TSWV giữa các vùng lấy mẫu thông qua kết quả ELISA. Lấy mẫu ELISA có biểu hiện dƣơng tính mạnh khảo sát nhằm tìm ra quy trình RT – PCR phù hợp. 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Do đặc tính cà chua đƣợc trồng rất phổ biến tại Tiền Giang nên việc lấy mẫu đƣợc tiến hành bằng cách liên hệ trực tiếp với hộ dân trồng cà chua. Tùy theo diện tích vƣ