Khóa luận Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 18S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ Pangasiidae

larnaudii/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%.  Tỉ lệ % loài P. hypophthalmus = (tổng số lƣợng cá thể loài P. hypophhalmus/tổng số lƣợng cá thể họ Pangasiidae)*100%. Tần số xuất hiện mỗi loài nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau trong ngày và ở các tháng khác nhau trong mùa: Cộng tất cả các cá thể của từng loài phân tích riêng biệt xuất hiện trong từng tháng: Tháng 6, tháng 7, tháng 8 và tháng 9 so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae trên các tháng tƣơng ứng. Tƣơng tự, cộng tất cả các cá thể của từng loài phân tích riêng biệt xuất hiện trong từng thời điểm buổi sáng (5:30 – 6:30 phút), buổi trƣa (11:30 - 12:30 phút), buổi chiều (17:15 – 18:15 phút) và nữa đêm (23:30 – 0:30 phút) so sánh với tất cả các cá thể họ Pangasiidae xuất hiện trong từng thời điểm tƣơng ứng. 3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA Từ ba lọ chứa 3 loài cá nghiên cứu, chọn ngẫu nhiên mỗi lọ 10 cá thể với kích thƣớc từ 15 mm – 30 mm. Ghi nhận và vẽ lại các điểm đặc trƣng của mỗi loài nghiên cứu. Mục đích của giai đoạn này nhằm đối chiếu lại độ chính xác của phƣơng pháp định danh hình thái sau khi phân tích DNA. 22 3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA Dựa vào kết quả định danh theo phƣơng pháp hình thái, sau khi chọn và ghi nhận lại các điểm đặc trƣng của 10 cá thể ở mỗi loài (mục 3.4.2) chúng tôi tiến hành phân lập và giải trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA. Dựa trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene (genbank: đã có dữ liệu về trình tự và kiểu haplotype của 3 loài phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA gồm: Pangasianodon hypophthalmus (mã số truy cập: DQ334282 – DQ334289); P. larnaudii (mã số truy cập: DQ334303 – DQ334313) và P. macronema (mã số truy cập: DQ334314 – 334315). Các trình tự chuẩn này đƣợc sử dụng để làm trình tự đối chứng định danh ba loài phân tích. . 23 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae 4.1.1. Kết quả hình thái phân loại Phân tích 976 mẫu thu đƣợc ở hai nhánh sông Tiền và sông Hậu năm 2006 trong đó có 357 mẫu có xuất hiện cá họ Pangasiidae, chúng tôi đã xác định đƣợc 3 loài của họ cá Pangasiidae (Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii ), theo Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) vị trí phân loại nhƣ sau: Ngành Động Vật có dây sống (Chordata) Phân ngành Động vật có xƣơng sống (Vertebrata) Tổng lớp cá (Pisses) Lớp Cá xƣơng (Osteichthyes) Phân lớp cá Vây tia (Actinopterygii) Bộ Cá nheo (Siluriformes) Họ Cá tra (Pangasiidae) Đặc điểm hình thái phân loại Bộ cá nheo (Siluriformes) Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lƣng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy. Đặc điểm hình thái phân loại họ cá Tra (Pangasiidae) 24 Hai bên cơ thể đối xứng, cơ thể thay đổi từ hình ống đến hình trụ dẹp, vi bụng tách rời vi đuôi, vi lƣng và vi ngực có tia gai cứng, râu rất dài, cơ thể không có vẩy, có vi mỡ nhỏ ở sau vi lƣng, vi hậu môn có 28 – 46 tia mềm, vi đuôi phân thùy sâu, đầu hơi dẹp trên dƣới, miệng dƣới, mép có hai đôi râu. Đặc điểm hình thái phân loại Giống Helicophagus, Pangasianodon và Pangasius 1. Tia vi bụng từ 8 - 9 tia: Pangasianodon. Tia vi bụng nhỏ hơn 8 tia: 2. 2. Tia vi hậu môn từ 37 - 40 tia: Helicophagus. Tia vi hậu môn nhỏ hơn 37 tia : Pangasius. Theo Apichart TermvidChakorn (2003), Nguyễn Văn Hảo (2005) (mục 2.2) và tài liệu của Nguyễn Văn Trọng (1997), Mai Đình Yên và ctv (1979) chúng tôi đã tổng hợp nên các đặc điểm hình thái phân loại loài: Pangasianodon hypophthalmus, Pangasius macronema và Pangasius larnaudii đƣợc mô tả và ghi nhận ở mục 4.2. 25 Họ Pangasiidae; 357; 36,56% Họ khác; 619; 63,44% Họ Pangasiidae Họ khác 42 55 71 189 0 50 100 150 200 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu Số lư ợn g m ẫu 32 155 72 98 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu Số lư ợn g m ẫu 4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính 4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 A B Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae. A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày (sáng: 5:30 – 6:30 phút; trƣa: 11:30 – 12:30 phút; chiều: 17:15 – 18:15 phút và nữa đêm: 23:30 – 0:30 phút). B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng mẫu có xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. 26 Kết quả giai đoạn định tính: có 357 mẫu xuất hiện loài cá thuộc họ Pangasiidae trên tổng 976 mẫu thu từ tháng 6/2006 – tháng 9/2006 (biểu đồ 4.1). Pangasiidae chỉ có 13 loài trên tổng số 255 loài cá nƣớc ngọt vùng ĐBSCL (Mai Đình Yên và ctv, 1985) nhƣng xuất hiện với tần số rất lớn 36,56% trên tổng số mẫu thu đƣợc. Ngoài ra, Pangasiidae có tần suất phân bố rất rộng và tập trung cao nhất vào tháng 7 (biểu đồ 4.2B). Từ đây bật lên hai vần đề: thứ nhất, tuy cá thuộc họ Pangasiidae có nhiều loài nhƣng lại đẻ khá tập trung và đẽ trƣớc tháng 7 nên đến tháng 7 tại vùng sông Cửu Long thu đƣợc nhiều nhất (155 trên tổng 357 mẫu có xuất hiện cá họ Pangasiidae). Thứ hai, có một số loài thuộc họ Pangasiidae đẻ rãi rác và kéo dài trong suốt mùa nghiên cứu nên các tháng còn lại đều thu đƣợc, nhƣng có số lƣợng thấp hơn hoặc đẻ cùng một lúc nhƣng vị trí các bãi đẻ khác nhau nên khi trôi xuống sông Cửu Long có sự phân bố không đồng đều về số lƣợng các mẫu cá có họ Pangasiidae trong các tháng. Tuy nhiên, ở biểu đồ 4.2A theo phân bố ngày đêm, trong số 357 mẫu cá có họ Pangasiidae xuất hiện nhiều nhất vào lúc giữa đêm chiếm 189 mẫu trên tổng 357 mẫu có xuất hiện họ Pangasiidae và tăng dần từ các thời điểm từ sáng, đến trƣa, đến chiều. Điều này chúng tôi cho rằng, tần số xuất hiện nhiều vào lúc giữa đêm liên quan đến vấn đề về lƣu tốc nƣớc, vì thủy triều ban đêm mạnh hơn ban ngày và các loài này có khả năng ban đêm đẻ nhiều hơn ban ngày nên thu ban đêm đƣợc nhiều hơn và ban ngày cũng thu đƣợc nhƣng với tần số thấp hơn. Nhìn chung, từ các kết quả trên có thể nói lên rằng, Pangasiidae có tần suất phân bố rất rộng đặc biệt là lúc giữa đêm. Nguồn tài nguyên về loại cá kinh tế này rất phong phú. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này không vô hạn. Để sử dụng lâu dài thì cần có mục đích và biện pháp khai thác thích hợp. 27 4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu đƣợc A B Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu Pangasiidae. A: biểu đồ biểu diễn tần số xuất hiện mẫu có xuất hiện loài phân tích so với tổng mẫu Pangasiidae Mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu; 225; 63,02% Mẫu xuất hiện loài nghiên cứu; 132; 36,98% Mẫu không xuất hiện loài nghiên cứu Mẫu xuất hiện loài nghiên cứu 22 15 45 5042 55 71 189 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Sáng Trưa Chiều Tối Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g m ẫ u Mẫu xuất hiện loài phân tích Tổng Mẫu Pangasiidae 17 48 15 52 32 155 72 98 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Tháng 6 Thang 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu S ố l ư ợ n g m ẫ u Mẫu xuất hiện loài phân tích Tổng mẫu Pangasiidae 28 ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tần số xuất hiện mẫu có xuất hiện loài phân tích so với tổng mẫu Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Nhìn vào biểu đồ 4.3 ta thấy, các loài cá phân tích xuất hiện trong 132 mẫu trên tổng 357 mẫu có cá thuộc họ Pangasiidae (xấp xỉ 1/3), trong khi 3 loài nghiên cứu (P. hypophthalmus, P. larnauudi, P. macronema) chiếm tỷ lệ trên 1/4 trong 13 loài thuộc họ Pangasiidae. Điều này cho thấy tần số xuất hiện các loài này tƣơng đối nhiều. Ở biểu đồ 4.4B, các loài cá họ Pangasiidae nói chung và các loài phân tích nói riêng đều xuất hiện rất ít vào tháng 8 và tháng 6, nhiều vào tháng 7. Tuy nhiên, tần suất xuất hiện mẫu chứa các loài này không tập trung vào tháng 7 mà tập trung nhiều vào tháng 9. Đến đây chỉ có thể nói rằng tần suất phân bố các loài nghiên cứu dày ở tháng 9. Ở biểu đồ 4.4A, tuy không xuất hiện đột biến nhiều vào giữa đêm nhƣ các loài Pangasiidae nói chung nhƣng số lƣợng mẫu xuất hiện các loài nghiên cứu cũng tăng dần từ trƣa đến chiều, đến nửa đêm. Nhìn chung, kết quả nghiên cứu này rất có ý nghĩa đối với việc khai thác các loài Pangasiidae mong muốn, nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại về nguồn tài nguyên cá bột trên sông Cửu Long. 29 4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng 4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác A B A B Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae. Tổng cá thể loài khác; 2848; 88,64% Tổng cá thể các loài phân tích; 365; 11,36% Tổng cá thể loài khác Tổng cá thể các loài phân tích 293 528 564 1828 31 29 115 190 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae Các loài phân tích 208 2358 140 507 62 166 20 117 0 500 1000 1500 2000 2500 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu ẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae Các loài phân tích 30 A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng các loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng các loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Kết quả quá trình phân tích hình thái ở giai đoạn định lƣợng: Tổng số lƣợng cá thể cá bột có trong 357 mẫu họ Pangasiidae (mục 4.1.2.2) là 3.213 cá thể, trong đó các loài phân tích chỉ có 365 cá thể, chiếm 11,36% tổng lƣợng Pangasiidae thu đƣợc (biểu đồ 4.5). Nhìn chung, qua các biểu đồ phân bố theo mùa của các loài cá họ Pangasiidae về tần suất xuất hiện và số lƣợng đều rất cao vào tháng 7 (biểu đồ 4.4B và 4.6B). Điều đó chứng minh rằng, các loài cá họ Pangasiidae tâp trung đẻ nhiều vào trƣớc tháng 7, và đây cũng là mùa sinh sản chính của các loài cá này. Vì vậy mà tại thời điểm tháng 7, vùng sông Cửu Long thu đƣợc nhiều loài cá họ Pangasiidae nhất. Tuy số lƣợng các loài nghiên cứu thấp hơn nhiều so với tổng lƣợng cá họ Pangasiidae thu đƣợc, nhƣng cả lƣợng mẫu và số lƣợng cá thể các loài cá nghiên cứu cũng tuân theo quy luật trên. Tƣơng tự, các loài họ Pangasiidae nói chung và các loài phân tích nói riêng, theo phân bố ngày đêm cả tần suất xuất hiện và tỷ lệ đều rất cao vào thời điểm buổi chiều và giữa đêm. 31 2848; 88,64% 36; 1,12% 12; 0,37% 317; 9,87% các loài không phân tích P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ Pangasiidae A B Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng Pangasiidae. 293 528 564 1828 26 10112 178 13 125 611 10 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Sáng Trưa Chiều Nữa đêm Thời điểm thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể các loài không phân tích P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 2358 507 140208 17 146 10153 316 3 149 3 0 500 1000 1500 2000 2500 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng thu mẫu S ố l ư ợ n g c á t h ể Pangasiidae P. macronema P. larnaudii P. hypophthalmus 32 A: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng từng loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các thời điểm khác nhau trong ngày. B: biểu đồ biểu diễn tổng số lƣợng từng loài phân tích so với tổng lƣợng Pangasiidae ở các tháng khác nhau trong mùa. Khi phân tích về số lƣợng từng loài nghiên cứu (biểu đồ 4.7), trong 3213 cá thể thuộc họ Pangasiidae (mục 4.1.2.3) thì: P. hypophthalmus (cá tra sông) chiếm tỷ lệ rất ít 12 trên tổng số 3213 cá thể họ Pangasiidae (xấp xỉ 0,37%). Trong đó chỉ có 1 mẫu tháng 6 chiếm cao nhất là 9 cá thể, và ba mẫu còn lại mỗi mẫu 1 cá thể đều rơi vào tháng 9. Điều này có thể kết luận rằng, cá P. hypophthalmus đẻ sớm nhất, tức đẻ trƣớc tháng 6 vì vậy đến thời điểm tháng 6 thì vùng sông Cửu Long thu số lƣợng nhiều nhất; Loài P. macronema (cá sát) có 99 mẫu, rơi vào tháng 9 nhiều nhất (35 mẫu) nhƣng số lƣợng cá thể chỉ có 101. Tuy tháng 7 chỉ có 37 mẫu nhƣng tần suất xuất hiện lại rất nhiều: 146 cá thể. Tháng 6, tháng 8 đều xuất hiện nhƣng với số lƣợng rất ít. Nhƣ vậy, loài này đẻ rãi rác ở các tháng trong mùa nhƣng đẻ nhiều nhất là thời điểm trƣớc tháng 7; Riêng loài P. larnaudii (cá vồ đém) xuất hiện không đều, chỉ có 29 mẫu (với 36 cá thể) nhƣng lại phân bố đều trong 4 tháng nghiên cứu. Khả năng loài này đẻ rãi rác trong suốt mùa nghiên cứu nhƣng nhiều nhất là tháng 7 (có 11 mẫu với 16 cá thể) nên các tháng còn lại đều xuất hiện nhƣng rất ít. Lý do thứ hai cũng có thể do đẻ cùng lúc và di cƣ một lƣợt nhƣng bãi đẻ khác xa nhau, nên khi trôi xuống sông Cửu Long thì thu đƣợc rãi rác ở nhiều tháng trong mùa. Tƣơng tự, biểu đồ 4.8B tuy các loài phân tích có số lƣợng rất thấp so với tổng lƣợng cá họ Pangasiidae nhƣng đều xuất hiện nhiều vào lúc chiều và nữa đêm. Riêng loài P. hypophthalmus chỉ xuất hiện vào hai thời điềm là trƣa và chiều. Từ kết quả này cho thấy, các loài phân tích có tần suất xuất hiện và số lƣợng đều rất thấp so với tổng lƣợng Pangasiidae thu đƣợc. Hiện nay, hai loài cá đƣợc ngƣ dân vùng sông Cửu Long nuôi phổ biến là P. hypophhalmus và P. larnaudii. Từ kết quả này cho thấy rằng, ngƣ dân vùng đã giết khoảng 98% các loài thuộc họ Pangasiidae không mong muốn, chƣa kể đến các loài trong họ khác để chỉ đƣợc thu hai loài P. hypophthalmus và P. larnaudii. Đây là điều nguy hiểm đe dọa mối nguy 33 cơ tuyệt chủng của một số loài cá đang hiếm của vùng. Vì vậy cần có biện pháp bảo vệ và khai thác thích hợp nguồn tài nguyên vốn có trên sông Cửu Long. 4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA Từ 3 lọ chứa 3 loài phân tích, chọn ngẫu nhiên mỗi loài ra 10 cá thể để chuẩn bị cho quá trình phân tích DNA, các điểm đặc trƣng của các loài trên đƣợc ghi nhận và mô tả lại theo hình sau: o Pangasianodon hypophthalmus: Rất dễ phân biệt với các loài khác do có nhiều sắc tố nâu đen dọc theo thân mà các loài khác không có. Ngoài ra còn có sắc tố đen trên đầu và đuôi, cán đuôi thon và thân thon dài hơn các con khác. Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm. o Pangasius larnaudii: Tuy cũng có thân dài và dẹp dần về phía đuôi, cũng có hai đôi râu nhƣng điểm khác biệt để nhận dạng loài này so với các loài khác là: đầu to hơn các loài khác, miệng rộng kéo dài đến mắt, bụng cũng rất to và có nhiều hắc tố. Đuôi cũng có hắc tố giống nhƣ P. hypophthalmus, nhƣng vi ngực và vi lƣng có hắc tố rất rõ, đặc biệt sau nắp mang có chấm hắc tố. 34 Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm. o Pangasius macronema: loài này rất dễ nhầm lẩn với Pangasius siamensis (cùng giống), thân dài, hơi dẹp về phía đuôi, cũng có hắc tố trên đầu và thân, vi lƣng cũng có 1 tia cứng và 7 tia mềm, nhƣng khác biệt là P. siamensis mắt to hơn, râu dài hơn và đặc biệt sau gốc vi lƣng chẩm xuống mà ở P. macronema không có. Ngoài ra ở P. macronema, có hắc tố quanh gốc vi lƣng nhiều hơn và không có hắc tố trên gốc vi lƣng nhƣ P. siamensis. Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm 4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA Trƣớc khi nhân dòng vùng 16S rRNA trên mtDNA của tất cả các mẫu cá phân tích, chúng tôi thực hiện 2 lần thí nghiệm trên 3 loài đã định danh hình thái 35 đối với mẫu thu năm 2006 và 1 lần thí nghiệm cho mẫu năm 2005 bảo quản trong formol 5%: Lần 1: 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 15 mm, 2 mẫu P. macronema có kích thƣớc 24 mm và 1 mẫu cá tra bảo quản trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử dùng làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có 1 mẫu 5T (giếng thứ 1) cho kết quả, 4 mẫu còn lại không có vạch DNA nào (hình A). Lần 2: Tiếp tục tách 2 mẫu cá tra kích thƣớc 19 mm, từ các mẫu đã định danh năm 2006 và 1 mẫu cá tra (ký hiệu 5T) phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân tử làm đối chứng dƣơng. Kết quả chỉ có mẫu 5T cho một vạch DNA (giếng thứ 1), hai mẫu còn lại âm tính (giếng 1 và giếng 2) (hình B). Lần 3: Cũng theo phƣơng pháp định danh nhƣ thế chúng tôi chọn 6 mẫu cá lớn đã xác định chính xác là cá họ Pangasiidae (kích thƣớc: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm), nhằm mục đích kiểm chứng lại DNA có bị phân huỷ bởi formol không và 1 mẫu chứng dƣơng 5T đã sử dụng cho lần thí nghiệm 1 và 2. Kết quả tƣơng tự, cả 6 mẫu cá lớn thuộc họ Pangasiidae bảo quản trong formol năm 2005 đều cho kết quả âm tính, chỉ có mẫu 5T là cho 1 băng DNA duy nhất (hình C). Hình 4.4: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu năm 2006 và năm 2005. Hình A: lần thí nghiệm thứ nhất với 2 mẫu cá P. macronema 15 mm (giếng 1, giếng 2) 36 và 2 mẫu cá 24 mm (giếng 3 và giếng 4). 5T: mẫu đối chứng dƣơng. Hình B: lần thí nghiệm thứ 2 với 2 mẫu cá P. hypophthalmus 19 mm (giếng 1, giếng 2). Mẫu 5T làm đối chứng dƣơng và M: thang Lambda DNA ECoRI Hind III. Hình C: lần thí nghiệm thứ 3 với 6 mẫu cá thuộc họ Pangasiidae có kích thƣớc lần lƣợc là: 76 mm, 81 mm, 83 mm, 86 mm, 93 mm và 110 mm (giếng thứ 1 đến giếng thứ 6). 5T là mẫu đối chứng dƣơng. Kết quả cả 3 lần thí nghiệm trên đều cho một kết quả duy nhất là mẫu 5T từ phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đều cho kết quả dƣơng và duy nhất chỉ có một vạch DNA. Nhƣ vậy, sản phẩm DNA rất tinh, phản ứng PCR chạy tốt. Trong hai lần thí nghiệm đầu, sau khi thực hiện phản ứng PCR các mẫu phân tích không cho vạch băng DNA nào có thể là do định danh sai hay DNA bị phá hủy bởi formol. Nhƣng với lần thí nghiệm thứ 3, thực hiện trên cả 6 mẫu cá lớn vẫn không cho một vạch băng DNA nào trong khi mẫu 5T vẫn hiện một vạch băng DNA rất rõ. Đến đây chúng tôi có thể kết luận rằng, formol đã phá hủy DNA. Nhƣ vậy, mẫu cá năm 2006 không thể tiến hành phân tích DNA đƣợc. Chúng tôi tiến hành định danh bổ sung 64 mẫu cá thu vào tháng 6/2007 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu với phƣơng pháp định danh nhƣ đã định danh các mẫu cá năm 2006 và cách bố trí thí nghiệm tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục 3.4. Từ kết quả này, chúng tôi chọn 26 cá thể ngẫu nhiên từ 3 loài và có kích thƣớc chiều dài thân từ 15 mm đến 30 mm để kiểm tra trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA (Bảng 4.1). 37 Tên loài Ký hiệu Chiều dài thân (mm) P. hypophthalmus H1 15 H2 16 H3 17 H4 17 H5 18 H6 20 H7 21 H8 21 H9 21 P. larnaudii L1 20 L2 22 L3 23 L4 25 L5 27 L6 27 L7 28 L8 30 P. macronema M1 15 M2 17 M3 20 M4 22 M5 22 M6 22 M7 22 M8 25 M9 30 Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích DNA ty thể từ các mẫu cá đã chọn đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp phenol- chloroform. MtDNA sau khi tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong 100 µl nƣớc cất khử ion và sử dụng trực tiếp trong phản ứng PCR nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA trên mtDNA. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 1% (Hình 4.5). 38 Kết quả cho thấy, mồi chuyên biệt 16Sar và 16Sbr đã khuếch đại đặc hiệu với trình tự đích trên mtDNA để cho ra một băng sản phẩm duy nhất có kích thƣớc khoảng 630 bp. Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu của Na-Nakorn và cộng sự (2006). Đến đây chúng tôi có thể xác định đƣợc các mẫu cá trên thuộc họ Pangasiidae. Chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự tất cả 26 mẫu cá phân tích, để xác định chính xác từng loài. Đồng thời kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. 4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema Chín mẫu cá ngẫu nhiên của loài P. macronema đƣợc đánh số ký hiệu từ M1 đến M9, mỗi cá thể có kích thƣớc khác nhau nhƣ đã trình bày ở bảng 4.1. Trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của từng cá thể đƣợc phân tích bằng chƣơng trình BLAST cho thấy cả chín trình tự đều có độ tƣơng đồng cao nhất với kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gene DQ334314). Trên cơ sở kết quả này, chƣơng trình DNAMAN đƣợc sử dụng để thực hiện phép so sánh trình tự giữa 9 mẫu phân tích với hai trình tự kiểu gen P. macronema haplotype Pm01 (mã số trên ngân hàng gen DQ334314) và P. macronema haplotype Pm02 ( mã số M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M Hình 4.5.: Sản phẩm PCR khuếch đại một vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá đại điện; M : thang LambdaDNA ECoRI Hind III; giếng 1, 2, 3: loài P. hypophthalmus ; giếng 4, 5, 6 loài P. larnaudii; giếng 7, 8, 9: loài P. macronema. 947 bp 564 bp 831 bp 630 bp 39 trên ngân hàng gen DQ334315). Kích thƣớc các cá thể phân tích xem chi tiết ở bảng 4.1. DQ334314 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334315 -------------------------------------------------- 50 M1 -------------------------------------------------- 50 M2 -------------------------------------------------- 50 M3 -------------------------------------------------- 50 M4 -------------------------------------------------t 50 M5 -------------------------------------------------t 50 M6 -------------------------------------------------- 50 M7 -------------------------------------------------t 50 M8 -------------------------------------------------- 50 M9 -------------------------------------------------- 50 Hình 4.6a DQ334314 TTTGTTCAACGATTAAAGTCCT 572 DQ334315 ---------------------- 572 M1 ---- 554 M2 -----a---------t------ 572 M3 -----a---------t----- 571 M4 -----a---------t------ 572 M5 -----a---------t------ 572 M6 -----a---------t------ 572 M7 -----a---------t------ 572 M8 -----a---------t------ 572 M9 -----a---------t------ 572 Hình 4.6b Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA loài P.macronema trên ngân hàng gen (DQ334314, DQ334315) với trình tự 8 mẫu P. macronema phân tích (từ M1 – M9). Hình 4.6a: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 50 của mẫu M4, M5, M7 so với hai trình tự chuẩn. Hình 4.6b: Điểm đột biến tại vị trí nucleotide thứ 556 và 566 của 8 mẫu cá P. macronema (từ M2 đến M9) đang phân tích với hai trình tự chuẩn trên ngân hàng gene. Theo kết quả so sánh trình tự vùng 16S rRNA của mẫu cá M1 tƣơng đồng cao nhất so với kiểu gen P. macronema (Pm01) là 100% (xem phần phụ lục). Đặc biệt, kết quả phân tích cho thấy có 1 đột biến thay thế nucleotide ở 8/9 mẫu phân tích (mẫu M1 không có dữ liệu) có kết quả thống nhất khác biệt so với P. macronema (Pm01) và P. macronema (Pm02), đây là hai đột biến thay thế tại vị trí 556 (Thymine đƣợc thay bằng Adenine) và 566 (Adenine đƣợc thay bằng Thymine) (hình 4.6b). 40 Ngoài ra, còn ba vị trí mang đột biến thay thế nucleotide khác cũng đƣợc ghi nhận là Adenine thứ 50 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M4, M5, M7 (hình 4.6a); Cytosine thứ 251 đƣợc thay bằng Thymine ở mẫu M2 (xem phụ lục), và cuối cùng là vị trí Cytosine thứ 326 của mẫu M8 đƣợc thay bằng Thymine (hình 4.6a). Từ kết quả trên chứng tỏ rằng, khóa phân loài dựa vào hình thái đối với loài P. macronema mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp khi định danh lại bằng cách so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của mtDNA. Khi nhìn vào trình tự giữa các cá thể chúng tôi phân tích và trình tự P. macronema (DQ334314) có vài điểm không tƣơng đồng. Có thể là lý do sau: trong quá trình tiến hóa các cá thể có thể gặp những biến cố về môi trƣờng dẫn đến một số nucleotide bị biến đổi để quy định các tính trạng phù hơp hơn với môi trƣờng sống. Rất có thể đây là những kiểu gen mới mà các tác giả đi trƣớc chƣa ghi nhận đƣợc trong khi hai trình tự của P. macronema trên ngân hàng genbank chỉ khác nhau duy nhất một nucleotide tại vị trí 267 Thymine đƣợc thay bằng Cytosine (xem phần phụ lục). 4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus Tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp các mẫu cá thuộc loài P. macronema, chín mẫu cá bột của loài P. hypophthamus đƣợc định danh theo phƣơng hình thái học và đặt tên lần lƣợt từ H1 đến H9 (xem bảng 4.1). Kết quả so sánh trình tự vùng mtDNA mã hóa 16S rRNA của chín mẫu này với tám kiểu gene của loài P. hypophthalmus (DQ334282, DQ334283, DQ334284, DQ334285, DQ334286, DQ334287 DQ334288 DQ334289) tham khảo trên ngân hàng gene đều có độ tƣơng đồng cao (100%). DQ334282 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334283 -------------------------------------------------- 2