Luận văn Định danh nấm Phytophthora SPP bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

àn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được bao phủ bởi những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập từ những đốm đen trong điều kiện này. Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 – 180C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm ướt và có sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật bệnh tăng nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần cuối tháng. Và cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận đã trưởng thành. Vào tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là 10% trong khi trên cây mận bốn năm tuổi là 2,1%. 2.2.7. Cao su Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. P. palmivora được phân lập từ khoảng 70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi P. botryosa được tìm thấy trên 75 – 80% từ lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài P. palmivora và P. botryosa được biết là tác nhân gây bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước. 10 2.3. Phát hiện và định danh Phytophthora Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác nhau 2.3.1. Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi trƣờng nuôi cấy Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh. Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm: hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào tử vách dày và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức hữu tính là cùng tản hay khác tản Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng; (1) Loét thân cây ca cao do P.palmivora; (2) Thối rễ tiêu do P.capsici; (3) Tổn thƣơng thân cà chua do P.infestans; (4) Thối nõn dứa do P.nicotianae 11 Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8 juice, cà rốt agar, lima bean agar. Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora. Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học phân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic, Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi) 2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không nhiều về di truyền và cơ chế. Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau của các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thể không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủng kiểm tra đã biết. 12 So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa vào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánh giá những đặc điểm di truyền khác. Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ). 2.3.3. Kỹ thuật protein profile Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật này bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹ thuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne). 2.3.4. Isozymes Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm,và chuẩn bị mẫu. Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột 2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13 với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mô cây hay đất. Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các chủng đặc biệt. Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí bệnh. 2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP) Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hóa chất. Sự khác nhau về kích cở các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn, hay thêm đoạn DNA). Giá cả để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng giá cả sẽ giảm, và ứng dụng của phản ứng này tăng khi thay thế các probe đánh dấu phóng xạ thành các probe không đánh dấu. Phân tách RFLP thường dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức độ loài hay dưới loài . 2.3.7. Kỹ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular karyotyping Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi 14 xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện trong các loài đã biết. Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự, 1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm. Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989). 2.3.8. Sự lai DNA-DNA Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng giữa các loài thường rất đáng kể. 2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt. Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng. 15 2.4. Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 2.4.1. Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc: Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora. Sản phẩm PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI, TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác bằng cách dùng phần mềm so sánh trình tự PHYLIP [7]. P. palmivora được phân lập từ cây cacao và cây dừa. P. capsici được phân lập từ ca cao, tiêu đen và tiêu chuông đã được chọn lọc từ nhiều địa phương khác nhau của Ấn Độ. Tác giả sử dụng cập mồi ITS1, ITS2 để khuếch đại vùng ITS của gen rDNA bằng kỹ thuật PCR và phân tích AFLP. Dòng phân lập của P. capsici (P575) từ cacao ở Mehico cũng bao gồm trong sự so sánh đa dạng di truyền ở trên. Phân tích AFLP của P. palmivora phân lập từ cây ca cao và cây dừa cũng giống như các mẫu khác. Nhưng các phân tích AFLP của loài P. capsici cho thấy sự khác nhau một cách hiển nhiên với loài P. palmivora. Do đó, vùng ITS được dùng như marker phân loại để xác định giống Phytophthora và AFLP được dùng cho việc ước định những thay đổi đặc biệt bên trong [14]. Sử dụng kết hợp 2 phương pháp: quan sát hình thái và sinh học phân tử. Phương pháp sinh học phân tử dùng cho những nghiên cứu chi tiết, sử dụng PCR- RFLP phân tích đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 trên vùng ITS thuộc DNA ribosome của 180 dòng phân lập. Phân tích trình tự trên ITS2 cho 50 dòng phân lập được dùng cho điều tra mối quan hệ giữa sự thay đổi di truyền và sự phát sinh loài giữa các loài phân lập. Dòng phân lập được chia làm 12 nhóm dựa theo kiểu phát triển của chúng trên môi trường CMA (Corn Meal Agar). Phân cắt bằng 3 enzyme cắt nhằm tìm ra sự phát sinh loài trong vùng ITS2 [11]. Nghiên cứu trình tự lặp lại ITS (internal transcribed spacer) của gen rDNA và đa dạng độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP) DNA tổng của loài mới (mầm bệnh Phytophthora trên cây dương đỏ ở Châu Âu). Kỹ thuật lai (heteroploid-interspecific hydrid) trên P.cambivora, một số loài khác và một loài chưa rõ giống như P. fragariae. Phương pháp này đánh dấu tính biến đổi di truyền đang tăng, sự thay đổi hình thái một cách khác thường, sự tái tổ hợp trên vùng ITS [15]. Kỹ thuật PCR dùng để xác định Phytophthora capsici trên cây tiêu. Ba mồi PCR ( CAPFW, CAPRV1 và CAPRV2) được thiết kế đặc biệt dựa trên trình tự của 16 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome (A.Drenth và J.A.G Irwin,2001) vùng ITS của chúng. Cặp mồi CAPFW/CAPRV1 khuếch đại sản phẩm 452bp trong khi cặp mồi CAPFW/CAPRV2 khuếch đại đoạn 595bp. Cặp mồi CAPFW/CAPRV2 trong PCR dùng để phát hiện đoạn gel của P.capsici trong cây được chủng bệnh. Kết quả xuất hiện sau 8 giờ chủng bệnh trên mẫu gốc bị ảnh hưởng trong khi cây vẫn chưa thấy sự biểu hiện bệnh của cây [8]. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Sử dụng hai kỹ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa Vũng Tàu, Phytophthora parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng và lan Dendrobium ở Đắc Lắc và Tp. HCM [1]. 2.5. Sơ lƣợc về trình tự ITS và danh mục các loài Phytophthora ở Việt Nam 2.6.1. Sơ lƣợc về trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc phát hiện đặc biệt giống Phytophthora và các loài thuộc giống này giữ vai trò quan trọng trong quá trình tìm ra những trình tự có tính ổn định cao. Các trình tự đó phải thể hiện sự khác biệt đặc biệt sao cho ta có thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng. Gen mã hóa vùng ribosomal RNA trên sinh vật Eukaryote đảm bảo được chất lượng này. Chúng là một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng biểu hiện mà vùng này có sự khác biệt về sự thay đổi trình tự giữa các loài. Mặt khác, độ nhạy của các kiểm tra chẩn đoán tăng khi gen mục tiêu tồn tại ở một số lượng lớn trong genome. Trong hầu hết các sinh vật Eukaryote gen ribosomal RNA (rDNA) gồm một họ đa gen, trong đó các bản sao được sắp xếp lặp lại liên tiếp nhau. Mỗi đoạn lặp lại gồm một đơn vị phiên mã 17 đơn bao gồm một cấu trúc tiểu đơn vị nhỏ 5,8S và một cấu trúc tiểu đơn vị lớn (chia làm hai phần ) là ITS1, ITS2 (A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001) Primer ITS4 và ITS5 là các Universal primer được White và cộng sự (1990) thiết kế để khuếch đại đoạn gen nằm trong vùng ITS. Đoạn gen của giống Phytophthora có kích thước 900bp. Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài; mô tả vùng ITS bằng các enzyme cắt chuyên dụng như: TaqI, AluI, MspI. 2.6.2. Danh mục các loài Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (A. Drenth và I. Guest, 2004) Tên loài Kí chủ Bệnh Năm Tài liệu tham khảo P.botryosa Cao su Rụng lá 1961 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) P.cactorum Mận Thối trái 1996 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) P.capsici Tiêu đen Thối rễ 1998 NguyễnViết Trọng (2002) P.cinnamomi Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.citrophthora Họ cam chanh Thối trái Roger (1951) Loét thân P.colocasiae Khoai mỡ Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) P. infestans Khoai tây Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) Cà chua Tàn lụi lá Cà trứng Tàn lụi lá P.nicotianae Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Thuốc lá Thân đen 1967 NIPP (1975) Họ cam chanh Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.palmivora Sầu riêng Tàn lụi lá 2000 Đặng Vũ Thị Thanh 18 và cộng sự (2004) Dừa Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Cacao Thối trái 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Caosu Tàn lụi lá 1965 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) Rụng lá P.durian Sầu riêng Loét 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Phytophthora sp Cao su Loét thân 1965 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Ziziphus Thối trái 1997 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Nhãn Thối trái 1995 Đặng Vũ Thị Thanh Tàn lụi lá và Hà Minh Trung (1999) 19 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 06/02/2006 cho đến ngày 15/08/2006 3.1.2 Địa điểm thực hiện: - Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. - Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu và hóa chất: Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. 3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối a. Vật liệu và hóa chất Đường Glucose Agar Khoai tây Cồn 70% và Cồn 96% Cà rốt CaCO3 3.2.2 Ly trích DNA a. Vật liệu và dụng cụ:  Máy vortex  Máy ủ nhiệt độ 600C  Máy li tâm Siqma  Ống nghiệm(eppendorf) 1,5 ml 20  Pipetman và đầu tip các loại ( hãng Nichikyo Le) b. Hóa chất: ( Merk)  Lysis buffer( 50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol) pH 8,0.  Nitơ lỏng  Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1).  Isopropanol.  Ethanol 70%.  Dung dịch TE ( 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). 3.2.3 Kỹ thuật điện di a. Vật liệu và hóa chất  Dung dịch TAE( Tris HCl; Na2EDTA 0,5 M; Glacial acetic acid).  Agarose.  Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%. 3.2.4 Kỹ thuật PCR a. Vật liệu  Mẫu nấm ly trích. b. Hóa chất ( Biorad)  dNTPs(dATP; dTTP; dGTP; dCTP), MgCl2, 10X PCR buffer.  Taq DNA polymerase( BioRad).  Ethidium bromide; dung dịch đệm TAE 0,5%. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối Mẫu nấm đã thu thập trên nhiều mẫu khác nhau được tăng sinh trên môi trường PGA. Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar) - Khoai tây 200gram - Glucose 20gram - Agar 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa petri. 21 Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 250C – 280C. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4 – 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường cà rốt ). Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt - Cà rốt 600gram - CaCO3 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất; hấp tiệt trùng 1000C / 20 phút. Để nguội lọc qua rây và 4 lớp vải lọc, lấy dịch trong. Thêm 15gram CaCO3 vào dung dịch khuấy đều, sau đó lắng 20 phút. Gạn lấy dịch lỏng, bỏ CaCO3. Chia đều dung dịch vào bình tam giác hay chai nước biển với thể tích khoảng 100 ml/chai. Hấp tiệt trùng 1210C/ 1atm / 20 phút. Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối - Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm. - Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm. - Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt. Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng. Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải lọc và làm cho khô kiệt bằng giấy thấm. Bảo quản mẫu ở -700C. 3.3.2 Ly trích DNA Mẫu nấm trước khi chiết tách DNA phải qua quá trình nghiền mẫu trong Nitơ lỏng và được cho vào các eppendorf. Qui trình ly trích DNA tổng số: dựa trên qui trình ly trích được của Lee và Taylor (1990) có cải tiến thêm một số bước. Các hóa chất cần pha để thực hiện qui trình ly trích - Lysis buffer(50mM Tris-HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol). - Hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1). - TE(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). Có hai qui trình ly trích DNA được sử dụng 22 3.3.2.1 Qui trình 1 - Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng một phần ba eppendorf nấm. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis buffer. - Ủ ở nhiệt độ 650C trong 1 giờ. - Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục. - Ly tâm 13000 rpm/ 15 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho isopropanol vào theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf. - Rửa mẫu nhiều lần bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu. - Hòa tan mẫu với lượng TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng. 3.3.2.2 Qui trình 2 - Sử dụng mỗi eppendorf chứa khoãng một phần ba eppendorf mẫu. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis Buffer. - Ủ ở 650C trong một giờ. - Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho 2 l RNase vào eppendorf trên, ủ ở 370C trong một giờ. - Hút khoảng 400 l Chloroform/ Isoamyl alcohol cho vào, lắc nhẹ đều. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, hút pha trên vào một eppendorf mới. - Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf. - Rửa mẫu bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu. - Pha loãng mẫu với TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng. Mẫu ly trích được bảo quản ở 40C. Kiểm tra kết quả ly trích bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 0,8%. 23 Thành phần trong bản gel agarose 0,8% - Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml - Agarose 0,1gram Sản phẩm ly trích DNA được chạy điện di trong dung dịch TAE và chạy 100V/ 20 phút/ 250mA. Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc kết quả trên máy Geldoc. DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến hành phản ứng PCR. Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong một khoảng khá rộng từ 3ng đến 100ng tùy thuộc mẫu DNA. 3.3.3 Kỹ thuật PCR Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR.Chủ yếu có 3 loại - Pha dNTPs có nồng độ là 2,5mM. - Pha loãng hai primer ITS4, ITS5 ra nồng độ 100pmol/ l. - Pha loãng mẫu DNA sau cho lượng DNA < 100ngram/ l. - Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C). - Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là: ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’) Bảng 3.1.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 50mM 1,5mM 0,75 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,1 l DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l 24 Nước cất vừa đủ 25 l Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 5 l MgCl2 50mM 1,5mM 2 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,2 l DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l Nước cất vừa đủ 50 l Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản