Luận án Nghiên cứu cải tiến năng suất một số dòng/giống lúa bằng chỉ thị phân tử - Nguyễn Thị Thúy Anh

ia thí nghiệm đều có khả năng chống chịu sâu bệnh ở mức trung bình đến khá. Nhìn chung, các giống lúa Japonica có mức nhiễm bệnh 61 biến động ở mức nhiễm nhẹ (0-1) đến trung bình (3-5). Qua kết quả đánh giá thực tế, một số dòng nhập nội triển vọng có mức kháng bệnh hại khá là dòng KC1, KC25 và KC10. Từ kết quả đánh giá một số tính trạng nông sinh học của 13 dòng/giống cho QTL/gen cho thấy, dòng KC25 là dòng có tiềm năng năng suất cao nhất, có khả năng chống chịu sâu bệnh ở mức khá, đặc biệt dòng KC25 có độ thuần khá hơn các dòng còn lại. Vì vậy, dòng KC25 đã đƣợc lựa chọn là giống cho QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông. 3.1.2. Đánh giá các chỉ tiêu hình thái sinh trƣởng phát triển, chỉ tiêu năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các giống lúa dùng làm dòng/giống nhận gen Với mục đích cải tiến năng suất của một số dòng/giống lúa đang đƣợc trồng phổ biến ở vùng đồng bằng sông Hồng và dòng lúa mới triển vọng, chúng tôi đã lựa chọn giống Khang dân 18 và dòng NPT1 làm dòng/giống nhận QTL/gen. Vì vậy, hai dòng/ giống nhận gen cũng đƣợc gieo trồng và đánh giá chỉ tiêu sinh trƣởng và yếu tố cấu thành năng suất vào vụ Xuân 2013. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả theo dõi các chỉ tiêu hình thái sinh trƣởng, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng nhận gen vụ Xuân 2013 tại Từ Liêm - Hà Nội TT Tên giống TGST (ngày) CCC (cm) B/K (cây) HC/B (hạt) HL/B (hạt) TS (hạt) KL 1000 hạt (g) NSLT (tạ/ha) NSTT (tạ/ha) 1 KD18 137 97,0 6,0 132,0 23 155,0 19,7 85,8 57,9 2 NPT1 141 109,3 4,6 183,0 34 217,0 22,8 105,6 73,3 CV % 6,4 8,8 6,7 - 8,6 LSD 0.05 10,0 0,8 2,4 - 8,1 Ghi chú: TGST: Thời gian sinh trưởng; CCC: Chiều cao cây; B/K: Số bông trên khóm; HC/B: Số hạt chắc trên bông; HL/B: Số hạt lép trên bông; TS: Tổng số hạt; KL 1000 : Khối lượng 1000 hạt; NSLT: Năng suất lý thuyết; NSTT: Năng suất thực thu. 62 Kết quả đánh giá các đặc điểm sinh trƣởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất cho thấy, Khang dân 18 và dòng NPT1 có tiềm năng năng suất khá, năng suất thực thu lần lƣợt đạt 57,9 tạ/ha và 73,3 tạ/ha. Hơn nữa, hai dòng/giống này có khả năng kháng sâu bệnh khá và khả năng chống đổ tốt. Khang dân 18 là giống lúa thuần đƣợc nhập nội từ Trung Quốc vào nƣớc ta từ những năm 90 của thế kỷ trƣớc. Theo kết quả điều tra, rà soát giống lúa toàn quốc năm 2015 của tác giả Trần Xuân Định, Khang dân 18 là một trong 10 giống lúa tẻ chủ lực, từng nhiều năm liền đứng đầu cả nƣớc về diện tích gieo trồng, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc (khoảng 600.000 ha/năm) [5]. Do vậy, dựa trên tính phổ biến, tính thích ứng, tính ổn định và năng suất, giống Khang dân 18 và dòng NPT1 là hai dòng/giống dùng làm dòng/giống nhận gen trong nghiên cứu của đề tài luận án. Nhƣ vậy, việc xác định vật liệu sử dụng trong nghiên cứu cải tiến năng suất lúa đã chọn lựa đƣợc dòng KC25 làm dòng cho QTL/gen và 02 dòng/giống làm dòng nhận QTL/gen bao gồm: Khang dân 18 và NPT1 . 3.2. Sử dụng chỉ thị phân tử khảo sát đa hình ADN giữa dòng/giống cho và nhận QTL/gen tăng số hạt trên bông trên các nhiễm sắc thể 3.2.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông giữa dòng/giống cho và nhận QTL/gen Đa hình giữa hai giống lúa có thể phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại đƣợc khuếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng chỉ thị phân tử nhằm phát hiện sự có mặt của gen cần chuyển trong các cá thể con lai. Dựa vào kết quả xác định và lập bản đồ chi tiết của tác giả Balkunde và cộng sự, Linh và cộng sự (2008, 2013) [27], [64], các chỉ thị phân tử liên kết với gen tăng số hạt trên bông yd7 đã đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, 6 chỉ thị phân tử trên NST số 7 đƣợc khảo sát nhằm xác định chỉ thị đa hình giữa dòng KC25 và giống Khang dân 18, NPT1, từ đó có thể sử dụng để phát hiện QTL/gen yd7 trong các cá thể con lai. 63 Kết quả khảo sát đã xác định đƣợc 3 chỉ thị cho đa hình là các chỉ thị RM445, RM500 và RM21615. Kết quả đƣợc thể hiện chi tiết qua hình 3.1, hình 3.2 dƣới đây. Hình 3.1: Vị trí QTL/gen yd7 trên NST số 7 [27] Hình 3.2: Kết quả khảo sát đa hình ADN giữa giống cho và nhận QTL/gen với chỉ thị RM445; RM500; RM21615 L: Ladder 50bp; 1: Khang dân 18; 2: NPT1; 3: KC25 Kết quả điện di ở hình 3.2 cho thấy, băng điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM445, RM500 của dòng KC25 (băng số 3) đều cao hơn băng điện di sản phẩm PCR của dòng NPT1 và Khang dân 18 (băng số 2, băng số 1). Ngƣợc lại, với chỉ thị RM21615, băng điện di sản phẩm PCR của dòng KC25 (băng số 3) thấp hơn băng điện di sản phẩm PCR của dòng NPT1 và giống Khang dân 18 (băng số 2, băng số 1). Điều này đã thể hiện sự đa hình ADN giữa các giống cho và nhận gen. Nhƣ vậy, qua kết quả khảo sát đa hình ADN giữa giống cho và giống nhận QTL/gen, chúng tôi đã xác định đƣợc 3 chỉ thị cho đa hình tại vị trí QTL/gen quy 64 định tính trạng tăng số hạt trên bông gồm: RM445, RM500 và RM21615. Trong đó chỉ thị RM445 nằm trên vùng QTL/gen yd7 tại vị trí 17,46 Mb, chỉ thị RM500 và RM21615 là chỉ thị cận biên nằm về 2 phía QTL/gen, ở vị trí lần lƣợt 15,91 Mb, 18,25 Mb. 3.2.2. Kết quả khảo sát đa hình trên 12 NST giữa dòng/giống cho và nhận QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông Nhận dạng đa hình ADN giữa các giống cho gen và nhận gen với các chỉ thị SSR trên 12 NST nhằm phục vụ chọn lọc nền di truyền các cá thể con lai. Với mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng xác định nền di truyền trong các cá thể con lai, các phản ứng PCR đƣợc tiến hành. Tổng số 156 chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST (phụ lục 6) đƣợc sàng lọc để khảo sát đa hình giữa dòng/giống cho và nhận QTL/gen. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các chỉ thị khảo sát đa hình trên 12 NST đƣợc thể hiện trong phụ lục 2 và một vài hình ảnh dƣới đây. Hình 3.3: Kết quả khảo sát đa hình ADN giữa giống cho và nhận QTL/gen với chỉ thị RM1208; RM5365; RM5480 L: Ladder 50bp; 1: Khang dân 18; 2: NPT1; 3: KC25 Hình 3.4: Kết quả khảo sát đa hình ADN giữa giống cho và nhận QTL/gen với chỉ thị RM10916; RM24865; RM331 L: Ladder 50bp; 1: Khang dân 18; 2: NPT1; 3: KC25 65 Hình 3.5: Kết quả khảo sát đa hình ADN giữa giống cho và nhận QTL/gen với chỉ thị RM3; RM528; RM22825 L: Ladder 50bp; 1: Khang dân 18; 2: NPT1; 3: KC25 Kết quả điện di khảo sát đa hình ADN thể hiện qua hình 3.3 cho thấy sản phẩm PCR với 3 chỉ thị RM1208, RM5365 và RM5480 của dòng KC25 (băng số 3) xuất hiện băng ADN cao hơn băng ADN của giống Khang dân 18 và dòng NPT1 (băng số 1 và băng số 2). Nhƣ vậy, sự chênh lệch về vị trí các băng ADN thu đƣợc ở các đƣờng chạy số 1, số 2 với đƣờng chạy số 3 thể hiện đa hình giữa các dòng/cho và nhận gen. Kết quả tƣơng tự thể hiện qua các hình 3. 4 và 3.5. Bảng 3.4: Thống kê các chỉ thị SSR đa hình giữa Khang dân 18/KC25 NST Tên chỉ thị phân tử cho đa hình Số lƣợng 1 RM10115, RM10136, RM10694, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM493, RM5365, RM7075. 15 2 RM526, RM5356, RM6, RM7355. 4 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480, RM7389. 7 4 RM16589, RM16820, RM280, RM3333, RM349, RM551. 6 5 RM19199; RM31, RM7027. 3 6 RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434. 6 7 RM11, RM21539, RM21769, RM248, RM7338. 5 8 RM22825, RM331, RM447. 3 9 RM296, RM7175. 2 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628. 4 11 RM7283, RM206, RM341. 3 12 RM1194, RM247, RM7102, RM1208. 4 Tổng 62 66 Bảng 3.5: Thống kê các chỉ thị SSR đa hình giữa dòng NPT1/KC25 NST Chỉ thị phân tử cho đa hình Số lƣợng 1 RM10115, RM10136, RM10694, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM5365, RM7075 14 2 RM1243, RM526, RM5356, RM6, RM7355 5 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3654, RM5480, RM7389 6 4 RM16589, RM16820, RM280, RM3333, RM349, RM551 6 5 RM19199; RM31 2 6 RM19238, RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434 7 7 RM11, RM21539, RM21769, RM248, RM7338 5 8 RM22825, RM331, RM447 3 9 RM1026, RM296, RM7175 3 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628 4 11 RM3137, RM7283, RM206, RM341 4 12 RM1194, RM247, RM7102, RM1208. 4 Tổng 63 Nhƣ vậy, qua sàng lọc và phân tích kết quả điện di các chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST giữa giống cho và nhận QTL/gen thu đƣợc 62/156 chỉ thị cho đa hình giữa dòng KC25 và giống Khang dân 18, chiếm tỷ lệ 39,7%; 63/156 chỉ thị cho đa hình giữa dòng NPT1 với KC25, chiếm tỷ lệ 40,3%. Có thể lý giải rằng, Khang dân 18 và NPT1 là dòng lúa Indica, trong khi KC25 là dòng Japonica, vì vậy việc khảo sát đa hình bằng các chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST sẽ cho tỷ lệ đa hình cao. Trong nghiên cứu cải tiến tính chịu ngập, Tạ Hồng Lĩnh và cộng sự đã tiến hành khảo sát đa hình giữa giống Bắc thơm 7 và IR64-Sub1, tuy nhiên cả 2 giống này đều là dòng Indica, do đó số lƣợng chỉ thị cho kết quả đa hình chỉ chiếm tỷ lệ 15,3% [12]. Các chỉ thị cho đa hình (thể hiện qua hình 3.6 và hình 3.7) giữa dòng/giống cho và nhận QTL/gen trên 12 NST sẽ đƣợc sử dụng để xác định nền di truyền của các cá thể con lai trong các thí nghiệm tiếp theo. 67 Hình 3.6: Bản đồ các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống Khang dân 18 và KC25 trên 12 NST Ghi chú: Thứ tự chỉ thị phân tử được thể hiện bên trái NST, vị trí của chỉ thị được thể hiện phía bên phải NST. Thứ tự và vị trí chỉ thị được xây dựng dựa trên bản đồ Nipponbare (TIGR v.3 pseudomolecules availabe at www.gramene.org and at sliver.plbr.cornell.edu/SSR) 68 Hình 3.7: Bản đồ các chỉ thị phân tử đa hình giữa dòng NPT1 và KC25 trên 12 NST Ghi chú: Thứ tự chỉ thị phân tử được thể hiện bên trái NST, vị trí của chỉ thị được thể hiện phía bên phải NST. Thứ tự và vị trí chỉ thị được xây dựng dựa trên bản đồ Nipponbare (TIGR v.3 pseudomolecules availabe at www.gramene.org and at sliver.plbr.cornell.edu/SSR) 69 3.3. Cải tiến năng suất giống lúa trồng đại trà cho đồng bằng sông Hồng và dòng NPT1 (dạng hình mới) triển vọng bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại 3.3.1. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể con lai của tổ hợp lai Khang dân 18/KC25 3.3.1.1. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC1F1 Sau khi khử bao phấn giống nhận QTL/gen Khang dân 18, tiến hành bao các cây mẹ với cây bố KC25 bằng bao lai. Các hạt lai F1 đƣợc gieo trồng, chăm sóc, đánh giá đặc điểm sinh trƣởng phát triển. Mƣời lăm cá thể F1 đƣợc gieo trồng, chăm sóc, sau đó chọn 5 cá thể sinh trƣởng phát triển tốt, có kiểu cây đẹp, mang kiểu hình tăng số hạt trên bông để lai tạo thế hệ BC1F1. Kết quả chúng tôi đã phát triển đƣợc 367 hạt lai. Các hạt lai thế hệ BC1F1 đƣợc gieo trồng, chăm sóc và thu mẫu lá (312 mẫu) khi cây đƣợc 3 tuần tuổi. Các mẫu lá đƣợc tách chiết ADN theo phƣơng pháp CTAB cải tiến [77] và kiểm tra đô ̣tinh sac̣h đ ể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Để xác định những cá thể mang QTL/gen yd7 thế hệ BC1F1, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị RM445 và RM500. Kết quả chạy điện di đƣợc thể hiện trong hình 3.8; hình 3.9. Hình 3.8: Kết quả điện di trên 312 cá thể BC1F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM445 1-312: Các cá thể BC1F1; M: KD18; B: KC25; L: Ladder 50bp 70 Qua hình 3.8, kết quả sàng lọc với chỉ thị RM445 chọn lọc các cá thể con lai BC1F1 mang kiểu gen dị hợp tử (giống bố mẹ KC25 và Khang dân 18) là các cá thể mang QTL/gen yd7. Chúng tôi đã thu đƣợc 84/312 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử gồm các cá thể số: 20, 22, 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 42, 43, 44, 48, 50, 53, 57, 59, 63, 66, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 79, 81, 82, 86, 88, 89, 91, 94, 96, 103, 105, 109, 112, 115, 119, 125, 126, 127, 130, 132, 140, 145, 147, 150, 153, 154, 158, 161, 163, 164, 167, 172, 175, 177, 179, 184, 193, 195, 200, 204, 209, 210, 211, 212, 219, 222, 227, 236, 245, 246, 295, 296, 297 và 304. Tám tƣ cá thể BC1F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 đƣợc đánh số thứ tự từ 1-84 và tiếp tục sàng lọc với chỉ thị phân tử RM500. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.9. Hình 3.9: Kết quả điện di của 84 cá thể BC1F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM500 1-84: Các cá thể BC1F1; M: KD18; B: KC25; L: Ladder 50bp Kết quả thể hiện ở hình 3.9 cho thấy: Có 32/84 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử gồm các cá thể có số thứ tự số: 57, 63, 72, 73, 74, 77, 79, 82, 86, 88, 89, 91, 103, 109, 112, 115, 127, 140, 153, 163, 172, 175, 184, 195, 210, 212, 222, 227, 236, 245, 295 và 297 (tính theo số thứ tự của 312 cá thể). Cá thể con lai BC1F1 dị hợp tử ở cả 2 vị trí chỉ thị RM445 và chỉ thị RM500 đủ điều kiện đƣợc chọn kiểm tra nền di truyền với các chỉ thị đa hình trải đều trên 12NST. 3.3.1.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc nền di truyền của các cá thể mang QTL/gen trong quần thể BC1F1 Nhƣ đã đề cập ở trên, thế hệ BC1F1 đã chọn lọc đƣợc 32 cá thể mang QTL/gen yd7, 71 các cá thể này đƣợc lựa chọn để đánh giá nền di truyền nhằm mục đích xác định đƣợc ít nhất 1 cá thể có nền di truyền giống cây mẹ cao nhất. Trong nội dung này, 62 chỉ thị SSR đa hình trải đều trên 12 NST đƣợc sử dụng. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.10 dƣới đây. Hình 3.10: Kết quả điện di xác định nền di truyền của 32 cá thể mang QTL/gen yd7 trong quần thể BC1F1 (tổ hợp KD18/KC25) L:50bp ladder; M: KD18; B: KC25; 1-32: Các cá thể BC1F1 Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích bằng phần mềm Graphical Genotypes 2 để lựa chọn những cá thể trong quần thể BC1F1 mang QTL/gen yd7 và có nền di truyền giống mẹ nhất. Kết quả thể hiện qua hình 3.11 và bảng 3.6. Qua kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.11 ta thấy, ở quần thể BC1F1 các con lai có nền di truyền giống nhận gen ở các mức khác nhau dao động từ 60 đến hơn 80%. Số cá thể có nền di truyền giống cây nhận gen ở mức 60-65% và 70-80% chiếm tỉ lệ lần lƣợt xấp xỉ 12,5% và 18,7%, mức70-75% có tỉ lệ cao nhất tƣơng đƣơng 50%, trong khi nhóm cá thể có nền di truyền giống cây nhận gen hơn 80% chiếm tỉ lệ 6,2%. Qua phân tích bằng phần mềm GGT2 trong phân tích nền di truyền, đã xác định đƣợc cá thể số 74 có nền di truyền cao nhất giống mẹ đạt 83,4%, tiếp theo là cá 72 thể số 109 với 80,2%. Hình 3.12 thể hiện nền di truyền cá thể số 74. Bảng 3.6: Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 32 cá thể BC1F1 mang QTL/gen TT Cá thể số A (%) B (%) H (%) U(%) 1 57 74,8 7,8 17,4 0 2 63 67,9 10,3 21,8 0 3 72 70,4 9,3 20,0 0,3 4 73 77,9 6,4 15,6 0 5 74 83,4 4,9 11,7 0 6 77 71,4 6,7 21,5 0,4 7 79 71,0 10,4 18,6 0 8 82 67,9 20,7 11,4 0 9 86 70,8 6,2 23,0 0 10 88 62,2 6,8 31,0 0 11 89 70,1 15,2 14,7 0 12 91 72,0 13,3 14,7 0 13 103 72,8 6,2 20,9 0 14 109 80,2 7,9 11,9 0 15 112 67,1 11,8 21,0 0 16 115 66,7 15,0 18,3 0 17 127 69,2 10,0 20,2 0 18 140 74,9 12,5 11,5 1 19 153 73,3 5,1 20,7 1 20 163 74,4 8,4 17,2 0 21 172 78,6 13,4 8,0 0 22 175 70,2 1,4 28,4 0 23 184 75,9 8,6 15,5 0 24 195 74,7 4,3 21,0 0 25 210 63,7 4,4 32,0 0 26 212 61,5 7,8 30,7 0 27 222 68,8 5,4 25,8 0 28 227 75,8 16,3 7,9 0 29 236 70,6 14,4 15,0 0 30 245 79,8 4,1 15,7 0,4 31 295 71,5 15,3 12,8 0,4 32 297 70,3 5,1 24,4 0,2 Ghi chú: A%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KD18; B%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KC25; H%: Phần trăm cá thể dị hợp tử; U%: Phần trăm cá thể có mẫu không biểu hiện. 73 Hình 3.11: Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ ở thế hệ BC1F1 (tổ hợp KD18/KC25) Hình 3.12: Bản đồ di truyền của cá thể số 74 thế hệ BC1F1 tổ hợp KD18/KC25 A: Đồng hợp tử với Khang dân 18; B: Đồng hợp tử với KC25; H: Dị hợp tử; U: Mẫu không biểu hiện 0 5 10 15 20 60%-65% 65%-70% 70%-75% 75%-80% >80% Số c á th ể Tỷ lệ % nền di truyền giống mẹ 74 3.3.1.3. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC2F1 Do 2 cá thể số 74 và 109 mang QTL/gen yd7 tăng số hạt trên bông và có nền di truyền gần nhất với cây nhận gen, sinh trƣởng và phát triển tốt nên chúng tôi chỉ sử dụng 02 cá thể này lai trở lại với Khang dân 18 tạo quần thể BC2F1. Kết quả thu đƣơc̣ 210 hạt lai (trong đó cá thể số 74 thu đƣợc 112 hạt và cá thể số 109 thu đƣợc 98 hạt). Tiếp tuc̣ gieo trồng nhƣ thế hê ̣trƣớc để taọ ra cây lai BC2F1. Sau khi cây lúa đƣơc̣ khoảng 20 ngày tuổi tiến hành thu mẫu lá của các cá thể (cây lai có nguồn gốc từ cá thể số 74 đƣợc đánh số từ 1 - 67, cây có nguồn từ cá thể số 109 đƣợc đánh số từ 68 - 117) tách chiết, kiểm tra chất lƣơṇg ADN. Trong nghiên cứu này, 03 chỉ thị liên kết chặt với QTL/gen yd7 gồm chỉ thị RM445 nằm trên vùng gen và chỉ thi ̣ RM 500, RM21615 là 2 chỉ thị cận biên (franking markers) để sàng lọc các cá thể di ̣ hơp̣ tƣ̉ . Một số hình ảnh sàng lọc đƣợc minh hoạ trong hình 3.13 đến hình 3.15. Hình 3.13: Kết quả điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM445 L: 50bp ladder; M: KD18; B: KC25; 1-117: Các cá thể BC2F1 Kết quả thể hiện qua hình 3.13 cho thấy: Sàng lọc với chỉ thị RM445 đã xác định đƣợc 61/117 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 gồm các cá thể số: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 75 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 38, 42, 43, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 70, 71, 74, 77, 84, 85, 86, 87, 88, 97, 101 và cá thể số 111. Sáu mƣơi mốt cá thể BC2F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 đƣợc đánh số thứ tự từ 1-61 và tiếp tục sàng lọc với chỉ thị RM500 và RM21615. Hai chỉ thị này là hai chỉ thị cận biện nằm chặn 2 đầu của QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt/bông. Kết quả kiểm tra cá thể lai BC2F1 đối với chỉ thị phân tử RM500 và RM21615 đƣợc minh họa trong hình 3.14 và hình 3.15 dƣới đây. Hình 3.14: Kết quả điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM500 L: 50bp ladder; M: KD18; B: KC25; A: Đồng hợp tử; H: Dị hợp tử; 1-61: Cá thể trong quần thể BC2F1 Kết quả thể hiện ở hình 3.14 cho thấy: Có 25/61 cá thể dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM500 gồm các cá thể trên đƣờng chạy số: 3, 8, 12, 14, 17, 18, 22, 23, 28, 32, 35, 37, 39, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 55, 56, 58,59 và 60 tƣơng ứng với ADN của cá thể số: 3, 8, 12, 14, 17, 18, 22, 23, 28, 32, 35, 42, 50, 56, 57, 59, 60, 61, 69, 70, 85, 86, 88, 97 và cá thể số 101. Hình 3.15 cho thấy, xác định đƣợc 26/61 cá thể dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM21615 gồm các cá thể trên đƣờng chạy số: 2, 7, 8, 9, 13, 18, 22, 30, 32, 34, 35, 37, 42, 45, 46, 47, 48, 50, 52, 53, 56, 57, 58, 59, 60, 61 tƣơng ứng với cá thể số: 2, 76 7, 8, 9, 13, 18, 22, 30, 32, 34, 35, 42, 56, 59, 60, 61, 62, 70, 74, 77, 86, 87, 88, 97, 101 và cá thể số 111. Hình 3.15: Kết quả điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM21615 L: 50bp ladder; M: KD18; B: KC25; A: Đồng hợp tử; H: Dị hợp tử; 1-61: Các cá thể BC2F1 Nhƣ vậy, việc kết hợp sử dụng hai chỉ thị RM500 và RM21615 đã chọn lọc đƣợc 15 cá thể lai BC2F1 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông gồm các cá thể số: 8, 18, 22, 32, 35, 42, 56, 59, 60, 61, 70, 86, 88, 97 và 101. 3.3.1.4. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc nền di truyền của các cá thể mang QTL/gen trong quần thể BC2F1 Mƣời lăm cá thể con lai BC2F1 mang QTL/gen đủ điều kiện lựa chọn, sàng lọc, kiểm tra nền di truyền với 62/65 chỉ thị đa hình trải đều trên 12 NST. Tƣơng tự nhƣ các bƣớc thí nghiệm đã đề cập ở trên, số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình phần mềm GGT2 để sàng lọc và lựa chọn cá thể trong quần thể BC2F1 mang QTL/gen yd7 tăng số hạt trên bông có nền di truyền cao nhất với hệ gen của cây nhận gen. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.16; hình 3.17. 77 Hình 3.16: Kết quả điện di sàng lọc nền di truyền của 15 cá thể mang QTL/gen yd7 trong quần thể BC2F1 (tổ hợp KD18/KC25) L: Ladder 50bp; M: KD18;B: KC25; điểm H: Dị hợp tử; điểm A: Đồng hợp tử với KD18; điểm B: Đồng hợp tử với KC25 Bảng 3.7: Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 15 cá thể BC2F1 mang QTL/gen TT Cá thể A (%) B (%) H (%) U(%) 1 8 85,6 8,1 6,2 0 2 18 75,8 3,2 21,0 0 3 22 91,7 3,6 4,7 0 4 32 91,5 3,3 5,2 0 5 35 87,1 2,1 10,8 0 6 42 86,9 3,2 9,9 0 7 56 84,2 5,8 10,0 0 8 59 92,3 2,6 5,1 0 9 60 87,3 1,7 11,0 0 10 61 91,8 2,1 6,1 0 11 70 88,9 6,1 5,0 0 12 86 88,6 6,3 5,1 0 13 88 85,4 3,2 11,3 0 14 97 83,9 5,1 10,8 0,2 15 101 88,3 3,2 8,4 0 Ghi chú: A%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KD18; B%: Phần trăm cá thể đồng hợp tử với KC25; H%: Phần trăm cá thể dị hợp tử; U%: Phần trăm cá thể có mẫu không biểu hiện. 78 Hình 3.17: Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ ở thế hệ BC2F1(tổ hợp KD18/KC25) Hình 3.18: Bản đồ di truyền của cá thể số 59 thế hệ BC2F1 tổ hợp KD18/KC25 A: Đồng hợp tử với Khang dân 18; B: Đồng hợp tử với KC25;H: Dị hợp tử; U: Mẫu không biểu hiện 0 1 2 3 4 5 6 7 8 75%-80% 80%-85% 85%-90% 90%-95% S ố c á t h ể Tỷ lệ % nền di truyền giống mẹ 79 Trong nghiên cứu này, qua phân tích đánh giá nền di truyền, cá thể số 61 và cá thể số 59 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông (yd7) đƣợc xác định có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen đạt 91,8% và 92,3% (thể hiện qua hình 3.18). Hai cá thể này có nguồn gốc từ cá thể số 74 của thế hệ BC1F1 nên chúng tôi ký hiệu là C1-74-59 và C1-74-61. 3.3.1.5. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể trong quần thể BC3F1 Quần thể BC3F1 đƣợc tạo thành từ cá thể có nền di truyền cao nhất số C1-74- 61 và C1-74-59 ở quần thể BC2F1 lai trở lại với Khang dân 18 thu đƣợc 373 hạt lai. Toàn bộ hạt lai BC3F1 đƣợc gieo trồng, chăm sóc và thu mẫu lá lúa khi cây đƣợc 20 ngày tuổi, tiến hành tách chiết và tinh sạch ADN, sàng lọc với ba chỉ thị liên kết chặt với QTL/gen yd7 tăng số hạt trên bông bao gồm RM445, RM500 và RM21615 mục đích chọn lọc đƣợc những cá thể mang QTL/gen. Một số kết quả điện di sản phẩm PCR của quần BC3F1 với chỉ thị RM445 đƣợc thể hiện trong hình 3.19. Hình 3.19: Kết quả điện di các cá thể BC3F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM445 1-97: Các cá thể BC3F1; M: Khang dân 18; B: KC25; L: Ladder 50bp Kết quả thể hiện trong hình 3.19 cho thấy: xác định đƣợc 50 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử gồm các cá thể số: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, 80 21, 22, 24, 25, 28, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 41, 43, 46, 48, 51, 53, 57, 59, 61, 67, 69, 70, 73, 74, 76, 77, 79, 82, 85, 87, 90, 92, 93, 94 và 95. Năm mƣơi cá thể BC3F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 tiếp tục đƣợc sàng lọc bằng chỉ thị RM500. Chỉ thị này nằm chặn đầu phía trên của QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt trên bông. Kết quả kiểm tra các cá thể lai BC3F1 đối với chỉ thị RM500 đƣợc thể hiện trong hình 3.20. Hình 3.20: Kết quả điện di các cá thể BC3F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM500 1-95: Các cá thể BC3F1; M: Khang dân 18; B: KC25; L: Ladder 50bp Kết quả thể hiện trong hình 3.20 cho thấy, có 24/50 cá thể dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM500 gồm cá thể số: 1, 5, 6, 7, 9, 10, 14, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 46, 48, 61, 67, 70, 74, 79 và cá thể số 95. Tiếp tục sàng lọc năm mƣơi cá thể BC3F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị RM445 bằng chỉ thị RM21615. Chỉ thị này nằm chặn đầu phía dƣới của QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt trên bông. Kết quả các cá thể lai BC3F1 đối với chỉ thị RM21615 đƣợc thể hiện qua hình 3.21. Kết quả sàng lọc các cá thể lai BC3F1 bằng chỉ thị RM21615 thể hiện qua hình 3.21 nhận thấy, có 28/50 cá thể dị hợp tử bao gồm các cá thể số 1, 5, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 41, 43, 46, 48, 61, 67, 70, 73, 74, 79 và cá thể số 95. 81 Hình 3.21: Kết quả điện di các cá thể BC3F1 (tổ hợp KD18/KC25) với chỉ thị RM21615 1-95: Các cá thể BC3F1; M: Khang dân 18; B: KC25; L: Ladder 50bp Nhƣ vậy, kết hợp kết quả sàng lọc của chỉ thị RM500 và RM21615, 24 cá thể dị hợp tử là những cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông bao gồm các cá thể: 1, 5, 6, 7, 9, 10, 14, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 46, 48, 61, 67, 70, 74, 79 và 95. 3.3.1.6. Kết quả chọn lọc nền di truyền của các cá thể lai BC3F1 của tổ hợp Khang dân 18/KC25 Để chọn lọc những cá thể có nền di truyền giống mẹ cao nhất, các chỉ thị đa hình trải đều trên 12 NST tiếp tục đƣợc sử dụng. Trong nội dung này, 24 cá thể BC3F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông đƣợc sàng lọc đánh giá nền di truyền. Kết quả thể hiện ở một số hình ảnh điện di trong hình 3.22. Kết quả đánh giá 24 cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông với 62/65 chỉ thị đa hình trải đều trên 12 NST, số liệu đƣợc xử lý bằng chƣơng trình phần mềm Graphical Genotypes